李喆　郭建峰　楊楊　劉延風(fēng)　許瑞彬　戎鐵華　張?zhí)m軍

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·臨床研究與應(yīng)用·

探討ⅢA-N2期NSCLC原發(fā)瘤體與N2淋巴結(jié)及外周血中EGFR基因突變的差異性

李喆①郭建峰①楊楊①劉延風(fēng)①許瑞彬①戎鐵華②張?zhí)m軍②

摘要目的：探討ⅢA-N2期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）原發(fā)瘤體、N2淋巴結(jié)及外周血中表皮生長因子受體基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變狀況是否存在差異性，從基因?qū)用鏋槟壳八岢摹皞€體化醫(yī)療”提供一些有價值的參考指標。方法：用突變富集—液相芯片法檢測中山大學(xué)腫瘤防治中心及延安大學(xué)附屬醫(yī)院2014年11月至2015年11月間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實49例病理分期為ⅢA-N2期的NSCLC原發(fā)瘤體、N2淋巴結(jié)及外周血中EGFR基因19號及21號外顯子突變狀況，并對檢測結(jié)果整理分析。結(jié)果：49例患者中，有18例（36.7%）從原發(fā)瘤體中檢測出EGFR基因突變，11例（22.4%）從N2淋巴結(jié)中檢測出EGFR基因突變，而從外周血中僅有2例（4.1%）檢測出EGFR基因突變；其中9例僅有原發(fā)瘤體中EGFR基因突變，2例僅有N2淋巴結(jié)中EGFR基因突變；而外周血中檢測出EGFR基因突變的2例，同時也在原發(fā)瘤體及N2淋巴結(jié)中檢測出EGFR基因突變。結(jié)論：在NSCLC原發(fā)瘤體及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中EGFR基因突變狀況存在一定的差異性；在ⅢA-N2期NSCLC患者外周血中，EGFR基因突變檢出率較低。以上結(jié)果提示腫瘤在轉(zhuǎn)移過程中從分子水平上可能已經(jīng)發(fā)生改變，存在一定的差異性，為今后EGFR-TKIs治療NSCLC乃至于其他針對基因靶點的個體化治療提供有價值的思考。

關(guān)鍵詞非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因突變突變富集—液相芯片

肺癌目前已成為全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的首要原因，特別是在一些大城市［1］。在肺癌中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的病理類型，約占80%左右［2］。表皮生長因子受體基因（epiclermal growth factor receptor，EGFR）突變的晚期NSCLC患者從EGFR-TKIs治療中獲益，開創(chuàng)了NSCLC靶向治療的新時代［3-4］，目前服用EGFR-TKIs治療晚期NSCLC的必要前提是檢測EGFR基因是否存在突變。雖然EGFR基因突變的類型很多，但大多數(shù)集中在19號外顯子的缺失和21號外顯子的L858R錯義突變上，并且容易出現(xiàn)在亞裔、女性、不吸煙、腺癌的患者中［5-6］；而具有這些臨床特性的患者也被證實能更好的從EGFR-TKIs治療中獲益［7］。然而，并不是每一例患者都能從EGFR-TKIs治療中獲益，即便是他的EGFR基因是突變的。這就表明，EGFR基因突變不僅與一些臨床特性存在關(guān)聯(lián)性，更有可能與分子水平存在異質(zhì)性。對于大多數(shù)服用EGFR-TKIs治療的患者來說，雖然他們已是被證實轉(zhuǎn)移的晚期病例，但所用來檢測EGFR基因突變的標本卻是原發(fā)瘤體。EGFR基因突變狀況在腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移灶之間是否存在一致性呢？一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)間有相當一部分存在EGFR突變不一致性，不一定原發(fā)灶有EGFR突變轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)就一定突變，淋巴結(jié)有EGFR突變原發(fā)灶亦有可能沒有突變［8］。也有不少研究組織在晚期NSCLC患者外周血液中檢出相當比例的EGFR突變［9-10］。在本研究中，用突變富集-液相芯片法檢測中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心及延安大學(xué)附屬醫(yī)院2014年11月至2015年11月間49例病理分期為ⅢA-N2期的NSCLC原發(fā)瘤體、N2淋巴結(jié)及外周血中EGFR基因19號及21號外顯子突變狀況，并對檢測結(jié)果進行整理及分析。

1　材料與方法

1.1病例資料

收集中山大學(xué)腫瘤防治中心及延安大學(xué)附屬醫(yī)院2014年11月至2015年11月間手術(shù)切除并經(jīng)病理證實且分期為ⅢA-N2期的49例患者的NSCLC原發(fā)瘤體、N2淋巴結(jié)、術(shù)前外周血標本及完整病例資料。所有患者術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療（包括化療、靶向治療及放療）。這些患者的中位年齡為57.6（36～74）歲，其中71.4%（35/49）為男性。所有患者的病理分型均按照世界衛(wèi)生組織（WHO）的標準進行劃分，其中腺癌41例（83.7%），鱗癌8例（16.3%）。49例患者中，有30例曾經(jīng)有吸煙史占61.2%，剩余19例占38.8%未曾吸煙。

1.2EGFR基因突變檢測

本研究與廣州益善生物技術(shù)有限公司合作，用突變富集-液相芯片技術(shù)對所有標本進行EGFR基因19、21外顯子突變檢測。組織樣本首先用DNA提取試劑盒進行DNA抽提，以抽提好的DNA為樣本，首先通過多重PCR獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段，PCR反應(yīng)體系為水13.8 μL，5× PCR緩沖液10 μL，25 mM MgCl24 μL，dNTP混合液2 μL，各基因外顯子引物混合液10 μL，DNA聚合酶0.2 μL，樣品10 μL，PCR反應(yīng)條件為52℃退火溫度30循環(huán)；然后將PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸外切酶酶切及堿性磷酸酶水解，去除多余的引物和dNTP，反應(yīng)體系為核酸外切酶0.5 μL，堿性磷酸酶0.5 μL，2×緩沖液10 μL，PCR產(chǎn)物9 μL，37℃酶切水解反應(yīng)2 h；產(chǎn)物再以等位基因特異引物延伸（allele specific primer extension，ASPE）引物上的特異性序列特異的識別各等位基因型，并形成延伸產(chǎn)物（Product），ASPE反應(yīng)體系為水7.8 μL，10×PCR緩沖液2 μL，25 mM MgCl20.5 μL，dNTP（不含dCTP）混合液1 μL，生物素標記的dCTP 0.5 μL，各等位基因型引物混合液5 μL，DNA聚合酶0.2 μL，酶切水解產(chǎn)物3 μL，ASPE反應(yīng)條件為56℃退火溫度30循環(huán)；ASPE引物上的Tag序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結(jié)合，即雜交反應(yīng)，雜交反應(yīng)體系為微球12 μL，雜交液33 μL，ASPE產(chǎn)物5 μL，雜交體系經(jīng)95℃變性3 min，37℃雜交30 min后加入25 μL SA-PE工作液，繼續(xù)37℃反應(yīng)10 min，用Luminex 200系統(tǒng)分析每個樣品的熒光值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用Χ2檢驗分析EGFR基因突變與各臨床特征之間的關(guān)系；Spearman秩相關(guān)系數(shù)（Spearman's ρ）被用來判斷原發(fā)瘤體與N2淋巴結(jié)中EGFR基因突變之間是否存在關(guān)聯(lián)性，檢驗方法為Pearson's correlation test，當Spearman's P≥0.70時兩者被認為存在較強關(guān)聯(lián)性。在所有統(tǒng)計學(xué)分析中，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病例臨床特征

所納入的49例患者中位年齡57.6（36～74）歲，35例為男性，占71.4%；有吸煙史的患者30例（61.2%）；腺癌41例（83.7%），鱗癌8例（16.3%）。所有患者均行肺癌根治術(shù)（原發(fā)瘤體肺葉完整切除+縱隔淋巴結(jié)清掃），并經(jīng)術(shù)后病理證實為NSCLC且分期為ⅢA-N2期。所有患者術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療（包括化療、靶向治療及放療）（表1）。

2.249例患者原發(fā)瘤體和N2淋巴結(jié)及外周血中EGFR基因突變情況

所有標本均采用突變富集-液相芯片法檢測EGFR基因19、21外顯子是否存在突變。其中原發(fā)瘤體中EGFR基因突變檢出率為36.7%（18/49），N2淋巴結(jié)檢出率為22.4%（11/49），外周血中為4.1%（2/49）。在檢出EGFR基因突變的原發(fā)瘤體中，19外顯子片段缺失突變及21外顯子氨基酸置換突變均占50%（9：9）；而在EGFR基因突變的N2淋巴結(jié)中，19及21外顯子突變比例為6：5；在所檢出EGFR基因突變的2例外周血標本中，均為21外顯子氨基酸置換突變（表2）。

表1　49例患者臨床特征Table 1　Patients'characteristics

2.3分析比較EGFR基因突變在原發(fā)瘤體和N2淋巴結(jié)及外周血中的差異性

在配對的原發(fā)瘤體與N2淋巴結(jié)中，EGFR基因突變存在22.4%（11/49）的差異：9例（18.4%）原發(fā)瘤體中存在突變，而N2淋巴結(jié)中未檢出；2例（4.1%）N2淋巴結(jié)中存在EGFR基因突變，卻在原發(fā)瘤體中未檢出。用Pearson's correlation test進行分析，EGFR基因在原發(fā)瘤體與N2淋巴結(jié)中的突變狀況無明顯統(tǒng)計學(xué)上關(guān)聯(lián)性（Spearman's P=0.503，P＜0.001）。然而，外周血中檢測出EGFR基因突變的2例，同時也在原發(fā)瘤體及N2淋巴結(jié)中檢測出突變。

2.4EGFR基因突變與患者臨床特征之間的關(guān)系

采用Χ2檢驗分析EGFR基因突變與各臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)瘤體檢出的EGFR基因突變與女性（P=0.001）、不吸煙者（P=0.002）之間存在統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性；突變雖然在腺癌中的檢出率高于鱗癌（41.5%vs.12.5%），但是卻與腺癌沒有表現(xiàn)出明顯統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性（P=0.229）。在N2淋巴結(jié)中檢出的RGFR基因突變與不吸煙這一臨床特征之間存在統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性（P=0.001），與其他臨床特征無關(guān)。

表2　EGFR基因在原發(fā)瘤體與N2淋巴結(jié)外周血中突變情況Table 2　Mutations in the tyrosine kinase domain of the EGFR gene in primary tumor，corresponding lymph node metastasis and plasma DNA samples

3　討論

本研究采用突變富集-液相芯片法對配對的NSCLC原發(fā)腫瘤組織、N2淋巴結(jié)及外周血標本中EGFR基因突變情況進行比較分析，發(fā)現(xiàn)EGFR基因在同一例患者NSCLC原發(fā)瘤體、N2淋巴結(jié)及外周血中存在一定的差異性。Park等［8］首先報道應(yīng)用DNA直接測序法和定量的異源雙鏈分析法檢測EGFR基因在101例配對的NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的突變狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)后并不是像原發(fā)瘤體一樣具有相同的EGFR基因突變。Schmid等［11］用直接雙向測序法對96例配對的肺腺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的EGFR/KRAS/BRAF突變狀態(tài)進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在腺癌原發(fā)瘤體與周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中突變狀態(tài)存在一定的不一致性。Chang等［12］用免疫組織化學(xué)法和DNA直接測序法對56例配對的NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的p53及EGFR基因表達及突變情況進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)之間p53及EGFR基因狀態(tài)存在明顯的不一致性。Sun等［13］對80例配對的NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的KRAS及EGFR基因突變狀態(tài)用直接測序法進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)華人NSCLC患者原發(fā)瘤體與周圍轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中KRAS及EGFR基因突變狀態(tài)存在相當比例的異質(zhì)性。Bai等［9］對230例晚期NSCLC患者的配對組織和血漿中EGFR突變情況用變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）進行檢測分析，結(jié)果顯示組織標本和外周血的一致性為78%，而以組織標本檢測為金標準，外周血EGFR突變檢測的假陽性為18.8%，假陰性20.2%。外周血EGFR突變預(yù)示良好的療效與無病進展生存期。這是迄今為止樣本量最大的一組報道，提示外周血檢測具有可行性。其后續(xù)研究在樣本量達到800例時，2種標本的一致性仍近70%。Massuti等［14］對著名的SLOG研究進行的回顧性外周血游離DNA檢測分析，發(fā)現(xiàn)350例晚期NSCLC中，164例有配對的外周血標本中EGFR突變的一致性為59.1%（97/164），假陰性率為40.9%，且無假陽性。

目前對EGFR基因突變進行檢測的方法很多，包括直接測序法、DHPLC法（變性高效液相色譜法）、ARMS法（突變特異性擴增系統(tǒng)）、突變富集-液相芯片技術(shù)、熒光標記PCR產(chǎn)物法以及PCR taqman分析法等。雖然直接測序法被廣泛的用來檢測RGFR基因突變，且在容易產(chǎn)生假陰性的腫瘤細胞少于30%的標本中還可以被用來檢測突變［15］，但是此法靈敏度較低，不適合檢測福爾馬林固定和石蠟包埋標本中一些基因的體細胞突變情況，也不能檢測血漿樣本［16］。廣州益善生物技術(shù)有限公司所采用的突變富集-液相芯片技術(shù)的靈敏度非常高，達到0.1%［17］，可用來檢測NSCLC患者血清或血漿中游離DNA的體細胞突變情況。在本研究中，與廣州益善生物技術(shù)有限公司合作用突變富集-液相芯片技術(shù)檢測NSCLC患者原發(fā)瘤體、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及外周血標本中EGFR基因突變狀況。

對腫瘤異質(zhì)性的研究清楚地表明在多種人類腫瘤細胞群中存在廣泛的細胞遺傳學(xué)、基因遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)上的變化［18］，腫瘤細胞群在不同轉(zhuǎn)移部位的異質(zhì)性也被發(fā)現(xiàn)［19］。

本研究采用突變富集-液相芯片技術(shù)檢出的EGFR突變狀況至少可以說明NSCLC轉(zhuǎn)移后的癌細胞在基因?qū)用娌灰欢芘c原發(fā)瘤體保持一致性。雖然之前提到的3項研究顯示NSCLC原發(fā)腫瘤組織與外周血中EGFR突變率一致性較高，而本研究的一致性只有11.1%（2/18），原因可能是本研究所選用的為手術(shù)的ⅢA-N2期的NSCLC患者標本。除此在不同組織中EGFR突變狀態(tài)存在差異外，EGFR突變易發(fā)生在女性、腺癌、不吸煙者的NSCLC患者中，與臨床病理特征密切相關(guān)。

盡管本研究與之前的部分研究不一致，但EGFR基因突變在原發(fā)瘤體與轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性研究結(jié)果也能為針對EGFR基因的靶向治療提供一些思考，對于在靶向治療前基因檢測標本的選擇，特別是EGFR基因突變在原發(fā)瘤體與轉(zhuǎn)移灶之間的差異是否影響EGFR-TKI治療的效果有待進一步的研究。

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（2016-03-25收稿）

（2016-05-025修回）

（編輯：楊紅欣校對：孫喜佳）

Epidermal growth factor receptor mutations in primary tumors，N2 lymph nodes，and plasma samples in Chinese patients with stageⅢA-N2 non-small cell lung cancer

Zhe LI1，Jianfeng GUO1，Yang YANG1，Yanfeng LIU1，Ruibin XU1，Tiehua RONG2，Lanjun ZHANG2
Correspondence to：Lanjun ZHANG；E-mail：zhlanj@mail.sysu.edu.cn
1Department of Thoracic Surgery，Yan'an University Affiliated Hospital，Yan'an 716000，China；2Department of Thoracic Surgery，State Key Laboratory of Oncology in South China，Sun Yat-Sen University Cancer Center，Guangzhou 510060，China

AbstractObjective：Mutations in epidermal growth factor receptor（EGFR）can predict tumor response to tyrosine kinase inhibitors （TKIs）in non-small cell lung cancer（NSCLC）.However，not all cases of NSCLC with EGFR mutations can respond well；thus，discovering the heterogeneity of NSCLC at the molecular level is necessary.This study aimed to determine the discrepancy in EGFR mutations in primary tumors，N2 lymph nodes，and plasma samples.Methods：Primary tumors，N2 lymph nodes，and plasma samples obtained from 49 patients with stageⅢA-N2 NSCLC were analyzed for EGFR mutations in exons 19 and 21 by using mutant-enriched liquidchip technology.Results：In 49 patients，we detected 18（36.7%）EGFR mutations in primary tumors，11（22.4%）mutations in N2 lymph nodes，and 2（4.1%）mutations in plasma samples.Eleven（22.4%）cases showed discordance in EGFR mutations between primary tumors and N2 lymph nodes.In nine cases，EGFR mutations were detected only in primary tumors，whereas EGFR mutations were detected only in N2 lymph nodes in two cases.In addition，EGFR mutations were detected in the plasma samples of two patients，who also carry mutations in their primary tumors.Conclusion：A considerable proportion of NSCLC cases showed discrepancy in EGFR mutations between primary tumors and N2 lymph nodes.In addition，the detection rate of EGFR mutations was lower in plasma samples obtained from patients with stage IIIA-N2 NSCLC.All of the results indicated tumor heterogeneity at the molecular level during metastasis，and this heterogeneity may have implications during treatment with TKIs.

Keywords：non-small cell lung cancer，epidermal growth factor receptor，gene mutation，mutant-enriched liquidchip technology

doi：10.3969/j.issn.1000-8179.2016.12.347

作者單位：①延安大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科（陜西省延安市716000）；②中山大學(xué)腫瘤防治中心胸科，華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室

通信作者：張?zhí)m軍zhlanj@mail.sysu.edu.cn

作者簡介

李喆專業(yè)方向為胸部腫瘤臨床與實驗研究。E-mail：shuangjixiu@126.com

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