李莉

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CD8+T細(xì)胞在CA16感染手足口病中的表達(dá)變化及潛在作用*

李莉①

【摘要】目的：對(duì)比分析15～24個(gè)月及2～5歲CA16感染的普通型與危重癥手足口?。╤and，footand mouthdisease，HFMD）患者外周血中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況，尋找發(fā)現(xiàn)與CA16致病有關(guān)的免疫病理因素。方法：收集2014年5-8月間昆明市兒童醫(yī)院感染科確診的兒童HFMD病例外周血標(biāo)本共72例，其中普通型32例，危重癥40例，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果：15～24個(gè)月普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞百分比略高于正常健康兒童參考值，而危重癥患者CD8+T細(xì)胞略低于正常參考值。此外，與正常參考值相比，2～5歲普通型及危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均減低，其中危重癥患者略低于普通型患者。結(jié)論：CA16感染后，不同年齡、不同病情的HFMD患者外周血中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)變化不太明顯，說(shuō)明CA16感染后，患者體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞基本能夠發(fā)揮正常的抗病毒免疫效應(yīng)。而在危重癥時(shí)，兩個(gè)年齡段患者CD8+T細(xì)胞百分比略低或減低，說(shuō)明CA16的持續(xù)性感染可能對(duì)機(jī)體CD8+T細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)生了影響，使其殺傷病毒效應(yīng)減低，這可能是CA16感染誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生的免疫病理因素之一。

【關(guān)鍵詞】CA16；CD8+T細(xì)胞；手足口?。蛔饔?/p>

云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014NS052）

①昆明市兒童醫(yī)院云南昆明650228

First-author’s address：Children’s Hospital of Kunming，Kunming 650228，China

病毒感染后機(jī)體內(nèi)部的天然免疫系統(tǒng)雖然能夠快速激活并誘導(dǎo)、招募適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抗病毒免疫效應(yīng)，但機(jī)體內(nèi)感染病毒的復(fù)制傳播能力仍在增加［1-3］。作為特異性殺傷病毒感染細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞，能在病毒感染后快速激活并清除病毒，極大地抑制體內(nèi)病毒的復(fù)制，但體內(nèi)殘存的病毒依然能夠逃避機(jī)體的免疫自穩(wěn)，造成體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性感染。這是由于CD8+T細(xì)胞在急性感染期快速清除病毒后，機(jī)體內(nèi)病毒載量已經(jīng)降低到機(jī)體無(wú)法識(shí)別的水平，此時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD8+T細(xì)胞受刺激減少、數(shù)量減低，僅有少量存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，而此時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還可能殘存少量未清除的病毒RNA。當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，患者疾病惡化時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的病毒很可能會(huì)再次發(fā)生復(fù)制，感染神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中少量CD8+T細(xì)胞無(wú)法全部快速識(shí)別并殺傷病毒感染細(xì)胞，最終促使患者出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎等，甚至威脅生命［4-6］。

柯薩奇病毒是微小核糖核酸病毒家族中的成員之一，是感染人類的重要腸道病原體。雖然大多數(shù)感染呈現(xiàn)亞臨床或輕度癥狀，但一些急性新生兒感染也常會(huì)導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡［7］。近年來(lái)暴發(fā)的兒童手足口?。℉and，footandmouthdisease，HFMD）， 柯 薩 奇 病 毒A16（Coxsackievirus16，CA16）就是主要致病病原體之一，5歲以下兒童均極易感染。作為柯薩奇病毒成員之一，CA16感染人體后，患者表現(xiàn)的臨床癥狀大多數(shù)較輕，能夠自行消退，但少數(shù)重癥病例也會(huì)發(fā)生病情惡化并致死的情況［8-13］。目前對(duì)于CA16急性感染期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD8+T細(xì)胞能否抑制殘留病毒RNA的再次活化或是導(dǎo)致免疫病理反應(yīng)的發(fā)生，或者還是同時(shí)參與保護(hù)機(jī)體及導(dǎo)致疾病還不明確。有研究顯示患者感染CA16，體內(nèi)的抗病毒抗體陽(yáng)性率增高，提示體液免疫參與了抗CA16的過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞免疫在抗CA16中的作用研究還相對(duì)較少［14-15］。由于CA16引發(fā)的重癥病例多表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，而CD8+T細(xì)胞又是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起主要?dú)《靖腥炯?xì)胞的免疫細(xì)胞，因此，本研究主要通過(guò)比對(duì)分析不同年齡段CA16感染的普通型、危重型HFMD患者外周血中CD8+T細(xì)胞的表達(dá)差異，尋找發(fā)現(xiàn)與疾病負(fù)擔(dān)加重有關(guān)的免疫因素，進(jìn)而為臨床準(zhǔn)確判斷并分析疾病提供可參考的理論依據(jù)［16］。

1　資料與方法

1.1一般資料根據(jù)衛(wèi)生部《手足口病診療指南》（2010年版）及《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識(shí)》（2011年版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取2014年5-8月昆明市兒童醫(yī)院感染科確診的CA16感染的手足口病病例外周血標(biāo)本共72例，其中普通病例共36例，15～24個(gè)月及2～5歲年齡段患者為16例及20例；危重癥病例共36例，15～24個(gè)月及2～5歲年齡段患者為16例及20例［17-18］。

1.2試劑及主要儀器試劑：采用BD公司生產(chǎn)的檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的試劑盒BDMultitest6-color TBNKReagent。該試劑盒中包括識(shí)別富集不同淋巴亞群（T細(xì)胞、B細(xì)胞以及NK細(xì)胞）的抗體，其中包括識(shí)別NK細(xì)胞的抗體（CD16和CD56PE）、識(shí)別T細(xì)胞的抗體（CD3FITC）、為淋巴細(xì)胞群設(shè)置的CD45PerCP-Cy?5.5、檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的CD4 PE-Cy?7、識(shí)別B淋巴細(xì)胞的CD19APC以及識(shí)別CD8+T細(xì)胞的CD8APC-Cy7。主要檢測(cè)儀器：BD FACSCanto?，使用BDFACSCanto?軟件進(jìn)行參數(shù)設(shè)置、質(zhì)控監(jiān)測(cè)以及數(shù)據(jù)分析。

1.3方法流式細(xì)胞儀檢測(cè)：采集靜脈血2～3mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作說(shuō)明書(shū)，分別向已編好號(hào)的試管中加入20μL六色單克隆抗體和同型對(duì)照，分別向試管中加入混勻的100μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育15～20min；加入已稀釋好的溶血素600μL混勻避光室溫溶血8～10min，上機(jī)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用PEMS3.1軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，由于本研究中同一年齡段普通型、危重癥的病例數(shù)各不相同，因此采用中位數(shù)以及5%～95%置信區(qū)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.115～24個(gè)月普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況比較根據(jù)中位數(shù)及95%置信區(qū)間結(jié)果顯示（圖1），普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞亞群在外周血中所占百分比為20.365%，5%～95%置信區(qū)間為24.265%～37.4375%，略高于正常健康兒童參考值（20%，11%～32%），而危重癥患者CD8+T淋巴細(xì)胞亞群在外周血中所占百分比為19.29%，5%～95%置信區(qū)間為11.2985%～38.901%略低于正常參考值。說(shuō)明此年齡段患者感染CA16初期癥狀較輕，其體內(nèi)CD8+T細(xì)胞受病毒刺激后能夠擴(kuò)增，但不明顯；當(dāng)患者病情危重時(shí)，CD8+T細(xì)胞數(shù)量略微減低，說(shuō)明病毒感染后期，其體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的免疫活性很可能受到病毒復(fù)制的影響，但影響不大。總的來(lái)說(shuō)，該年齡段的普通及危重癥患者感染CA16后，其體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞均具有免疫活性，但活性不高，推測(cè)在抗CA16感染過(guò)程中，CD8+T細(xì)胞雖能發(fā)揮正常的抗病毒免疫反應(yīng)，但抗病毒作用不強(qiáng)，這很可能是病毒能夠反復(fù)感染、無(wú)法從人體內(nèi)完全清除的原因。

圖1　15~24個(gè)月普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況

2.22～5歲普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況比較根據(jù)中位數(shù)及95%置信區(qū)間結(jié)果顯示（圖2），普通型患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比為21.11%，5%～95%置信區(qū)間為20.09%～38.985%；危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比為20.86%，5%～95%置信區(qū)間為14.3185%～40.2085%，與正常健康兒童參考值（24%，14%～33%）相比，普通及危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均減低，其中危重癥患者略低于普通型患者，說(shuō)明該年齡段不同患者體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞的免疫活性均減低，尤其在危重癥時(shí)更低。另外，與上述15～24個(gè)月普通型患者CD8+T細(xì)胞略高于正常參考值相反的是，該結(jié)果中2～5歲普通型患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞卻低于正常參考值。一般來(lái)說(shuō)，兒童淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的變化與年齡密切相關(guān)。正常情況下，2～5歲正常兒童CD8+T細(xì)胞的參考值高于15～24個(gè)月兒童的參考值，即隨年齡增高，CD8+T細(xì)胞的表達(dá)是升高的。但該結(jié)果顯示2～5歲普通型HFMD患兒的CD8+T細(xì)胞減低，僅略高于15～24個(gè)月兒童的正常參考值，這說(shuō)明年齡較大的HFMD兒童的CD8+T細(xì)胞略高于年齡較小的兒童，雖然升高幅度不高，但也可以說(shuō)明CA16感染的普通型HFMD患者的CD8+T細(xì)胞表達(dá)基本正常，其免疫學(xué)活性受到較小的影響。除此之外，與上述15～24個(gè)月危重癥患者相似的是2～5歲危重癥患者體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞減低，且減低較明顯，提示這一年齡段患者病情危重時(shí)，其體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)很可能受到病毒復(fù)制機(jī)制的干擾或抑制，這也很可能是這一年齡段患者急性感染期發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的原因，即體內(nèi)清除病毒的主要免疫細(xì)胞CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及活性減低。

圖2　2~5歲普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況

3　討論

大多數(shù)研究表明，CD8+T細(xì)胞在應(yīng)對(duì)不同病毒感染時(shí)其免疫效應(yīng)是多樣化的。急性感染時(shí)，對(duì)病毒具有特異性殺傷作用的CD8+T細(xì)胞會(huì)被迅速激活并大量擴(kuò)增，同時(shí)，體內(nèi)其他免疫調(diào)節(jié)因素也會(huì)同時(shí)發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)。當(dāng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)達(dá)到頂峰時(shí)，90%的急性效應(yīng)CD8+T細(xì)胞會(huì)死亡，其余的CD8+T細(xì)胞會(huì)分化為記憶性T細(xì)胞，存在于人體內(nèi)。此時(shí)，人體內(nèi)的病毒感染細(xì)胞大量被殺死，但病毒RNA還殘留于人體內(nèi)，對(duì)機(jī)體造成持續(xù)性的慢性感染［19-22］。

本研究對(duì)比了不同年齡段普通型和危重癥患者外周血CD8+T細(xì)胞的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論年齡大小，危重癥患者的CD8+T細(xì)胞都低于普通型患者，這很可能與病毒感染的急性和持續(xù)性有關(guān)。CD8+T細(xì)胞一般會(huì)在急性感染期迅速擴(kuò)增，清除體內(nèi)不斷復(fù)制的病毒，而當(dāng)病毒持續(xù)感染時(shí)，體內(nèi)抗病毒的關(guān)鍵免疫細(xì)胞很可能會(huì)是其他免疫細(xì)胞，如B細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞。對(duì)于危重癥患者來(lái)說(shuō)，病毒的持續(xù)性感染是疾病負(fù)擔(dān)加重的主要原因，此時(shí)，CD8+T細(xì)胞減低很可能與感染的病毒類型以及機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。

此外，本研究不僅反映了HFMD患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平，也可反映出CA16對(duì)機(jī)體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的免疫刺激活性較低，在15～24個(gè)月普通型患者中，CD8+T細(xì)胞略高，而在2～5歲普通型患者中略低。一般來(lái)說(shuō)，患者在感染初期癥狀較輕，但屬于急性感染，此時(shí)CD8+T細(xì)胞應(yīng)該處于迅速擴(kuò)增清除病毒的狀態(tài)，但本結(jié)果中未觀察到CD8+T細(xì)胞的大量擴(kuò)增。這一方面說(shuō)明，CA16感染初期，由于其致病性低及對(duì)患者造成的疾病負(fù)擔(dān)較輕，因此機(jī)體特異性的CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增不明顯。另一方面，CD8+T細(xì)胞在2～5歲普通型患者中減低，很可能是該年齡段患者容易感染并發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的原因，具體致病機(jī)制可能與感染后期中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少以及病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中潛在復(fù)制、持續(xù)性感染有關(guān)。

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The Potential Function of Varied Expression of CD8+T Cells Against CA16

LI Li.
Medical Innovationof China，2016，13（13）：006-009

【Abstract】Objective：TocompareandanalyzetheexpressionofCD8+Tlymphocytessubsetinperipheral bloodindifferentchildrenwithhand，footandmouthdisease（HFMD）infectedbyCA16betweentheagegroups of15to24monthsand2to5years，whichmightdisclosetheimmunopathologicfactorsrelatedtothepathogenicity ofCA16.Method：72caseswithHFMDofperipheralbloodsampleswerecollectedinthedepartmentofinfectious diseaseinKunmingChildren’sHospitalfromMaytoAugust2015，whichincluded32mildcasesand40critical cases.TheexpressionofCD8+Tlymphocytesubsetsinpatients’peripheralbloodsampleweredetectedbytheflow cytometry.Result：ThepercentageofCD8+Tlymphocyteinmildpatientsfrom15to24monthswasslightlyhigher thanthereferencevalueofCD8+Tcellsinnormalhealthychildren，whilethepercentageofCD8+Tlymphocytein criticalcaseswasslightlylowerthanthenormalreferencevalue.Inaddition，comparedwiththereferencevalue ofCD8+Tcellsinnormalhealthychildrenwithin2to5yearsold，theexpressionofCD8+Tcellswasdecreasedin bothofmildandcriticalpatientswithin2to5yearsold，andthedecreaserelativelyobviousincriticalpatients. Conclusion：Inthesetwoagegroupsbetween15to24monthsand2to5years，theexpressionofCD8+Tcellsin differentpatientsinfectedbyCA16variedlessobviously，whichmightcanbeexplainedthattheenoughquantity ofCD8+Tcellsshouldplayitsimmuneeffectonkillinginfectedcellsasnormal.Forthereasonoftheexpressionof CD8+Tcellsisslightlylowerordecreasedincriticalcasesofthesetwoagegroups，itmaybeassociatedwiththe persistenceinfectionofCA16affectedtheexpressionofCD8+Tcells，whichattributetothelowerkillingeffectof CD8+Tcells.Itmightbeoneoftheimmunopathologicfactorsresultedintheoccurrenceofneurologicalcomplication inducedbyCA16.

【Key words】Coxsackievirus16；CD8+Tcells；Hand，footandmouthdisease（HFMD）；Function

*基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃青年項(xiàng)目（2012FD100）；

通信作者：李莉

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.002

收稿日期：（2015-12-30）（本文編輯：周亞杰）