王雯珺　列璞怡　郭敏章　何建行

(呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　廣東 廣州　510120)

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二甲雙胍聯(lián)合照射抑制人肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的研究

王雯珺列璞怡郭敏章何建行

(呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣東 廣州510120)

【摘要】目的探討二甲雙胍聯(lián)合照射對(duì)人肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響，為研發(fā)肺癌有效的靶向治療方案提供新思路。方法應(yīng)用MTT法檢測(cè)二甲雙胍聯(lián)合照射對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的抑制作用，劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變，Western blot檢測(cè)其侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果MTT顯示，不同濃度的二甲雙胍對(duì)肺癌細(xì)胞A549具有顯著的增殖抑制作用。二甲雙胍組、照射組和聯(lián)合處理組12 h和24 h的遷移距離均低于對(duì)照組。聯(lián)合處理組作用于A549細(xì)胞的侵襲抑制作用也明顯高于單用二甲雙胍組和照射組。聯(lián)合處理組可下調(diào)MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)。結(jié)論二甲雙胍降低了肺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，下調(diào)了MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)，并有效抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力，提示二甲雙胍在肺癌轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，可以作為肺癌的潛在治療方案。

【關(guān)鍵詞】二甲雙胍；放療；肺癌；侵襲；轉(zhuǎn)移

肺癌是呼吸道最常見的惡性腫瘤之一，以放療為基礎(chǔ)的治療有效地降低了肺癌患者的死亡率。但是由肺癌耐藥引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是進(jìn)一步提高療效的主要障礙。研究顯示降糖藥物二甲雙胍可以顯著降低合并2型糖尿病肺癌患者的發(fā)病率及死亡率，但是其具體機(jī)制尚未明確。本研究通過檢測(cè)人肺癌細(xì)胞株A549經(jīng)放療聯(lián)合或不聯(lián)合二甲雙胍處理后，細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的改變。初步探討二甲雙胍與放療聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同作用，能否提高放療的抗瘤效應(yīng)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料主要試劑：二甲雙胍(sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-VEGF抗體(santa cruz公司)，transwell板(康寧公司)，主要儀器：ECO2150型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(new Brunswick scientific)，電泳儀(bio-rad公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀ELX80ONB(美國(guó)BIOTEK公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自存，細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2、10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中。

1.2.2MTT法測(cè)細(xì)胞生存能力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞胰酶消化后，按照3×104接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后加以不同濃度的二甲雙胍培養(yǎng)3 d，檢測(cè)IC50，將細(xì)胞分為4組：①對(duì)照組：用不含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)；②照射組：用2 Gy照射細(xì)胞，劑量率為300 cGy/min；③二甲雙胍組：用含有IC50二甲雙胍的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。④聯(lián)合處理組：用含有IC50二甲雙胍的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞聯(lián)合2 Gy進(jìn)行照射，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每隔24 h換1次液，培養(yǎng)48 h后用快速翻轉(zhuǎn)法倒掉原培養(yǎng)基，每孔加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液200 μl及5 mg/ml的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出液體，每孔加入DMSO 150 μl。室溫孵育10 min。微振蕩器振蕩15 min，用SpectraMax M5酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Molecular Deyices公司)在549 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(OD值)，以僅含有150 μl DMSO的空白孔調(diào)零，檢測(cè)二甲雙胍聯(lián)合照射對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.2.3Tanswell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在transwell小室中進(jìn)行，分組如上，所有器皿及試管均先預(yù)冷，并將matrigel膠預(yù)先置4 ℃融化，用無血清培養(yǎng)基將其1∶3稀釋、混勻，75 μl/孔加至聚碳酸酯膜上，再將小室放在24孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)，整個(gè)操作在冰上及無菌條件下進(jìn)行，37 ℃放置2 h，每孔再加50 μl含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基，37 ℃放置2 h，備用。3組細(xì)胞每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在下室加條件培養(yǎng)液200 μl/孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去上室中的培養(yǎng)液，將小室浸泡于95%乙醇中固定15 min，沖洗兩遍后將小室在吉姆薩染液中染色15 min，并用生理鹽水棉簽輕擦去上室的膠，然后將膜切下，脫水、透明后，固定于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察遷移到膜下的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)方法：在400×視野下任取5個(gè)不重復(fù)視野，利用目鏡測(cè)微尺計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿透膠的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力細(xì)胞處理48 h后，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到完全融合時(shí)，用200 μl黃色槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕進(jìn)行劃痕，PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng)，分別與8、16 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并照相，以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。

1.2.5Western blot檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)水平根據(jù)不同分組處理細(xì)胞48 h后，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞裂解獲取蛋白，4 ℃離心，取上清液，用BCA比色法測(cè)定蛋白濃度。取待測(cè)蛋白進(jìn)行熱變性處理，12%SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，然后脫脂奶粉進(jìn)行封閉，加一抗4 ℃振蕩過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗結(jié)合1 h，用ECL顯色試劑盒顯示目的條帶，X膠片曝光。在圖像分析儀上對(duì)膠片進(jìn)行掃描及分析灰度值。

2結(jié)果

2.1二甲雙胍對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549生長(zhǎng)的抑制作用使用不同濃度的二甲雙胍作用于人肺癌細(xì)胞株A549，檢測(cè)24、48、72 h后細(xì)胞存活率。MTT結(jié)果顯示二甲雙胍可以顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，且呈明顯濃度及時(shí)間依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。計(jì)算得出48 h的IC50為12.52 mM，使用這一濃度檢測(cè)二甲雙胍聯(lián)合照射對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組的增殖率顯著低于二甲雙胍組和照射組。見表2。

表1　 二甲雙胍對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549

表2　不同處理組A549細(xì)胞的增殖情況±s)

2.2二甲雙胍聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響細(xì)胞遷移是一種復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)行為，細(xì)胞遷移的動(dòng)態(tài)過程持續(xù)存在于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的始終。我們使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二甲雙胍聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響，見圖1。二甲雙胍組、照射組和聯(lián)合處理組12 h和24 h的遷移距離均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖1　二甲雙胍聯(lián)合放療對(duì)A549細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響

分組0h12h24hFP對(duì)照組430.200±42.341405.232±13.452101.213±64.300二甲雙胍組照射組411.230±31.233424.600±4.210387.012±11.210302.290±14.580162.240±52.100202.342±2.02362.1200.001聯(lián)合處理組410.241±2.101367.983±31.200323.340±21.420

2.3二甲雙胍聯(lián)合放療對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞侵襲穿過Matrigel的能力反映該細(xì)胞的侵襲能力，見圖2。A549細(xì)胞的聯(lián)合處理組的相對(duì)侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯少于二甲雙胍組和照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表4。

圖2　Transwell檢測(cè)不同處理組對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

A549分組n侵襲細(xì)胞數(shù)FP對(duì)照組3154.000±12.124二甲雙胍組照射組33119.000±6.80693.333±8.81956.630<0.001聯(lián)合處理組330.333±8.950

2.4蛋白印跡法檢測(cè)侵襲相關(guān)因子的表達(dá)腫瘤的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)是侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和基底膜的穿透，及新生血管生成是侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，金屬蛋白酶家族(MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)重要的蛋白酶，其中MMP-2和MMP-9是研究的最為廣泛的兩種金屬蛋白酶，MMP-9可通過釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以參與血管生成。在此實(shí)驗(yàn)中，使用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲相關(guān)因子MMP-2，MMP-9，VEGF的表達(dá)情況，表明聯(lián)合處理組處理后MMP-2，MMP-9，VEGF的表達(dá)與二甲雙胍組和照射組相比顯著降低。見圖3。

圖3　Western blot檢測(cè)侵襲相關(guān)蛋白

3討論

二甲雙胍是一種抗糖尿病藥物，廣泛被用于2型糖尿病的治療，通過抑制肝糖原異生，增強(qiáng)肌肉葡萄糖攝取，抑制脂肪生成，減輕高血糖癥。但是目前很多研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以減少肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展[1-4]。也有學(xué)者進(jìn)行了二甲雙胍在結(jié)腸癌的病例系統(tǒng)回顧并進(jìn)行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者使用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)處理，可明顯改善其生存期[5]。在本研究中，我們證實(shí)二甲雙胍抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，聯(lián)合照射后可顯著降低細(xì)胞的侵襲和遷移，同時(shí)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)。

二甲雙胍可預(yù)防癌癥的機(jī)理可能是降低內(nèi)源性高胰島素血癥，提高外周組織對(duì)胰島素的敏感性，目前已經(jīng)明確內(nèi)源性高胰島素血癥是心、腦血管病的重要危險(xiǎn)因素，其高表達(dá)可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，同時(shí)與腫瘤發(fā)病亦存在直接或間接的聯(lián)系，有研究指出miR-133a的失調(diào)可引起多種類型的癌癥，通過體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)證明，miR-133a是卵巢癌中的重要調(diào)節(jié)劑，并且其抑制作用是通過靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)介導(dǎo)的[6]，二甲雙胍可以作用于IGF1R從而影響miR-133a的表達(dá)。另外，二甲雙胍的降糖作用主要是通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞在低葡萄糖環(huán)境中存活是因?yàn)榫€粒體信號(hào)通路AMPK被抑制，AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。AMPK可在各種代謝相關(guān)的器官中表達(dá)，能被機(jī)體各種刺激激活，包括細(xì)胞應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)和很多激素及能影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)。二甲雙胍可以興奮AMPK信號(hào)通路，激活相關(guān)蛋白激酶，抑制腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[1，7]。最近有研究表明二甲雙胍也可通過增加腫瘤CD8+浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)數(shù)量，阻止CD8+的TILs因?yàn)榈蛲龆鴾p少，表現(xiàn)出抗癌效應(yīng)[8]。

目前二甲雙胍降糖作用是眾所周知的，預(yù)防癌癥的作用將是二甲雙胍的又一重大發(fā)現(xiàn)。結(jié)合二甲雙胍在肺癌組織上的研究，我們從理論上進(jìn)一步證明了二甲雙胍可以抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，為二甲雙胍的抗癌作用提供證據(jù)，聯(lián)合二甲雙胍治療癌癥可能是一種有效的治療策略。

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Inhibition of lung cancer cells migration and invasion by metformin combined with irradiation

Wang Wenjun，Lie Puyi，Guo Minzhang，He Jianxing

(RespiratoryDiseaseStateandKeyLaboratory/TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of metformin combined with irradiate on migration and invasion capacity in lung cancer so as to shed new light on the development of target therapy for lung cancer. MethodsInhibitory effect of metformin combined with irradiation on A549 cells was detected by MTT. The migration and invasion capacity of tumor cells were assessed by wound healing assay and transwell chamber with matrigelgel, respectively. Expression of MMP-2, MMP-6, VEGF was measured by Western blot. ResultsMTT assay showed an obvious suppression of A549 cells proliferation in response to Metformin treatment. 12 h and 24 h migration distances in the metformin group, irradiation group and combined treatment group were lower than the control group. The combined treatment with metformin and Irradiation also caused a significantly higher inhibition rate of A549 cells invasion than metformin or Irradiate alone. The combined treatment group could down regulate the expression of VEGF, MMP-9 and MMP-2. ConclusionMetformin reduced the growth of lung cancer tumor cells, down regulated the expression of MMP-2, MMP-9 and VEGF, inhibited the lung cancer cell invasion. It suggests that metformin can play an important role in the metastasis of lung cancer and maybe a potential therapy for lung cancer.

【Key words】metformin; radiotherapy; lung cancer; migration; invasion

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81301939)；博士后基金(2015M570697)。

通訊作者：何建行，E-mail：hejx@vip.163.com。

【中圖分類號(hào)】R 734.2

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.05.003

(收稿日期：2015-09-22)