季艷菊，王林川

（1. 惠州工程技術(shù)學(xué)校，廣東惠州 516000；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

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番鴨三種細(xì)小病毒多聯(lián)PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

季艷菊1，王林川2

（1. 惠州工程技術(shù)學(xué)校，廣東惠州 516000；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

摘 要：根據(jù)GenBank中番鴨“三周病”病毒（MDPV）、小鵝瘟病毒（GPV）的NS基因和VP基因，以及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病組分離到的細(xì)小病毒型“白點(diǎn)病”病毒（MDWNV）的NS和VP基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，并在建立單項(xiàng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化多聯(lián)PCR反應(yīng)條件（EX-Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、dNTPs濃度以及退火溫度等），建立了MDPV、MDWNV和GPV三種病毒的多聯(lián)PCR檢測(cè)方法。本研究結(jié)果表明，該番鴨三種細(xì)小病毒多聯(lián)PCR檢測(cè)方法具有特異、快速、準(zhǔn)確、敏感的特點(diǎn)，能同時(shí)鑒別診斷這三種番鴨細(xì)小病毒，并可直接應(yīng)用于臨床典型病變組織的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：番鴨細(xì)小病毒；多聯(lián)PCR；建立；初步應(yīng)用

近十年來(lái)，番鴨“三周病”（MDPV）、細(xì)小病毒型“白點(diǎn)病”（MDWNV）和小鵝瘟（GPV）是嚴(yán)重危害番鴨飼養(yǎng)業(yè)的傳染病。這三種疾病引起番鴨臨床發(fā)病的日齡相差不大，發(fā)病率及死亡率均較高，常在同一地區(qū)流行[1]，并會(huì)發(fā)生混合感染。同時(shí)該三種病毒的DNA序列相似性達(dá)到80%以上，因而臨床鑒別診斷難度較大，常規(guī)診斷方法很難確診，誤診現(xiàn)象嚴(yán)重，影響了對(duì)這三種疫病防治的有效實(shí)施?；诖?，本研究在建立單項(xiàng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化多聯(lián)PCR反應(yīng)條件，建立了三種病毒的多聯(lián)PCR檢測(cè)方法[2]，以便特異、快速、準(zhǔn)確、敏感地鑒別診斷這三種番鴨細(xì)小病毒病毒。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病原。MDPV、GPV、MDWNV：由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病教研室分離保存；呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨病毒性肝炎病毒：由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病教研室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)器材。生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、PCR儀、核酸蛋白測(cè)定儀、高壓鍋等，由惠州工程技術(shù)學(xué)校畜牧獸醫(yī)教研室提供。

1.1.3試 劑。0.5 ×TBE ：Tris堿 27 g、 硼 酸13.75 g、EDTA 1.861 g，溶于雙蒸水10 L；電泳上樣緩沖液（6×）：0.2%溴酚藍(lán)、50%蔗糖；dNTP Mixture、DNA Marker DL2000：購(gòu)自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；RNA抽提試劑盒：購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。EX Taq酶：購(gòu)自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康無(wú)母源抗體雛番鴨：購(gòu)自博羅番鴨孵化場(chǎng)，未免疫相應(yīng)疫苗。

1.1.5病料。人工發(fā)病后的病死番鴨組織（肝臟、脾臟、胰腺等）病料，以及從廣東、福建等地區(qū)送檢的臨床病料。

1.2方法

參照GenBank中細(xì)小病毒NS基因和VP基因序列，應(yīng)用軟件DNASTAR 5.07篩選出細(xì)小病毒科編碼基因的保守序列，先后用Primer 5.0，在保守區(qū)NS片段上設(shè)計(jì)1對(duì)通用引物：上游P1和下游P2，預(yù)擴(kuò)增片斷約430 bp；在非保守區(qū)VP片段設(shè)計(jì)1對(duì)GPV特異性引物：上游P3和下游P4，預(yù)擴(kuò)增片斷約290 bp；在非保守區(qū)VP片段設(shè)計(jì)1對(duì)MDPV特異性引物：上游P5和下游P6，預(yù)擴(kuò)增片斷為約590 bp左右。在建立單項(xiàng)PCR基礎(chǔ)上，優(yōu)化EX-Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、dNTPs濃度以及退火溫度，建立細(xì)小病毒多聯(lián)PCR檢測(cè)方法。

1.2.1引物之間相互影響實(shí)驗(yàn)。在優(yōu)化MDWNV、GPV和MDPV通用引物P1、P2，GPV特異性引物P3、P4及MDPV特異性引物P5、P6單項(xiàng)PCR條件的基礎(chǔ)上，為研究三對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增其目的基因是否會(huì)因引物間相互影響而發(fā)生改變，預(yù)先加入三對(duì)引物的體積均定為1.0 μL，按如下體系（表1）進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸為1.0 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min進(jìn)行擴(kuò)增。

表1　多聯(lián)PCR反應(yīng)體系

1.2.2不同引物濃度變化時(shí)相互間的影響分析。據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三對(duì)引物在同一體系進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，引物間相互抑制現(xiàn)象不明顯。為進(jìn)一步研究引物間相互影響，在多聯(lián)PCR反應(yīng)中保持其中兩對(duì)引物濃度不變，改變第三對(duì)引物的濃度，其引物加入量分別為1.1 μL、1.2 μL、1.3 μL、1.4 μL、1.5 μL、1.6 μL，然后進(jìn)行多聯(lián)PCR擴(kuò)增。

1.2.3退火溫度的優(yōu)化。據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)引物比例下，利用溫度梯度PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇溫度分別為50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃，作為退火溫度進(jìn)行多聯(lián)PCR擴(kuò)增。

1.2.4診斷液的配制及其反應(yīng)程序的確定。根據(jù)混合液成分及反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果，配制多聯(lián)PCR反應(yīng)混合液，后將其保存于-20 ℃冰箱，用時(shí)直接溶解，然后加入模板，用ddH2O調(diào)好體積，按優(yōu)化的多聯(lián)PCR反應(yīng)程序直接進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.5特異性實(shí)驗(yàn)。按上述優(yōu)化后的多聯(lián)PCR反應(yīng)體系及其反應(yīng)程序，對(duì)MDWNV、MDPV、GPV、鴨瘟病毒DNA及呼腸孤病毒和鴨病毒性肝炎病毒的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)多聯(lián)PCR反應(yīng)中的引物特異性。

1.2.6敏感性實(shí)驗(yàn)。分別抽提MDWNV、MDPV、GPV的DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度后，按10倍、100倍、1 000倍梯度依次遞減稀釋，然后進(jìn)行多聯(lián)PCR敏感性實(shí)驗(yàn)。

1.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用建立的多聯(lián)PCR方法，分別對(duì)MDWNV、MDPV、GPV的陽(yáng)性模板和陰性模板進(jìn)行3～4次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)多聯(lián)PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.2.8病料組織檢測(cè)

1.2.8.1人工發(fā)病的病死番鴨病料檢測(cè)。對(duì)1日齡的非免疫番鴨人工攻毒，每株病毒攻毒5只，0.5 mL/只，連續(xù)觀察2周，將病死的番鴨組織（肝臟、脾臟、胰腺等）剪碎[3]，按1:5～1:10的量加入無(wú)菌生理鹽水后研磨，5 000 rpm離心10 min，取上清提取DNA，進(jìn)行多聯(lián)PCR檢測(cè)。

1.2.8.2臨床病料組織檢測(cè)。用建立的多聯(lián)PCR檢測(cè)方法，對(duì)臨床病料組織中抽提的病毒DNA直接進(jìn)行檢測(cè)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1引物之間相互影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

引物之間相互影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1A、圖1B。由圖1A、圖1B可知，當(dāng)三對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增時(shí)，引物間的相互影響不明顯，各自的擴(kuò)增效率差別不大，均能擴(kuò)增出明顯的目的條帶P3、P4擴(kuò)增效率稍微降低但不明顯。

2.2不同引物濃度變化的影響結(jié)果

據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三對(duì)引物在同一體系發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，相互間抑制現(xiàn)象不明顯。為進(jìn)一步研究引物間隨濃度變化的相互影響情況，采用固定其中兩對(duì)引物濃度，改變第三對(duì)引物濃度，將第三對(duì)濃度逐漸調(diào)高進(jìn)行多聯(lián)PCR擴(kuò)增，觀察其變化。結(jié)果如圖2。

由圖2可知，當(dāng)固定引物P1、P2和P5、P6，而增大P3、P4時(shí)，引物間的影響無(wú)明顯變化；當(dāng)固定引物P1、P2和P3、P4，而增大P5、P6時(shí)，1～5孔引物間的影響無(wú)明顯變化，當(dāng)加入量達(dá)到1.6 μL時(shí)，P3、P4擴(kuò)增受影響，產(chǎn)量稍降低；當(dāng)固定引物P3、P4和P5、P6，而增加P1、P2時(shí)，P3、P4擴(kuò)增受影響較明顯，而P5、P6擴(kuò)增受影響較小，1～5孔基本無(wú)變化，當(dāng)達(dá)到第6孔時(shí)，P5、P6擴(kuò)增產(chǎn)量才有明顯變化。因此該多聯(lián)PCR反應(yīng)要注意P1、P2濃度的選擇。

圖1A　3對(duì)引物單項(xiàng)PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1B　多聯(lián)PCR引物之間相互影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2　引物間相互影響結(jié)果

2.3退火溫度優(yōu)化結(jié)果

用溫度梯度PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別選擇溫度50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃，擴(kuò)增結(jié)果如圖3。

圖3　退火溫度優(yōu)化結(jié)果

由圖3可知，在多聯(lián)PCR反應(yīng)中，引物P1、P2的擴(kuò)增在整個(gè)溫度變化范圍內(nèi)無(wú)明顯變化；引物P3、P4擴(kuò)增較適合溫度為54 ℃、56.3 ℃；引物P5、P6擴(kuò)增較適合溫度為54 ℃、56.3 ℃。為使三對(duì)引物擴(kuò)增達(dá)到最佳效率，平衡三者退火溫度，由圖3可知，其最佳退火溫度為54 ℃。

2.4混合液配制及其反應(yīng)程序的確定結(jié)果

根據(jù)上述反應(yīng)結(jié)果確定混合液的配制以及反應(yīng)程序。多聯(lián)PCR反應(yīng)混合液的配制結(jié)果：10×ExTaq 聚 合 酶 buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，引物P1、P2和P5、P6（20 μmol/L）4 μL（各加1μL），引物P3、P4（20 μmol/L）2.4μL（各加1.2 μL），Ex TaqTMDNA聚合酶0.5 μL，反應(yīng)體系總體積11.4 μL。多聯(lián)PCR反應(yīng)程序的確定結(jié)果：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，54℃退火50 s，72 ℃延伸為1.0 min（30個(gè)循環(huán)），72 ℃延伸10 min進(jìn)行擴(kuò)增。

2.5細(xì)小病毒多聯(lián)PCR反應(yīng)特異性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

分別抽提MDWNV、MDPV和GPV的DNA，加入到多聯(lián)PCR反應(yīng)體系中，然后PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其反應(yīng)的特異性，如圖4A、圖4B。

由圖4A、圖4B可知，引物P1、P2能夠同時(shí)從MDWNV、MDPV和GPV中擴(kuò)增出目的條帶，其他病毒均不能擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶；引物P3、P4只能從GPV中擴(kuò)增出目的條帶；引物P5、P6只能從MDPV中擴(kuò)增出目的條帶。因此該三對(duì)引物都有很高的特異性。

圖4A　特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4B　特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)MDWNV、MDPV 和GPV的DNA定量后，依次做10倍、100倍和1 000倍稀釋，然后進(jìn)行多聯(lián)PCR擴(kuò)增（圖5）。由圖5可知，該多聯(lián)PCR檢測(cè)方法對(duì)病毒的檢測(cè)敏感性達(dá)到100 pg。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用多聯(lián)PCR檢測(cè)方法先后進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果陽(yáng)性模板均能擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶，陰性模板則均不能擴(kuò)增出目的條帶，且檢測(cè)重復(fù)率達(dá)100%。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將配制好的多聯(lián)PCR反應(yīng)混合液置于-20 ℃保存，每隔2個(gè)月檢測(cè)一次，連續(xù)4次，結(jié)果均能擴(kuò)增出目的條帶，表明該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性好。

圖5　多聯(lián)PCR敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6　人工發(fā)病實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7A　疑似MDP病料臨床檢測(cè)結(jié)果

圖7B　疑似GP、MDWN臨床檢測(cè)結(jié)果

圖7C　疑似MDWN臨床檢測(cè)結(jié)果

2.9病料組織檢測(cè)結(jié)果

運(yùn)用多聯(lián)PCR反應(yīng)，對(duì)具有典型病變、人工發(fā)病、具有典型臨床癥狀的病料組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下：

2.9.1人工發(fā)病實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.9.2臨床采集病料組織檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7A、圖7B、圖7C、圖7D。

3　討論

3.1引物設(shè)計(jì)

將三對(duì)引物同時(shí)加入同一反應(yīng)體系中，進(jìn)行多聯(lián)PCR反應(yīng)。由于不同引物之間的退火溫度不同，會(huì)造成某一目的基因片段的擴(kuò)增受到抑制。因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，不僅要考慮引物退火溫度差異不能太大，還要對(duì)引物之間的相似性進(jìn)行分析，以保證反應(yīng)順利進(jìn)行。此外，當(dāng)擴(kuò)增的目的片段大小差異較大時(shí)，一般優(yōu)先擴(kuò)增小的目的片段，后擴(kuò)增大的目的片段。但如果差別太小，目的片段之間就不利于區(qū)分。因此，引物擴(kuò)增的目的片段不能差別太大，也不能差別太小，一般應(yīng)保持在100～500 bp之間。在本研究引物設(shè)計(jì)時(shí)，分別選擇最保守的、引物之間的相似性較低的地方進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)出的三對(duì)引物擴(kuò)增目的片段分別為426 bp、290 bp、589 bp，其大小差異都保持100～500 bp之間，因此在凝膠電泳時(shí)很容易區(qū)分。三對(duì)引物在進(jìn)行多聯(lián)PCR反應(yīng)時(shí)，引物間相互影響不明顯，均能擴(kuò)增出明顯的目的片段，因此判定引物設(shè)計(jì)合理。

3.2引物之間的相互作用及優(yōu)化

在研究引物間相互作用的初步實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)其PCR反應(yīng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各目的片段的擴(kuò)增都比較明顯，但引物間的相互影響不明顯。為研究引物間相互作用程度，在此基礎(chǔ)上，本研究采用了定量其中兩對(duì)引物濃度，改變第三對(duì)引物濃度的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引物P3、P4和引物P5、P6濃度增大時(shí)，三種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變化不明顯，說(shuō)明引物P3、P4 或P5、P6濃度的增大不會(huì)對(duì)其他兩對(duì)引物產(chǎn)生太大影響；當(dāng)引物P1、P2濃度增大時(shí)，對(duì)引物P3、P4擴(kuò)增產(chǎn)生的影響較大，而對(duì)引物P5、P6擴(kuò)增的影響較小，只有當(dāng)P1、P2濃度增大到一定程度時(shí)，P5、P6擴(kuò)增產(chǎn)量才有明顯變化。因此該多聯(lián)PCR反應(yīng)要注意P1、P2濃度的選擇。

3.3退火溫度的選擇

在多聯(lián)PCR反應(yīng)中，選擇合適退火溫度時(shí)，應(yīng)盡最大可能使三對(duì)引物都能夠達(dá)到最大擴(kuò)增。通過(guò)本研究，退火溫度變化對(duì)引物P3、P4和引物P5、P6擴(kuò)增反應(yīng)影響比較大，而對(duì)引物P1、P2擴(kuò)增的影響相對(duì)較小。為使三對(duì)引物同時(shí)達(dá)到最大擴(kuò)增，最佳退火溫度為54 ℃。

3.4特異性實(shí)驗(yàn)

在本研究中，MDWNV、GPV、MDPV均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段，而呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、大腸桿菌以及陰性對(duì)照均未能出現(xiàn)相應(yīng)目的條帶。因此該多聯(lián)PCR方法特異性強(qiáng)。

3.4敏感性實(shí)驗(yàn)

敏感性高的PCR反應(yīng)，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出陽(yáng)性感染動(dòng)物；而敏感性低的PCR反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，不利于疾病的診斷。因此，在建立PCR方法時(shí)，一定要注意反應(yīng)的敏感性。該多聯(lián)PCR檢測(cè)方法敏感性強(qiáng)，對(duì)病毒的檢測(cè)下限可達(dá)到100 pg。

3.5病料組織檢測(cè)

將人工發(fā)病和送檢的、臨床上具有典型病變的發(fā)病番鴨病料組織進(jìn)行研磨、離心，將上清液加熱，抽提病毒DNA后直接檢測(cè)，結(jié)果均能夠檢測(cè)出相應(yīng)的目的條帶，檢出率高達(dá)100%。因此，該方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性，能夠直接從臨床病料組織中檢出病毒，成本低、速度快，無(wú)需病原分離純化。

參考文獻(xiàn)：

[1] 季艷菊，張偉，李福偉，等. 雛番鴨細(xì)小病毒病快速診斷方法的建立[J]. 水禽世界，2007，（6）：3-5.

[2] 楊建遠(yuǎn). 番鴨的一種新病毒性疾病--花肝病[J]. 中國(guó)家禽，2005，27（21）：18-19

[3] 胡奇林，陳少鶯. 番鴨呼腸孤病毒病（肝白點(diǎn)?。┭芯窟M(jìn)展[J]. 福建畜牧獸醫(yī)，2004，26（Z1）：7-9.

[4] 胡桂學(xué)，逄博，高鳳山，等. 小鵝瘟PCR診斷方法的建立和初步應(yīng)用[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2003，7（2）：50-53.

[5] 吳寶成，陳家祥，姚金水. 番鴨呼腸孤病毒B3分離株的致病性研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，23（6）：422-425.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

中圖分類號(hào)：S851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）04-0085-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.04.027

通訊作者：王林川

Establishment and Preliminary Application of Multi-PCR for Diagnosis of Three Parvovirus in Muscovy Ducks

Ji Yanju1，Wang Linchuan2
（1. Huizhou Engineering and Technology School，Huizhou，Guangdong 516000；2.South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642）

Abstract：Three pairs of parvovirus generic primers were designed in this paper by using the VP and NS genes respectively from the GPV and MDPV in GenBank and from MDWNV in the Avian Disease Researchers of South China Agricultural University. Furthermore，the single PCR technology to optimize the reaction conditions of multi-PCR was established，such as the concentration of EX-Taq DNA polymerase enzyme，the primer concentration，the dNTPs concentration，the annealing temperature，and so on. The results showed that multi-PCR detection method of three parvovirus in the Muscovy ducks was specifi c，rapid，accurate and sensitive，and could synchronously differentiate three parvo virus of Muscovy ducks.Meanwhile，it could be used for the epidemic materials detection from the clinical typical pathological changes.

Key words：three parvovirus of Muscovy ducks；multi-PCR；establishment；preliminary application