劉鑫泉，段小強，李映志，李 瑩，覃 芳，葉春海

(廣東海洋大學農(nóng)學院，廣東湛江 524088)

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菠蘿蜜果實成熟過程中香氣物質形成相關酶的活性變化

劉鑫泉，段小強，李映志*，李 瑩，覃 芳，葉春海*

(廣東海洋大學農(nóng)學院，廣東湛江 524088)

摘要[目的]分析菠蘿蜜果實成熟過程中香氣物質形成相關酶的活性變化，確定對菠蘿蜜果實香氣物質形成起關鍵性作用的酶，為菠蘿蜜栽培及育種提供理論支撐。[方法]以不同基因型的菠蘿蜜為材料，分別以亞油酸鈉、氫過氧化亞油酸鈉、乙醛和丁醇為底物，測定脂氧合酶(LOX)、氫過氧化物裂解酶(HPL)、醇脫氫酶(ADH)和醇?；D移酶(AAT)在果實成熟過程中的活性變化。[結果]在果實成熟過程中，LOX在果實成熟早期具有較高活性，在香氣物質合成的前期起主要作用；HPL主要參與菠蘿蜜果實中醛類香氣的形成；ADH活性水平較高；AAT活性變化在種質間存在差異，在果實成熟末期活性增強或略有下降。[結論]AAT是菠蘿蜜果實特征香氣物質形成的關鍵酶。

關鍵詞菠蘿蜜；脂氧合酶；氫過氧化物裂解酶；醇脫氫酶；醇?；D移酶

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)是桑科(Moraceae)木菠蘿屬(Artocarpus)植物，又稱“ 樹菠蘿”“木菠蘿”，被譽為“熱帶珍果”“熱帶水果皇后”[1-2]。其原產(chǎn)印度，是世界著名熱帶果樹，我國引入菠蘿蜜已有一千多年歷史，現(xiàn)在廣東、廣西、海南、云南、福建和四川南部以及臺灣均有栽培，以廣東雷州半島和海南種植最多[3]。

果實香氣能客觀地反映不同果實的風味特點和成熟程度，是與人類健康和營養(yǎng)密切相關的果實品質[4]。對菠蘿蜜果實香味品質進行研究，不僅可以揭示菠蘿蜜果實香氣形成機理，而且對改善菠蘿蜜香味品質并指導其育種實踐具有積極意義。果實香氣物質是由果實組織中一些前體物質在酶的作用下通過一定的生化途徑形成的。參與香氣合成的關鍵性酶主要有脂氧合酶(LOX)、氫過氧化物裂解酶(HPL)、乙醇脫氫酶(ADH)和醇?；D移酶(AAT)等。目前我國學者對這4種酶的研究較多[5-19]，然而在菠蘿蜜果實香氣的研究中，主要集中在果實香氣成分測定及特征香氣的分析等方面，而對于香氣合成的途徑、生理機制以及分子水平的研究鮮見報道。筆者對菠蘿蜜果實香味品質形成相關的LOX、HPL、ADH和AAT的活性進行測定，以期了解菠蘿蜜果實成熟過程中香味物質代謝相關酶的活性變化規(guī)律，確定菠蘿蜜果實香味品質形成的主要貢獻酶，為進一步開展菠蘿蜜品質育種和栽培技術的研究提供理論支持。

1材料與方法

1.1材料菠蘿蜜均為廣東海洋大學農(nóng)學院收集的菠蘿蜜種質，包括13Bs、13Ds、13Ks和13Ls 4個菠蘿蜜品種。從各種質的同一植株上分別采集未成熟果實和八成熟果實，未成熟果立即采樣，八成熟果在室溫放置并分階段采樣。每個果實采3份果苞樣品，液氮速凍后，置于-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

4個不同成熟度分別為：成熟度I，果實未成熟，發(fā)育基本完成，果外無香氣，果實生硬，敲打聲音清脆；成熟度II，果實八成熟，果外有輕微香氣，果實未軟化，敲打聲音輕微沉悶；果實成熟度III，采后2 d，九成熟，果外有濃郁香氣，果肉開始軟化，敲打聲音沉悶；果實成熟度IV，采后4 d，完全成熟，果外有濃郁香氣，果實完全軟化，敲打聲音沉悶。

1.2方法

1.2.1LOX活性測定。參照Axelrod等[20]的方法，并加以改進。以10 mmol/L亞油酸鈉為酶反應底物，在研缽中加5 mL預冷的0.5 mol/L(pH 7.0)Tris-HCl緩沖液。稱取1.0 g 菠蘿蜜果肉，充分研磨，離心，上清液用于LOX 活性測定。酶活性的測定采用3 mL 反應體系，其中，亞油酸鈉母液100 μL，緩沖液2 700 μL，粗酶液200 μL。在室溫(25 ℃)下反應，于234 nm 處測定消光值。加酶液15 s 后開始計時，記錄1 min 內OD234的變化，酶活性以ΔOD234/(gFW·min) 表示，重復3 次。

1.2.2HPL活性測定。參照Vick[21]的方法，并加以改進。酶反應底物為氫過氧化亞油酸鈉，制備方法：10 mL蒸餾水，200 μL 10 mmol/L亞油酸鈉，400 μL LOX酶液(0.1 mg/mL硼酸緩沖液，pH 9.0)，底物30 ℃水浴2 h。在研缽中加4 mL預冷的提取液：150 mmol/L HEPES-KOH緩沖液(pH 8.0)，250 mmol/L山梨醇，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L MgCl2，l %(V/V)甘油，4% PVPP，0.1 mmol/L PMSF。稱取1.0 g 菠蘿蜜果肉，充分研磨，離心，上清液用于HPL活性測定。酶活性測定采用3.5 mL反應體系:2 mL分析緩沖液(150 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0；250 mmol/L山梨醇；10 mmol/L EDTA；10 mmol/L MgCl2)，反應底物液0.75 mL，1.6 mmol/L NADH 0.15 mL，0.1 mL ADH酶液(0.5 mg/mL硼酸緩沖液，pH 8.6)，粗酶液0.5 mL，反應溫度30 ℃，于340 nm下測定HPL活性。加酶液后15 s開始計時，記錄1 min內OD值變化，酶活性以△OD340/(gFW·min)表示，重復3次。

1.2.3ADH活性測定。參照Longhurst等[22]的方法，并加以改進。在研缽中加入4 mL預冷的提取液：100 mmol/L MES-Tris緩沖液(pH 6.5)，2 mmol/L DTT，1% PVP。稱取1.0 g 菠蘿蜜果肉，充分研磨，離心，上清液用于ADH活性測定。酶活性測定采用3 mL反應體系：2.4 mL MES-Tris緩沖液(pH 6.5)，0.15 mL l.6 mmol/L NADH，0.15 mL 80 mmol/L乙醛，0.3 mL粗酶液，反應溫度30 ℃，于340 nm下測定ADH活性。加酶液后15 s開始計時，記錄1 min內OD值變化，酶活性以 △OD340/(gFW·min)表示，重復3次。

1.2.4AAT活性測定。參考隋靜等[16]的方法，并加以改進。在研缽中加入7.5 mL預冷的蛋白提取液(0.5 mol/L Tris-HCL(pH 8.0)，0.1%(V/V)Triton X-100，0.3 mg/L PVPP)。稱取1.0 g 菠蘿蜜果肉，充分研磨，冰浴，離心，上清液用于AAT活性測定。酶活性測定采用DTNB比色法。反應液組成：2.5 mL MgCl2溶液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，其中含0.5 mmol/L MgCl2)，150 μL acetyl-CoA溶液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，其中含0.5 mmol/L acetyl- CoA)，50 μL丁醇溶液(0.5 mo l/L Tris-HCl，pH 8.0，其中含20 mmol/L丁醇)和150 μL酶提取液。將以上組分混合后置于35 ℃水浴15 min，然后添加100 μL 1 mmo l/L DTNB，在室溫下放置10 min，412 nm處比色，用不含酶提取液的反應液為空白，每樣品重復 3次，測定1 min內吸光度升高的數(shù)值，酶活性以 △OD412/(gFW· min)表示，重復3次。

2結果與分析

2.1菠蘿蜜果實成熟過程中LOX活性的變化由圖1可知，不同品種、不同成熟階段的LOX活性變化差異很大。在果實成熟第1階段到第2階段，所有品種的LOX活性均呈下降趨勢，其中，13Ds從0.121 △OD234/(gFW·min)下降到0.049△OD234/(gFW·min)，13Ks從0.130△OD234/(gFW·min)下降到0.065△OD234/(gFW·min)，分別下降了59%和50%，下降幅度較大，其余品種在此階段酶活性下降幅度相對較小。品種13Ks的LOX活性在成熟過程中逐漸降低，從0.130△OD234/(gFW·min)下降到0.037△OD234/(gFW·min)，下降了71%；13Ds的LOX活性則呈先下降后上升再下降的趨勢，且變化幅度較大；品種13Bs和13Ls均呈先下降后上升的趨勢，13Bs總體活性水平較高，13Ls總體活性水平較低?？傮w而言，LOX活性在果實成熟過程中呈下降趨勢，且在果實未成熟階段高于成熟階段。

圖1　菠蘿蜜果實成熟過程中LOX活性的變化Fig.1　Activity of lipoxygenase during jackfruit fruit-ripening

2.2菠蘿蜜果實成熟過程中HPL活性的變化由圖2可知，HPL活性變化在品種間存在很大差異。13Ds的HPL活性呈先下降后上升的趨勢，最低值出現(xiàn)在果實成熟的第3階段，為0.028△OD340/(gFW·min)，下降了63%。13Bs的酶活性在果實成熟的第2階段均略有上升，酶活性增加了46%，隨后下降了60%，在完全成熟階段則又上升了22%。13Ks的HPL活性變化趨勢與13Bs相似，也呈先上升后稍下降再上升的趨勢，且13Ks的HPL活性較13Bs 高。13Ls在果實成熟過程中酶活性逐漸降低。HPL的酶活性變化，除13Ls的逐漸降低外，其他品種在成熟過程中，均在果實成熟的第2階段(13Bs和13Ks)和完全成熟階段(13Ds)出現(xiàn)峰值。

圖2　菠蘿蜜果實成熟過程中HPL活性的變化Fig.2　Activity of hydroperoxidelyase during jackfruit fruit-ripening

2.3菠蘿蜜果實成熟過程中ADH活性的變化由圖3可知，ADH總體活性較高。13Ds的酶活性在果實成熟第1階段至第3階段從0.161△OD340/(gFW·min)上升到0.213△OD340/(gFW·min)，上升了32%，至成熟期下降了26%。13Ks的酶活性從0.098△OD340/(gFW·min)上升到0.121△OD340/(gFW·min)，上升了23%，接著下降了8%，后又上升了1%。13Bs的酶活性從0.137△OD340/(gFW·min)開始下降，至果實成熟第2階段達最低值0.136△OD340/(gFW·min)，下降了0.4%，隨后開始上升，至果實完全成熟時活性最高，為0.192△OD340/(gFW·min)，較最低值上升了41%。 13Ls從0.204△OD340/(gFW·min)開始下降，至果實成熟第3階段活性最低，為0.006△OD340/(gFW·min)，下降了97%，后一直處于較低的活性水平。

圖3　菠蘿蜜果實成熟過程中ADH活性的變化Fig.3　Activity of alcohol dehydrogenase during jackfruit fruit-ripening

2.4菠蘿蜜果實成熟過程中AAT活性的變化由圖4可知，13Bs的AAT活性從0.001 3△OD412/(gFW·min)上升到0.002 0△OD412/(gFW·min)，上升了53%，之后又下降到0.000 8△OD412/(gFW·min)，下降了60%，接著又上升到0.001 7△OD412/(gFW·min)，上升了113%。13Ks的酶活性呈先下降后連續(xù)上升的趨勢，AAT活性最小值均出現(xiàn)在果實成熟第2階段，為0.001 6△OD412/(gFW·min)，至果實成熟第4階段為0.002 0△OD412/(gFW·min)，上升了25%。13Ls的AAT活性呈先上升后下降的趨勢，13Ls的酶活性從0.001 7△OD412/(gFW·min)上升到0.002 3△OD412/(gFW·min)，上升了35%，后連續(xù)下降至0.000 7△OD412/(gFW·min)，下降了70%。僅13Ds的酶活性在果實成熟過程中持續(xù)降低，下降了57%。由此可知，AAT在不同品種果實成熟過程中酶活性變化存在一定的差異，但在果實成熟后期酶活性均有一定的增加。

圖4　菠蘿蜜果實成熟過程中AAT活性的變化Fig.4　Activity of alcoholacy ltransferases during jackfruit fruit-ripening

3結論與討論

該研究結果表明，LOX在4個菠蘿蜜品種(13Bs、13Ds、13Ks和13Ls)果實成熟過程的第1階段到第2階段活性均下降，且在13Ks品種成熟過程中活性逐漸降低，而在品種13Bs和13Ls中雖呈先下降后上升的趨勢，但在未成熟果實中的酶活性高于成熟果實，說明LOX活性在果實成熟過程中逐漸降低，這與李巖[23]在薄皮甜瓜中研究結果相似，說明LOX是菠蘿蜜果實香氣物質合成前期起主要作用的酶。

HPL活性在13Bs和13Ks果實成熟的第2階段出現(xiàn)峰值，而在13Ds的完全成熟階段出現(xiàn)峰值。HPL在脂氧合酶之后達到活性峰值，說明HPL催化LOX酶的產(chǎn)物——脂氫過氧化物形成短鏈醛和含氧酸，HPL是植物產(chǎn)生清香型香味的關鍵酶[24]。

相比于LOX和HPL，ADH活性總體較高。ADH在13Ds和13Ks品種中呈先上升后下降的趨勢，劉朝蓬等[24]測定了不同品種柿果實ADH活性，結果表明，ADH活性在不同品種中存在差異，但總體呈先上升后下降的趨勢。該研究中13Ls在果實成熟過程中活性持續(xù)下降，與品種13Ds和13Ks及劉朝蓬等[24]在柿果實中的研究結果不一致，而與許傳強等[25]在網(wǎng)紋甜瓜中的研究結果一致。由此可知，不同水果種類、相同種類水果不同品種之間ADH的活性存在不同的變化趨勢，很可能與果實的香氣類型有關。

AAT是果實酯類物質合成的關鍵酶。該研究中，不同品種、不同階段的AAT活性變化仍有差別。13Bs果實成熟過程中AAT活性呈先上升后下降至果實完全成熟階段再上升的變化趨勢，而13Ks活性變化均呈先下降后連續(xù)上升趨勢。AAT在果實成熟過程中的活性變化總體為上升趨勢。在前人對菠蘿蜜果實香氣成分的研究中，確定酯類香氣是菠蘿蜜果實的特征香氣[26]。因而，AAT在果實成熟后期增加，催化生成菠蘿蜜特征香氣的酯類物質含量增加。隋靜等[16]在對草莓果實成熟過程中香氣物質與AAT活性變化的研究中發(fā)現(xiàn)，AAT活性逐漸上升，且酯類香型草莓品種的AAT活性更高，與該研究結果一致，進一步證實AAT在酯類物質合成中的關鍵性作用。

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基金項目國家自然科學基金項目(31101506)；廣東省科技計劃項目(2013B020304004)。

作者簡介劉鑫泉(1988- )，男，河北唐山人，碩士研究生，研究方向：熱帶園藝作物遺傳育種。*通訊作者，李映志，教授，博士，碩士生導師，從事南亞熱帶果樹生物技術與育種研究；*通訊作者，葉春海，教授，博士，博士生導師，從事南亞熱帶果樹生物技術與育種研究。

收稿日期2016-03-30

中圖分類號S 667.8

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-141-03

Research on the Activity of Lipoxygenase, Hydroperoxide Lyase, Alcohol Dehydrogenase and Alcohol Acyl Transferases in Jackfruit Fruit-ripening

LIU Xin-quan，DUAN Xiao-qiang，LI Ying-zhi*, YE Chun-hai*et al

(Agricultural College, Guangdong Ocean University，Zhanjiang, Guangdong 524088)

Abstract[Objective]The key enzymerelated to the aroma formation in jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.) fruit was determined through the analysis of the activitychange of enzymesduring its fruit ripening, which could provide the theoretical support for its cultivation and breeding. [Method]The change in the activity of lipoxygenase, hydroperoxidelyase, alcohol dehydrogenase and alcohol acyl transferases during jackfruits’fruit ripeningwas tested based the linoleic acid, sodium hydroxide, sodium peroxide, linoleic acid, acetaldehyde and butanol being taken as a substrate respectively. [Result] During jackfruit fruit ripening, the activity of LOX was high at early period of fruit maturity and for aroma formation the major role of LOX was in the synthetic substance in early jackfruit growth period. HPL was mainly involved in the formation of aldehydes. The activity of ADH maintained at a high level. The activity of AAT existed difference among germplasm resources, it increased or slightly decreased at the end of fruit maturity period. [Conclusion]AAT is the critical enzyme in the formation of characteristic aroma of jackfruit fruit.

Key wordsJackfruit; Lipoxygenase; Hydroperoxide lyase; Alcohol dehydrogenase; Alcohol acyl transferases