馬文宇，吳鄧婷

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·論著·

枸杞多糖對人惡性黑素瘤A375細胞黏附與侵襲的影響研究

馬文宇，吳鄧婷

810001青海省西寧市，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科(馬文宇)；青海大學(xué)研究生院臨床醫(yī)學(xué)(吳鄧婷)

【摘要】目的觀察枸杞多糖對人惡性黑素瘤A375細胞黏附與侵襲的影響。方法2013年5月—2015年12月，采用體外實驗?zāi)Ｐ团囵B(yǎng)黑素瘤A375細胞，取對數(shù)生長期A375細胞，分別采用0、5、10、15 g/L濃度的枸杞多糖處理A375細胞，進行細胞黏附實驗、細胞劃痕實驗以及細胞侵襲實驗。觀察不同濃度枸杞多糖對A375細胞黏附、遷移及侵襲的影響。結(jié)果不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后，A375細胞OD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖組A375細胞OD值均低于0 g/L枸杞多糖組(P<0.05)。5、10、15 g/L枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后，A375細胞黏附抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞24 h后，其與對應(yīng)組0 h時劃痕寬度比較，均變窄；且24 h時，5、10、15 g/L枸杞多糖組劃痕寬度均寬于0 g/L枸杞多糖組。不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后，侵襲細胞數(shù)、侵襲力抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖組侵襲細胞數(shù)少于0 g/L枸杞多糖組，10、15 g/L枸杞多糖組侵襲細胞數(shù)少于5 g/L枸杞多糖組，侵襲力抑制率高于5 g/L枸杞多糖組(P<0.05)。結(jié)論枸杞多糖能在一定程度上抑制人惡性黑素瘤A375細胞的黏附、遷移和侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】黑色素瘤；枸杞；細胞黏附；細胞運動；侵襲

馬文宇，吳鄧婷.枸杞多糖對人惡性黑素瘤A375細胞黏附與侵襲的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(17)：2028-2032.[www.chinagp.net]

Ma WY，Wu DT.Effect of lycium barbarum polysaccharide on the adhesion and invasion of human malignant melanoma cells A375[J].Chinese General Practice，2016，19(17)：2028-2032.

惡性黑素瘤(malignant melanoma)好發(fā)于皮膚及黏膜，是一種相對常見的皮膚惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，繼鱗狀細胞癌、基底細胞癌之后，惡性黑素瘤居皮膚惡性腫瘤的第三位[1]。惡性黑素瘤惡性程度高，發(fā)生轉(zhuǎn)移早，目前沒有比較有效的治療辦法，因此針對其侵襲轉(zhuǎn)移過程的研究有較大的意義。枸杞多糖是來源于中藥植物枸杞的主要成分，具有多種生物活性[2]。其抗腫瘤作用的研究日益增多，但其對惡性黑素瘤侵襲力影響的相關(guān)研究鮮見報道。故本研究主要探討枸杞多糖是否具有抑制人惡性黑素瘤A375細胞黏附、遷移和侵襲能力的作用，以期為其治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料枸杞多糖為青海省柴達木盆地的諾木洪紅枸杞提取的精制多糖，人惡性黑素瘤A375細胞購自南京市凱基生物有限公司的原代細胞，血清為GIBCO澳洲胎牛血清，高糖DMEM培養(yǎng)基購于北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購于BD公司，CCK-8試劑購于日本同仁研究所，96孔板、24孔板、6孔板、8 μm型Transwell小室購于Corning公司，HE染液購于Solarbio公司。相關(guān)儀器設(shè)備由青海省高原實驗中心提供。

1.2方法

1.2.1A375細胞的培養(yǎng)2013年5月—2015年12月，根據(jù)南京市凱基生物有限公司提供的A375細胞培養(yǎng)說明書，使用含10%胎牛血清、pH值為7.4的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)A375細胞。根據(jù)細胞生長狀態(tài)在超凈工作臺內(nèi)進行換液、消化傳代、凍存等操作。

1.2.2細胞黏附實驗取對數(shù)生長期A375細胞，使用胰酶進行消化后，制成2.5×105個/ml細胞懸液。在6孔板進行實驗鋪板，每孔注入2 ml細胞懸液，將鋪好的細胞板置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后棄舊培養(yǎng)基，更換為2 ml的枸杞多糖培養(yǎng)基，濃度分別為0、5、10、15 g/L，在培養(yǎng)箱中孵育48 h后，使用胰酶消化各濃度組的細胞，計數(shù)后每組均制成3×105個/ml細胞懸液備用。于冰上在96孔板取3×4個孔，每孔鋪Matrigel基質(zhì)膠(按照說明書與無血清DMEM培養(yǎng)液以1∶3稀釋)35 μl，置超凈臺內(nèi)室溫風(fēng)干后，用2%BSA 20 μl進行封阻，于37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h。每組選3個鋪膠孔，注入對應(yīng)組的細胞懸液100 μl，將鋪好細胞的96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。1 h后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去未黏附細胞，每孔加入90 μl無血清DMEM培養(yǎng)液和10 μl CCK-8試劑后再孵育4 h，上酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度(OD值)。細胞黏附抑制率=(對照組OD值-處理組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2.3細胞劃痕實驗用Marker筆在6孔板背后橫向畫3條間距0.7 cm的平行直線，備用。取對數(shù)生長期A375細胞，每孔以3×105個/ml的細胞懸液2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后細胞匯合率達90%以上，用200 μl槍頭比著直尺在6孔板正中垂直于背后橫線做劃痕，輕吸棄去舊培養(yǎng)基，PBS輕輕洗2遍去除劃下的細胞后，加入濃度分別為0、5、10、15 g/L枸杞多糖培養(yǎng)基(含血清1%，0.22 μm孔徑的過濾器過濾)，立即于倒置顯微鏡下以劃痕和橫線相交的上下兩處為監(jiān)測點進行拍照，記作0 h時的結(jié)果。然后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再進行各個監(jiān)測點的拍照記作24 h時的結(jié)果。

1.2.4細胞侵襲實驗Transwell小室底部為8 μm孔徑聚碳酸酯濾膜，預(yù)先每個小室均勻鋪上Matrigel基質(zhì)膠(按照說明書與無血清DMEM培養(yǎng)液以1∶3稀釋)50 μl，將小室置于24孔板內(nèi)，放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，小室底部Matrigel基質(zhì)膠凝固。收集各濃度(0、5、10、15 g/L)枸杞多糖干預(yù)24 h后的A375細胞，再以含對應(yīng)濃度的無血清枸杞多糖培養(yǎng)基制成2.5×105個/ml細胞懸液，取200 μl移入小室。然后將小室輕輕放入(以防產(chǎn)生氣泡)加有500 μl含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基的24孔板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h后取出24孔板，以棉簽小心擦除干凈各小室濾膜上室面的細胞，吸凈24孔板內(nèi)培養(yǎng)液，均用PBS輕輕洗2遍。以4%多聚甲醛溶液固定小室下室面和24孔板內(nèi)的細胞20 min，常規(guī)HE染色后晾干，將小室底面置于載玻片上使用倒置顯微鏡觀察拍照。在400倍高倍鏡下計數(shù)細胞，各濃度重復(fù)3孔，孔或膜隨機6個視野，取平均值作為結(jié)果。侵襲細胞數(shù)=各下室面黏附的細胞數(shù)+相應(yīng)24孔板黏附的細胞數(shù)，侵襲力抑制率=(對照組侵襲細胞數(shù)-處理組侵襲細胞數(shù))/對照組侵襲細胞數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1不同濃度枸杞多糖組對A375細胞黏附力的影響不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后，A375細胞OD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖組A375細胞OD值均低于0 g/L枸杞多糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后，A375細胞黏附抑制率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

Table 1Comparison of OD value and cell adhesion inhibition rate of A375 cells treated with different concentrations of LBP after 48 h

組別OD值細胞黏附抑制率(%)0g/L枸杞多糖組1.13±0.08-5g/L枸杞多糖組0.91±0.14a20.3±6.710g/L枸杞多糖組0.88±0.10a22.2±4.615g/L枸杞多糖組0.81±0.12a29.1±6.3F值4.7181.786P值0.0350.246

注：與0 g/L枸杞多糖組比較，aP<0.05；OD值=吸光度；-為無此數(shù)值

2.2不同濃度枸杞多糖組對A375細胞遷移的影響不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞24 h后，其與對應(yīng)組0 h時劃痕寬度比較，均變窄；且24 h時，5、10、15 g/L枸杞多糖組劃痕寬度均寬于0 g/L枸杞多糖組(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

2.3不同濃度枸杞多糖組對A375細胞侵襲力的影響不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后，其侵襲細胞數(shù)、侵襲力抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中5、10、15 g/L枸杞多糖組侵襲細胞數(shù)少于0 g/L枸杞多糖組，10、15 g/L枸杞多糖組侵襲細胞數(shù)少于5 g/L枸杞多糖組，侵襲力抑制率高于5 g/L枸杞多糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖2)。

Table 2Comparison of the number of invasion cells and invasiveness inhibition rate among A375 cells treated with different concentrations of LBP after 48 h

組別侵襲細胞數(shù)(個)侵襲力抑制率(%)0g/L枸杞多糖組66±10-5g/L枸杞多糖組42±9a36.9±3.810g/L枸杞多糖組28±4ab55.8±10.9b15g/L枸杞多糖組22±3ab65.7±8.2bF值23.5859.661P值<0.0100.013

注：與0 g/L枸杞多糖組比較，aP<0.05；與5 g/L枸杞多糖組比較，bP<0.05；-為無此數(shù)值

圖1　不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞24 h時劃痕實驗結(jié)果

圖2　不同濃度枸杞多糖組干預(yù)A375細胞48 h后Transwell小室侵襲實驗結(jié)果(HE染色，×400)

3討論

惡性黑素瘤是一種具有極強侵襲轉(zhuǎn)移能力的黑色素細胞惡性腫瘤疾病，好發(fā)于富含黑色素細胞的皮膚及黏膜部位。據(jù)不完全的研究項目統(tǒng)計，惡性黑素瘤發(fā)病率占全部惡性腫瘤的1%～2%，成為繼鱗狀細胞癌、基底細胞癌之后的常見皮膚惡性腫瘤[3-4]。惡性黑素瘤為增長速率較快的惡性腫瘤種類之一，病死率也逐年增高[5-6]。在不同經(jīng)濟發(fā)達程度的地區(qū)，女性在惡性黑素瘤的發(fā)病率和病死率方面不同程度的低于男性[7]。從臨床上關(guān)注的情況來看，惡性黑素瘤惡性程度高、轉(zhuǎn)移迅速，前期被診斷出來的能力不足，醫(yī)生和患者對惡性黑素瘤的認識不夠，使得其仍然是嚴(yán)重危及我國人群健康的疾病之一[8]。

惡性黑素瘤的發(fā)病誘因以及具體的發(fā)病機制目前尚不十分清楚。相關(guān)研究表明，惡性黑素瘤的病因與種族、遺傳、環(huán)境因素中的紫外線、個體易感性中的先天性痣、創(chuàng)傷和刺激以及其他因素，如服用避孕藥和職業(yè)暴露等有關(guān)，對于病毒引起惡性黑素瘤，僅為早期研究較少時的一種推測[9-11]。惡性黑素瘤大致分為皮膚原發(fā)性惡性黑素瘤、黏膜性惡性黑素瘤和眼惡性黑素瘤三大類，其中皮膚原發(fā)性惡性黑素瘤為最常見類型，約占惡性黑素瘤的91.2%。其診斷主要依靠組織病理檢查確診，但隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展，在進行活檢之前擁有多種可以輔助診斷的設(shè)備，如皮膚CT、皮膚鏡、在體反射激光共聚焦顯微鏡等[12]。在惡性黑素瘤治療方面，由于早期發(fā)現(xiàn)和診斷的能力不足，而且其侵襲能力較強，容易較早發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，手術(shù)和放療達不到有效的治療目的。因此應(yīng)從抑制惡性黑素瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的角度去研究可能的治療方法。

侵襲、轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性之一，也是導(dǎo)致惡性腫瘤治療效果不佳、患者預(yù)后差的主要因素。惡性腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，首要步驟是腫瘤細胞黏附至細胞外基質(zhì)或基底膜，腫瘤細胞黏附分子與基質(zhì)及相應(yīng)的配體或受體結(jié)合，激活腫瘤細胞的信號通路、酶系統(tǒng)及運動系統(tǒng)，使細胞外基質(zhì)發(fā)生降解、基底膜受到破壞，進而穿透至血管、淋巴管等，在多種細胞因子的作用下遷移到相應(yīng)組織和器官形成轉(zhuǎn)移灶[13-14]。在這樣一個多步驟的復(fù)雜過程中，腫瘤細胞與基質(zhì)或基底膜的黏附、細胞外基質(zhì)和基底膜的降解、細胞運動遷移均是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若受到阻斷，均有可能抑制腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移[15]。

腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)黏附、腫瘤細胞間的黏附力降低使得腫瘤抵抗外界各種刺激的能力減弱，從而達到抗腫瘤作用。鈣黏蛋白(cadherin)是一種具有調(diào)節(jié)細胞黏附作用的腫瘤細胞表面的重要黏附分子[16]。李璘等[17]采用不同濃度女貞子多糖作用于黑素瘤細胞后，分別進行了瓊脂糖黏附實驗、Matrigel膠黏附實驗，PCR法檢測其mRNA的表達。最后得出女貞子多糖能抑制黑素瘤細胞間、細胞與基質(zhì)間的黏附以及抑制黑素瘤細胞表達黏附分子E-cadherin，并且這種抑制作用呈劑量依賴。在本研究中，0 g/L枸杞多糖組模擬的是A375細胞與基質(zhì)的正常黏附情況，其他3個實驗組在5、10、15 g/L濃度的枸杞多糖干預(yù)下，A375細胞OD值降低，即說明枸杞多糖能抑制人惡性黑素瘤A375細胞黏附力。在細胞劃痕實驗中，5、10、15 g/L濃度枸杞多糖干預(yù)A375細胞24 h后，其運動遷移距離較0 g/L組短，表明枸杞多糖能抑制惡性黑素瘤A375細胞的遷移運動能力。Matrigel基質(zhì)膠是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，鋪在Transwell小室底部的聚碳酸酯濾膜上，能在培養(yǎng)基中重建與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似的膜結(jié)構(gòu)，從而可以模擬腫瘤細胞的侵襲過程。徐建亞等[18]采用Transwell小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，一定濃度雞血藤對惡性黑素瘤細胞侵襲基底膜的能力有顯著的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，侵襲并黏附至Transwell小室下室面的A375細胞隨著枸杞多糖濃度增高而減少，提示枸杞多糖能抑制人惡性黑素瘤A375細胞的侵襲。

由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，理論上可通過抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力以減少腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而達到臨床治療的目的[19]。本研究結(jié)果表明，枸杞多糖能使惡性黑素瘤A375細胞的黏附、遷移與侵襲能力受到抑制，從而降低惡性黑素瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性。但其抑制機制有待進一步實驗研究。

本研究要點：

本研究從腫瘤治療和傳統(tǒng)中藥治療相結(jié)合的角度，觀察枸杞多糖作為干預(yù)藥劑對惡性黑素瘤細胞生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響，根據(jù)目前所了解的資料，本研究具有一定的創(chuàng)新性和研究意義。相應(yīng)分子水平的侵襲轉(zhuǎn)移機制一般包括各種酶、細胞因子和正負基因的調(diào)控等方面，而枸杞多糖作為一種天然植物成分的中醫(yī)藥劑，是否也通過這些機制發(fā)揮作用有待進一步研究。

作者貢獻：馬文宇進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責(zé)；吳鄧婷進行實驗實施和統(tǒng)計學(xué)分析。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on the Adhesion and Invasion of Human Malignant Melanoma Cells A375

MAWen-yu，WUDeng-ting.

DepartmentofDermatology，theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity，Xining810001，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of lycium barbarum polysaccharide on the adhesion and invasion of human malignant melanoma cells A375.MethodsThe in vitro culture of human malignant melanoma cells A375 were performed from May 2013 to December 2015，and A375 cells at the logarithmic phase were taken.The A375 cells were treated with lycium barbarum polysaccharide of 0，5，10 and 15 g/L respectively.Cell adhesion assay，cell wound scratch assay and matrigel invasion assay were conducted.The influence of lycium barbarum polysaccharide of different concentrations on the adhesion，migration and invasion of A375 cells was observed.ResultsThere were significant differences in OD value after intervention for 48 h among the A375 cells treated with different concentrations of lycium barbarum polysaccharide(P<0.05)；5，10 and 15 g/L groups were lower than 0 g/L group in OD value(P<0.05).There were no significant differences in the adhesion inhibition rate after intervention for 48 h among 5,10 and 15 g/L group(P>0.05).A375 cells treated with different concentrations of lycium barbarum polysaccharide had narrower scratch width after intervention for 24 h，compared with that at 0 h；5，10 and 15 g/L groups had wider scratch than 0 g/L group at 24 h.A375 cells treated with different concentrations were significantly different in the number of invasion cells and invasiveness inhibition rate after intervention for 48 h(P<0.05)；5，10 and 15 g/L groups had lower number of invasion cells than 0 g/L group，10 and 15 g/L groups had lower number of invision cells and higher invasiveness inhibition rate than 5 g/L group(P<0.05).ConclusionLycium barbarum polysaccharide can inhibit the adhesion，migration and invasion of human malignant melanoma cells A375 to some extent.

【Key words】Melanoma；Lycium barbarum；Cell adhesion；Cell movement；Invasion

基金項目：青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計劃項目(2013-Z-731)

通信作者：馬文宇，810001青海省西寧市，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科；E-mail：mawenyu730126@163.com

【中圖分類號】R 739.5

【文獻標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.17.010

(收稿日期：2016-02-23；修回日期：2016-04-02)