黃　弈，韓成云，支添添，任春梅，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春336000）

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擬南芥sscd1–1點(diǎn)突變對(duì)其表達(dá)的影響

黃弈1，韓成云3，支添添1，任春梅1，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春336000）

摘 要：為了探明擬南芥sscd1–1突變體中sscd1–1突變基因表達(dá)水平的降低是由剪切效率所致還是由自身啟動(dòng)子影響所致，分別構(gòu)建了由外源35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SSCD1正?；蚝蛃scd1–1突變基因的表達(dá)載體及由內(nèi)源自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 SSCD1正?；蚝?sscd1–1突變基因的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入到擬南芥 sscd1–1突變體中。采用RT–PCR分析sscd1–1突變基因的表達(dá)。結(jié)果顯示：外源35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sscd1–1突變基因的表達(dá)與正?；蛳啾葲](méi)有明顯差別，而內(nèi)源自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sscd1–1突變基因的表達(dá)顯著降低，這表明sscd1–1的點(diǎn)突變沒(méi)有影響其剪切效率；sscd1–1突變基因表達(dá)水平的降低是由內(nèi)源自身啟動(dòng)子影響所致。

關(guān) 鍵 詞：擬南芥；sscd1–1；啟動(dòng)子；基因表達(dá)

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在動(dòng)物體內(nèi)，酪氨酸降解途徑是一條必不可少的代謝途徑［1］。酪氨酸降解途徑的最后一步是延胡索酰乙酰乙酸水解酶（FAH）將延胡索酸乙酰乙酸水解成乙酰乙酸和延胡索酸。FAH缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物患先天性致死病癥。目前，關(guān)于植物中酪氨酸降解途徑的研究尚少。在筆者的前期研究中，通過(guò) EMS誘變，在擬南芥中分離出了短日照條件下發(fā)生細(xì)胞死亡的sscd1–1突變體，并對(duì)SSCD1基因進(jìn)行了圖位克隆，發(fā)現(xiàn)該基因編碼FAH［2–6］。sscd1–1突變體的單堿基突變位點(diǎn)發(fā)生在該基因第4個(gè)外顯子的最后一個(gè)堿基，由G變成A。由于sscd1–1突變體的突變位點(diǎn)發(fā)生在剪接識(shí)別位點(diǎn)，所以，推測(cè)mRNA的剪切很可能會(huì)受其影響。在前期研究中，筆者通過(guò)RT–PCR分析和cDNA擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)突變體的cDNA序列除1個(gè)堿基發(fā)生了突變外，其他都沒(méi)有變化，說(shuō)明突變體沒(méi)有發(fā)生剪接位點(diǎn)的改變［6］，但RT–PCR結(jié)果顯示突變體mRNA的表達(dá)水平明顯下降，所以，據(jù)此可推測(cè)sscd1–1突變體轉(zhuǎn)錄水平的下降可能是由剪切效率降低所致或者是由內(nèi)源自身啟動(dòng)子調(diào)控所致。本研究中以擬南芥Col–0野生型和sscd1–1突變體為材料，分別構(gòu)建了由外源35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SSCD1正?；蚝蛃scd1–1突變基因的表達(dá)載體，及由內(nèi)源自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 SSCD1正常基因和sscd1–1突變基因的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入到擬南芥中，檢測(cè)SSCD1基因mRNA的表達(dá)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col–0和突變體sscd1–1［6］以及載體pMyc2［7–8］和pFLAG［8］由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號(hào)傳導(dǎo)課題組保存。

1.2 植物的培養(yǎng)

將擬南芥種子用消毒液浸泡10 min，無(wú)菌水清洗3次，播種于含1％蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，避光4 ℃春化3 d后，轉(zhuǎn)入人工氣候箱生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度為（22±2） ℃。長(zhǎng)日照光周期為16 h光照/8 h黑暗，短日照光周期為8 h光照/16 h黑暗。待擬南芥種子生長(zhǎng)7 d后，移栽到盛有浸透營(yíng)養(yǎng)液的人工土壤（東北黑土與蛭石的體積比為1∶1）中，蓋透明塑料薄蓋生長(zhǎng)1～2 d后再置于光照培養(yǎng)室生長(zhǎng)。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及 SSCD1全基因和含內(nèi)源啟動(dòng)子SSCD1的克隆

根據(jù)TAIR網(wǎng)站上公布的擬南芥SSCD1基因序列，用軟件 Primer Premier 5設(shè)計(jì) 2對(duì)引物pMS–F/pMS–R、pFS–F/pFS–R。以Col–0野生型和sscd1–1突變體基因組 DNA為模板，分別擴(kuò)增SSCD1基因和含內(nèi)源啟動(dòng)子的SSCD1基因。根據(jù)載體pMyc2和pFLAG帶有的限制性酶切位點(diǎn)，在正、反引物的5′端分別加上SmaⅠ和SacⅠ位點(diǎn)，序列為pMS–F（5′–CCCGGGATGGCGTTGCTGAA GTCTTT–3′）、pMS–R（5′–GAGCTCACTTATTGTTA ATGGGTTGG–3′）；pFS–F（5′–GAGCTCCCCTCCAC CACCATCGCCAG–3′）和 pFS–R（5′–CCCGGGAGG CGGTGAAGGAACAATTT–3′），序列下劃線部分“CCCGGG”為SmaⅠ位點(diǎn)，“GAGCTC”為SacⅠ位點(diǎn)。引物pMS–F/pMS–R和pFS–F/pFS–R的退火溫度分別為55 ℃和66 ℃。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠，回收，純化。

1.3.2 載體連接和基因測(cè)序及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

用 SmaⅠ和 SacⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)上述PCR產(chǎn)物和pMyc2及pFLAG載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后分別回收目的片段和目的載體。用 T4連接酶將 SSCD1正常基因和sscd1–1突變基因分別連接至pMyc2載體的相應(yīng)位點(diǎn)；將含內(nèi)源啟動(dòng)子的SSCD1正常基因和sscd1–1突變基因分別連接至 pFLAG載體的相應(yīng)位點(diǎn)，分別構(gòu)建pMyc2–35S::SSCD1、pMyc2–35S::sscd1–1的表達(dá)載體和 pFLAG–en::SSCD1、pMyc2–en::sscd1–1的表達(dá)載體。采用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α，取陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序。采用電擊法將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌AGL–1中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子篩選鑒定

挑取已轉(zhuǎn)入重組載體的陽(yáng)性農(nóng)桿菌單菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）、羧芐青霉素（100 mg/L）的YEB液體培養(yǎng)基中活化，采用浸化法［9］轉(zhuǎn)化擬南芥sscd1–1突變體，并收獲T0代種子。在含有卡那霉素（50 mg/L）的 MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn) pMyc2–35S:: SSCD1表達(dá)載體和轉(zhuǎn)pMyc2–35S::sscd1–1表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株，在含有潮霉素（20 mg/L）的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)pFLAG–en::SSCD1表達(dá)載體和轉(zhuǎn)pMyc2–en::sscd1–1表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。將篩選到的轉(zhuǎn)基因植株T1代抗性苗移入土中，后代單株收種。挑選T2代抗性符合3∶1分離比的轉(zhuǎn)基因株系，自交純合后用于基因表達(dá)分析試驗(yàn)。

1.4 基因表達(dá)分析

分別取生長(zhǎng)14 d的Col–0野生型、sscd1–1突變體以及轉(zhuǎn)基因植株的蓮座葉片，采用Trizol法提取總RNA。按照ReverTra Ace qPCR RT Kit的操作說(shuō)明，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA進(jìn)行RT–PCR分析，重復(fù)試驗(yàn)2次。SSCD1基因的引物為5′–CCTCGTCCTGCCGTCGCTAT–3′和5′–CTTGTGGATGGCCCTGACCT–3′；內(nèi)參 ACT2的引物為5′–TTCCGCTCTTTCTTTCCAAGCTCA–3′和5′–AAGAGGCATCAATTCGATCACTCA–3′。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃變性30 s，50～55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 sscd1–1突變體中SSCD1基因的表達(dá)

SSCD1基因表達(dá)水平的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，野生型中SSCD1基因的表達(dá)量較高，而sscd1–1突變體中SSCD1基因的表達(dá)量與野生型相比明顯降低，而且長(zhǎng)、短日照條件下的表達(dá)情況沒(méi)有明顯差別。這表明SSCD1基因在sscd1–1突變體中mRNA的表達(dá)水平顯著下降，且不受光周期的影響。

圖1　 SSCD1基因表達(dá)的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 SSCD1 gene expression detected by RT–PCR

2.2 sscd1–1點(diǎn)突變對(duì)其剪切的影響

從含有潮霉素的MS培養(yǎng)基中分別篩選出35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SSCD1正常基因和sscd1–1突變基因轉(zhuǎn)入sscd1–1突變體的純合株系各2個(gè)。轉(zhuǎn)基因植株中SSCD1基因表達(dá)水平的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SSCD1正?；虻谋磉_(dá)水平與sscd1–1突變基因的表達(dá)水平相比沒(méi)有明顯差別，而且其在長(zhǎng)、短日照條件下的表達(dá)水平基本相同。結(jié)合sscd1–1突變體沒(méi)有發(fā)生剪接位點(diǎn)改變這一研究結(jié)果，可以推斷sscd1–1剪接位點(diǎn)的突變沒(méi)有影響其剪切效率。

圖2　 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SSCD1基因表達(dá)的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Gene expression from SSCD1 driven by 35S promoter in RT–PCR detection

2.3 sscd1–1突變體內(nèi)源啟動(dòng)子對(duì)其表達(dá)的影響

從含有潮霉素的MS培養(yǎng)基中分別篩選出內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SSCD1正?；蚝蛃scd1–1突變基因轉(zhuǎn)入sscd1–1突變體的純合株系各2個(gè)。轉(zhuǎn)基因植株中SSCD1基因表達(dá)水平的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sscd1–1突變基因的表達(dá)水平相對(duì)于 SSCD1正?；虻娘@著降低，而且其在長(zhǎng)、短日照條件下的表達(dá)水平基本相同。這表明sscd1–1突變基因表達(dá)水平的降低是由內(nèi)源自身啟動(dòng)子的影響所致。

圖3　內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SSCD1基因表達(dá)的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 SSCD1 gene expression driven by the endogenous promoter in RT–PCR detection

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中分別構(gòu)建了由外源35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SSCD1正常基因和sscd1–1突變基因的表達(dá)載體，及由內(nèi)源自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 SSCD1正?；蚝蛃scd1–1突變基因的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入到sscd1–1突變體中。轉(zhuǎn)基因植株中SSCD1正常基因和sscd1–1突變基因表達(dá)水平的RT–PCR檢測(cè)結(jié)果表明，sscd1–1的點(diǎn)突變沒(méi)有影響其剪切效率，sscd–1–1突變基因表達(dá)水平的降低是由內(nèi)源自身啟動(dòng)子的影響所致。

在本研究中，SSCD1基因突變位點(diǎn)發(fā)生在一個(gè)外顯子右末端和內(nèi)含子左末端的分界點(diǎn)，即發(fā)生在左剪接位點(diǎn)（Left splicing junction），由G突變成A。在內(nèi)含子兩端分別有2個(gè)非常保守的堿基，左剪接位點(diǎn)為GT，右剪接位點(diǎn)為AG。從理論上講，內(nèi)含子在剪接位點(diǎn)的這種特征稱為 GT–AG規(guī)則（GT–AG role），剪接位點(diǎn)GT或AG的突變均可以阻止剪接出現(xiàn)［10］。因?yàn)閟scd1–1突變體沒(méi)有發(fā)生剪接位點(diǎn)改變［6］，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sscd1–1突變基因的表達(dá)水平相對(duì)于SSCD1正?；虻臎](méi)有明顯差別，所以，sscd1–1剪接位點(diǎn)突變沒(méi)有影響該基因的剪切效率。這一現(xiàn)象的原因有待研究。內(nèi)源自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的sscd1–1突變基因的表達(dá)相對(duì)于正常基因的顯著降低，表明sscd1–1突變基因表達(dá)水平的降低是由內(nèi)源自身啟動(dòng)子的影響所致。

真核基因表達(dá)調(diào)控在后基因組時(shí)代的研究中占有十分重要的地位，它將有助于進(jìn)一步闡明重要的生命現(xiàn)象，解釋細(xì)胞行為和疾病的發(fā)生機(jī)理［11］。本研究中擬南芥 sscd1–1點(diǎn)突變對(duì)其表達(dá)影響的研究可為植物中酪氨酸降解途徑的研究提供參考。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

Effects of Arabidopsis point mutation sscd1–1 on its expression

Huang Yi1， Han Chengyun3， Zhi Tiantian1， Ren Chunmei1，2*
（1.College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province， Changsha 410128， China； 3.College of Chemistry and Biology Engineering， Yichun University， Yichun， 336000， China）

Abstract:To investigate whether the reduction of the gene’s transcription level from mutated sscd1–1 in Arabidopsis is induced by splicing efficiency or its own promoter regulation， expression vectors of exogenous 35S promoter and endogenous promoter driven by normal SSCD1 gene and sscd1–1 mutated gene respectively were firstly constructed， then it was transformed into Arabidopsis sscd1–1 mutant， the expression of the sscd1–1 mutated gene was analyzed by RT–PCR. The results showed that its expression did not affected by 35S promoter driven by sscd1–1 mutated gene，however， the expression level of sscd1–1 mutated gene driven by its endogenous promoter was significantly decreased. Hence， the point mutation in sscd1–1 did not affect the splicing efficiency of the sscd1–1 gene， the reduction of sscd1–1 expression level was caused by its endogenous promoter.

Keywords:Arabidopsis； sscd1–1； promoter； gene expression

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007?1032（2016）03?0247?04

收稿日期：2015–09–29 修回日期：2016–04–14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30671121）；江西省科學(xué)技術(shù)廳青年科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目（20151BAB214011）

作者簡(jiǎn)介：黃弈（1990—），男，湖南株洲人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，435399406@qq.com；*通信作者，任春梅，博士，教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，rencm66@163.com