歐陽寧，金　璐，阮　穎，陳東紅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

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甘藍(lán)型油菜BnaSOT12a基因的抗性作用研究

歐陽寧，金璐，阮穎*，陳東紅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128）

摘 要：磺酸轉(zhuǎn)移酶（SOT， EC 2.8.2.–）催化的磺酸化反應(yīng)在植物的生長發(fā)育和植物抗逆過程中起著重要的作用。甘藍(lán)型油菜BnaSOT12a基因是與擬南芥中AtSOT12基因同源的一個磺酸轉(zhuǎn)移酶基因。為探尋BnaSOT12a基因的抗性相關(guān)功能，對其在油菜中不同部位的表達(dá)和在擬南芥中過表達(dá)情況下對轉(zhuǎn)基因植株的影響進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：BnaSOT12a基因在甘藍(lán)型油菜的根、葉、花芽和花中都有表達(dá)，其在花中的表達(dá)量最高，而在莖與果莢中沒有表達(dá)；甘藍(lán)型油菜BnaSOT12a基因在擬南芥中的過表達(dá)，能提高轉(zhuǎn)基因植株在發(fā)芽和根生長方面對NaCl脅迫的耐受能力，但在鹽脅迫下，BnaSOT12a的磺酸化作用并不影響擬南芥中抗病途徑的信號傳導(dǎo)，與抗病途徑無關(guān)。

關(guān) 鍵 詞：甘藍(lán)型油菜；擬南芥；BnaSOT12a基因；半定量PCR；植物抗鹽；基因表達(dá)

投稿網(wǎng)址：http://xb.ijournal.cn

作為一類復(fù)合蛋白家族，磺酸轉(zhuǎn)移酶（SOT，EC 2.8.2.–）廣泛存在于動物和植物組織中。該酶能夠催化一系列的底物，使其發(fā)生磺酸化，介導(dǎo)一個磺酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物中合適的羥基或者氨基基團(tuán)上，其中磺酸基團(tuán)的供體為 3'–磷酸腺苷–5'–磷酰硫酸（PAPS）［1］。生物體內(nèi)的磺酸化反應(yīng)涉及到多方面的生物學(xué)過程，包括通信、生長、發(fā)育和防御反應(yīng)［2］?；撬徂D(zhuǎn)移酶催化的底物包括多種含有羥基和氨基的內(nèi)源性和外源性分子［3–4］。磺酸化作用一方面通過將藥物等外源物質(zhì)轉(zhuǎn)化成更易溶于水的形式，提高磺酸化物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力［5］；另一方面，磺酸化作用也能夠激活某些分子的活性［6］。

至今為止，根據(jù)序列的相似性，擬南芥磺酸轉(zhuǎn)移酶家族（AtSOTs）被分為8個亞家族［2］，其中，第1個被鑒定出的擬南芥SOT基因（RaR047、At2g03760）即是 AtSOT12［7］，它能夠被鹽、滲透壓和激素處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其T–DNA插入突變體sot12，在種子發(fā)芽階段對NaCl 和脫落酸（abscisic acid，ABA）以及在幼苗生長期對水楊酸（SA）表現(xiàn)出高度敏感性［8］。體外酶活性試驗(yàn)表明，AtSOT12蛋白能夠磺酸化水楊酸，而水楊酸的磺酸化對水楊酸的產(chǎn)生具有正向調(diào)節(jié)作用［8］。在感染丁香假單孢菌病原菌的情況下，sot12突變體、AtSOT12過表達(dá)植株分別表現(xiàn)出對水楊酸的低積累、高積累［8］。與水楊酸水平的改變一致，sot12突變體更易感病，然而AtSOT12過表達(dá)植株對病原菌感染具有更強(qiáng)的抗性。此外，病原菌誘導(dǎo)的PR基因在AtSOT12過表達(dá)植株葉片中的表達(dá)也顯著增強(qiáng)［8］。

目前，人們對油菜中的SOT基因仍鮮有研究。本研究中通過構(gòu)建甘藍(lán)型油菜 BnaSOT12a基因的過表達(dá)載體pFGC5941::35S:BnaSOT12a，并轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株 Col–0，研究了甘藍(lán)型油菜BnaSOT12a基因在抗鹽方面的部分作用，旨在為提高甘藍(lán)型油菜的抗逆性和遺傳育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞野生型Col–0、甘藍(lán)型油菜湘油–15 （XY–15）、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株、克隆載體pEASY、表達(dá)載體 pFGC5941，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實(shí)驗(yàn)室提供；Marker為100 bp Plus II DNA ladder，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥培養(yǎng)

將營養(yǎng)土和蛭石按體積比 2∶1加水混合，裝入小缽，小缽置于盆中。擬南芥種子播種于混合土表面，噴灑少量水，并用保鮮膜覆蓋。在4 ℃、避光處理3 d后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室內(nèi)，揭膜。培養(yǎng)溫度為23 ℃，長日照（16 h光照，8 h黑暗），相對濕度50％～60％。定期澆灌晾曬過的自來水。

1.2.2 BnaSOT12a表達(dá)的RT–PCR檢測

搜索TAIR網(wǎng)站（http://www.arabidopsis. org/），檢索得到擬南芥AtSOT12基因的DNA序列。利用甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫（http://www.genoscope.cns. fr/brassicanapus/）的Blat序列比對工具，以AtSOT12基因DNA序列信息為源數(shù)據(jù)，得到比對結(jié)果中數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的基因，再根據(jù)序列的相似度以及基因結(jié)構(gòu)的相似性，確定了總體相似度最高的BnaSOT12a（BnaC02g35150D）基因作為研究對象。

利用BnaSOT12a基因的CDS序列，通過NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站的Primer–BLAST設(shè)計RT–PCR檢測引物RTBnST12a–F/RTBn ST12a–R。

RTBnST12a–F，5'–CGCACCTTCTCATACCCT TCTTG–3'；RTBnST12a–R，5'–ACTTCACAATCCC TCCGACT–3'。預(yù)測PCR產(chǎn)物大小為459 bp。

分別取開花期的湘油–15（XY–15）植株的根、莖、蓮座葉、莖生葉、花芽、花以及果莢，采用Trizol法［9］提取各組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板，油菜Actin2.1表達(dá)為參照。用設(shè)計好的RTBnST12a–F/RTBnST12a–R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。

1.2.3 pFGC5941: :35S:BnaSOT12a表達(dá)載體的構(gòu)建

從甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫中獲得 BnaSOT12a （BnaC02g35150D）基因組序列全長為972 bp，不含內(nèi)含子。設(shè)計PCR擴(kuò)增引物PBnST12–F/PBnST12–R擴(kuò)增該基因組序列全長，分別在上游和下游引物5'端加上 AscⅠ和 BamHⅠ酶切位點(diǎn)的序列及保護(hù)堿基，預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物所得目的片段大小為989 bp?？寺∫镄蛄腥缦拢篜BnST12–F，5'–GGCGCGCCA TGTCATCATCATCATCATC–3'；PBnST12–R，5'–CG CGGATCCTCAACAAGAAAATTTGAGACC–3'。

采用改進(jìn)的 CTAB法［10］提取甘藍(lán)型油菜的總DNA。以該DNA為模板，PBnST12–F/PBnST12–R為引物，用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段，連接到全式金公司pEASY載體上，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在添加有卡那霉素的瓊脂平板上篩選陽性菌，并用PCR方法確定轉(zhuǎn)化株。挑取陽性單菌落液體培養(yǎng)，取菌液送博尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。對測序結(jié)果正確的菌株提取pEASY–BnaSOT12a質(zhì)粒，用AscⅠ和BamHⅠ核酸酶對pEASY–BnaSOT12a質(zhì)粒和pFGC5941載體進(jìn)行酶切，回收目的片段和目的載體，最后將兩者用T4連接酶連接。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化及發(fā)芽率和根長的測定

利用凍融法［11］將連接好的質(zhì)粒 pFGC5941:: 35S:BnaSOT12a轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株，篩選陽性菌，進(jìn)行菌落PCR鑒定和雙酶切驗(yàn)證。陽性菌置于添加有利福平（50 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）和卡那霉素（100 mg/L）的 YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0～2.0。利用浸花法［12］轉(zhuǎn)化擬南芥Col–0。收集F0代擬南芥種子，播種于營養(yǎng)土表面，待發(fā)芽后噴灑5 g/L的PPT，每天2次，連續(xù)6 d。將抗性苗移至新鮮蛭石小缽中，23 ℃、長日照（16 h/d光照）培養(yǎng)。

設(shè)計轉(zhuǎn)化陽性植株檢測引物。上游引物pFGC5941–35S–F在載體 35S區(qū)域，下游引物BnST12a–jcR在目的片段上。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為857 bp。引物序列：pFGC5941–35S–F，5'–ACCTCCT CGGATTCCATTGC–3'；BnST12a–jcR，5'–CTCTTA ACGGACTCGGGC AG–3'。

提取抗性苗植株葉片DNA，以總DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測目的條帶，獲得轉(zhuǎn)基因植株。分株收集F1代種子，播種后再次篩選與檢測，直到獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。

將轉(zhuǎn)基因擬南芥 Bnsot12a 和 Col–0的種子表面消毒，分別置于添加50 mmol/L NaCl的 1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每天統(tǒng)計發(fā)芽率，連續(xù) 8 d。在普通1/2MS培養(yǎng)基發(fā)芽3 d后，幼苗轉(zhuǎn)移至添加有0、50、100 mmol/L NaCl的培養(yǎng)平板中豎直培養(yǎng)，7 d后測量根長。

1.2.5 抗性相關(guān)基因PR1、PR2、PR5及BnaSOT12a基因表達(dá)的RT–PCR檢測

將在添加0、50、100 mmol/L NaCl的培養(yǎng)平板上生長10 d的擬南芥幼苗取出，采用Trizol法［9］提取植株的總 RNA，并反轉(zhuǎn)成 cDNA。以擬南芥ACTIN2作為內(nèi)參調(diào)節(jié)模板起始量。分別使用設(shè)計好的PR1、PR2、PR5及BnaSOT12a基因檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

PR1 基因檢測引物（預(yù)期產(chǎn)物大小為335 bp）：

PR1–F，5'–GGAGACTGTGGCGGTCTAAG–3'；PR1–R，5'–TAGTCCGTGGGAGGACAAGT–3'。

PR2基因檢測引物（預(yù)期產(chǎn)物大小為494 bp）：

PR2–F，5'–GAGCTCATCCTCGACGTTCC–3'；PR2–R，5'–CCGTGTCTCCCATGTAGCTG–3'。

PR5基因檢測引物（預(yù)期產(chǎn)物大小為268 bp）：

PR5–F，5'–AACAATTGCCCTACCACCGT–3'；PR5–R，5'–CGCCATCGCCTACTAGAGTG–3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜不同組織中的 BnaSOT12a基因表達(dá)情況

對甘藍(lán)型油菜XY–15不同部位的BnaSOT12a基因表達(dá)情況進(jìn)行 RT–PCR檢測，以甘藍(lán)型油菜Actin2.1基因表達(dá)水平為參照，結(jié)果顯示BnaSOT12a基因在根、葉、花芽和花中都有表達(dá)，其中在花中的表達(dá)量最高，而在莖和果莢中沒有表達(dá)（圖1）。

圖1　BnaSOT12a基因在甘藍(lán)型油菜不同組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of BnaSOT12a gene in different tissues of Brassica napus

2.2 BnaSOT12a基因過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及鑒定

為了研究甘藍(lán)型油菜 BnaSOT12a基因在植物中發(fā)揮的功能，采用PCR擴(kuò)增克隆了該基因的全長序列，再采用 AscⅠ和 BamHⅠ核酸酶雙酶切pEASY–BnaSOT12a及pFGC5941::35S質(zhì)粒，最后通過連接酶將目的片段連接到pFGC5941載體上，構(gòu)建成過表達(dá)質(zhì)粒 pFGC5941::35S:BnaSOT12a（圖2）。為了驗(yàn)證載體連接的正確性，對該過表達(dá)載體再次進(jìn)行了AscⅠ和BamHⅠ酶雙酶切（圖3）。結(jié)果顯示，目的片段與理論預(yù)期結(jié)果相符合，說明pFGC5941: :35S:BnaSOT12a載體構(gòu)建成功。

圖2　pFGC5941: :35S:BnaSOT12a質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic diagram of pFGC5941: :35S:BnaSOT12a plasmid construction

圖3　pFGC5941::35S:BnaSOT12a質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis image of pFGC5941::35S:BnaSOT12a plasmid digested by double restriction enzyme

將pFGC5941: :35S:BnaSOT12a質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化 Col–0，采用前述方法并通過PPT篩選得到抗性植株（圖4）。將抗性植株轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中生長。提取擬南芥葉片總DNA，以此為模板，利用檢測引物pFGC5941–35S–F/BnST12a–jcR進(jìn)行PCR檢測，表明目的片段成功導(dǎo)入擬南芥基因組中，獲得3株轉(zhuǎn)基因植株（圖5）。

圖4　PPT擬南芥抗性植株篩選結(jié)果Fig.4 Screening of PPT–resistant Arabidopsis seedlings

M Marker；1～3 抗性植株；4 質(zhì)粒陽性對照；5 Col–0陰性對照。圖5　抗性植株轉(zhuǎn)基因PCR檢測結(jié)果Fig.5 Transgenic PCR detection of resistant plants

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率及根長

以擬南芥 Col–0為對照，對穩(wěn)定遺傳的Bnsot12a轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的耐鹽能力進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，在50 mmol/L NaCl 脅迫下，第1 天未觀察到種子發(fā)芽，在脅迫2～4 d，2種材料的發(fā)芽率幾乎沒有差別；隨著脅迫時間的延長，發(fā)芽率開始出現(xiàn)差異，Bnasot12a種子的發(fā)芽率逐漸比野生型擬南芥種子的發(fā)芽率高約10％，達(dá)到58％（圖6）。而未受脅迫的情況下，2種擬南芥種子的發(fā)芽率都在 80％以上（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。在鹽脅迫下的根生長試驗(yàn)中，盡管野生型擬南芥和Bnasot12a的根長都受到NaCl脅迫的影響而變短，但隨著NaCl濃度的增加，Bnasot12a的根長始終比Col–0的長0.3～0.6 cm。這種結(jié)果說明甘藍(lán)型油菜 BnaSOT12a基因在擬南芥中的過表達(dá)，能提高轉(zhuǎn)基因植株對NaCl脅迫的耐受能力（圖7）。

圖6　NaCl 脅迫下擬南芥種子的發(fā)芽率Fig.6 Germination rate of Arabidopsis seed under NaCl stress

圖7　不同濃度NaCl培養(yǎng)基中抗性植株的根長Fig.7 Root length in NaCl medium with different concentrations

2.4 抗性相關(guān)基因PR1、PR2、PR5及BnaSOT12a基因表達(dá)的RT–PCR檢測

甘藍(lán)型油菜BnaSOT12a具有催化磺酸化的作用，其催化的磺酸化作用是否影響水楊酸的磺酸化，進(jìn)而影響植株的抗病性？為此，筆者檢測了 BnaSOT12a過表達(dá)植株中的PR1、PR2、PR5 基因表達(dá)水平。研究顯示，無論是否添加NaCl 處理，PR1、PR2、PR5的基因表達(dá)水平在Bnasot12a與Col–0中類似，說明甘藍(lán)型油菜BnaSOT12a的磺酸化作用并不影響擬南芥中的抗病途徑的信號傳導(dǎo)，或者說BnaSOT12a可能不影響水楊酸的磺酸化（圖8）。

圖8　PR1、PR2、PR5及BnaSOT12a基因表達(dá)的RT–PCR檢測結(jié)果Fig.8 Gene expression detection of PR1， PR2， PR5 and BnaSOT12a genes in Col–0 and Bnasot12a mutant

3 討論

鹽脅迫會導(dǎo)致植物發(fā)生一系列的生理變化，進(jìn)而抑制植物的生長。研究［13–14］表明，植物對鹽脅迫的應(yīng)答涉及到多種基因和各種復(fù)雜的生物信號途徑。在擬南芥中，AtSOT12基因的表達(dá)能夠被鹽、滲透壓和激素處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)。本研究探索了甘藍(lán)型油菜中 BnaSOT12a基因的特異性表達(dá)以及在植物抗性反應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，該基因在甘藍(lán)型油菜中主要在花、葉以及根中表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高，而在莖與果莢中沒有表達(dá)，說明BnaSOT12a是一個組織特異性表達(dá)的基因，這可能與它的作用功能的發(fā)揮有關(guān)。在擬南芥發(fā)芽率和根長試驗(yàn)中，BnaSOT12a基因過表達(dá)突變體對鹽脅迫表現(xiàn)出一定的抗性，對鹽脅迫的耐受性相較于野生型有一定增強(qiáng)，也就是說BnaSOT12a基因的磺酸化作用與鹽脅迫相關(guān)，其過表達(dá)有利于提高植株對鹽脅迫的耐受能力。在有或無鹽脅迫下，擬南芥轉(zhuǎn)基因植株與Col–0中的PR1、PR2、PR5基因表達(dá)均不受影響，表明甘藍(lán)型油菜的BnaSOT12a基因的抗鹽機(jī)理與水楊酸途徑不同，與植物的抗病信號傳導(dǎo)途徑?jīng)]有直接聯(lián)系。

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責(zé)任編輯：蘇愛華

英文編輯：梁 和

Study on the resistance of BnaSOT12a gene in Brassica napus

Ouyang Ning，Jin Lu，Ruan Ying*，Chen Donghong
（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract:Sulphonation reaction catalyzed by sulfotransferase （SOT， EC 2.8.2.–） plays a key role in plant growth and resistance. BnaSOT12a in Brassica nupus is a sulfotransferase gene， homologous to ATSOT12 in Arabidopsis. To seek BnaSOT12a gene functions associated with resistance， the gene expression level in various organs of Brassica nupus and the effect of overexpression on transgenic plant of Arabidopsis were analyzed. Results showed that BnaSOT12a could be expressed in leaves， buds and flowers. In flowers， the expression lever was the highest. However， no expression in stems and capsule. The endurable capability of NaCl was enhanced in root growth and germination in transgenic plant as BnaSOT12a overexpression in Arabidopsis. Nevertheless， sulphonation reaction catalyzed by BnaSOT12a did not affect disease-resistant signal transduction within Arabidopsis under salt stress. Hence， BnaSOT12a seems irrelevant with disease resistance pathway.

Keywords:Brassica napus； Arabidopsis thaliana； BnaSOT12a gene； semi-quantitative PCR（RT–PCR）； salt resistance；gene expression

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032（2016）03?0251?05

收稿日期：2016–04–05 修回日期：2016–04–13

基金項(xiàng)目：湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項(xiàng)目（14K046）

作者簡介：歐陽寧（1988—），男，湖南永州人，碩士研究生，主要從事植物抗逆性基因的研究，ouyang0901@qq.com；*通信作者，阮穎，博士，教授，主要從事植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控研究，yingruan@hotmail.com