付瑞，王洪，王淑菁，李曉波，王吉，衛(wèi)禮，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

?

兔出血癥病毒抗體的實驗室檢測能力驗證結果評價

付瑞，王洪，王淑菁，李曉波，王吉，衛(wèi)禮，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 通過兔出血癥病毒抗體檢測能力驗證計劃，了解實驗動物檢測機構檢驗能力，提高實驗動物質(zhì)量檢測水平。方法 按照CNAS批準的能力驗證方案，通過篩選血清制備樣品，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗合格，作為能力驗證樣品。采用隨機編號，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導書。在規(guī)定時限提交檢驗報告和原始記錄復印件，其結果與樣品預檢結果一致的判為滿意結果，不一致或未能提交結果的判為不滿意結果。結果 來自14個省市自治區(qū)的20個實驗室報名參加本次比對實驗，均在規(guī)定時間內(nèi)反饋了檢測結果，17個實驗室檢測結果為合格或優(yōu)秀，占參加比對實驗室的85%。在20個實驗室中，14個實驗室采用了酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）方法，6個實驗室采用血凝抑制實驗（HAI）方法。結論 全國各實驗動物檢測機構兔出血癥病毒抗體總體檢測能力較高，實施能力驗證計劃能夠反映實驗室的檢測水平。

【關鍵詞】兔出血癥病毒；能力驗證；酶聯(lián)免疫吸附實驗；血凝抑制實驗

兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種急性、致死性傳染病，對易感兔群的致病率達90%，病死率可高達100%，是對兔的一種毀滅性傳染?。?］。兔出血癥病毒是實驗動物必須排除的病源微生物之一。

實驗動物國家標準中規(guī)定采用血凝抑制（hemagglutination inhibition assay，HAI）的方法對實驗用兔中兔出血癥病毒抗體進行檢測［2］，基礎級兔如果接種疫苗，HAI抗體效價應大于1∶10，同時免疫抗體合格率［（被檢動物抗體陽性數(shù)/被檢動物總數(shù)）×100%］大于等于70%判定該兔群免疫合格；清潔級和SPF兔HAI抗體效價應小于等于1∶10。該檢測方法操作較為繁瑣，對操作人員的能力要求較高。

為了提高國內(nèi)實驗動物質(zhì)量檢測實驗室的整體水平，中國食品藥品檢定研究院組織實施了全國范圍實驗動物檢測實驗室間兔出血癥病毒抗體檢測能力比對，目的是要了解參加實驗室在本檢測項目上的技術水平和能力，分析考察實驗室間差異，發(fā)現(xiàn)并解決檢驗中存在的問題，促進各實驗室加強質(zhì)量管理，提高檢測水平。

1　材料與方法

1.1 樣品來源

強陽性樣品和弱陽性樣品篩選自北京地區(qū)實驗動物監(jiān)督檢驗所收集的基礎級兔血清；陰性樣品采自中國食品藥品檢定研究院實驗動物生產(chǎn)供應室提供的SPF級家兔。

1.2 組織及實施單位

本次能力驗證代碼為“NIFDC-PT-021”，由中國食品藥品檢定研究院組織并實施。

1.3 參加單位

本次比對面向全國從事實驗動物檢測工作的實驗室，報名參加本次比對實驗的共20個實驗室，所有實驗室均在截止日期前反饋結果。

1.4 樣品的制備與分裝

1）樣品的篩選及檢定：收集來自北京地區(qū)實驗動物監(jiān)督檢驗的基礎級兔血清共210份，按照實驗動物國家標準［3］進行檢驗，分別測定 HAI抗體效價；采用心臟采血的方法采集SPF家兔血，8000 r/ min離心10 min，收集SPF家兔血清共50 mL，按照上述方法進行檢驗，測定其HAI抗體效價。

2）強陽性樣品的制備與分裝：集中經(jīng)檢驗HAI抗體效價≥1∶80的兔血清，混勻后進行分裝，每支300 μL，共分裝100支。

3）弱陽性樣品的制備與分裝：集中經(jīng)檢驗HAI抗體效價為1∶20的兔血清樣品，混勻后進行分裝，每支300 μL，共分裝100支。

4）陰性樣品的制備與分裝：集中經(jīng)檢驗HAI抗體效價≤1∶10的SPF兔血清，混勻后進行分裝，每支300 μL，共分裝100支。

1.5 樣品穩(wěn)定性測試［4］

從分裝的強陽性、弱陽性和陰性樣品中各取5支，分別放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于放置的0、24、48、72 h和 96 h分別各取一支，凍存于-20℃，作為穩(wěn)定性樣品，采用血凝抑制法分別測定各樣品HAI抗體效價。

1.6 樣品均一性測試

從分裝的強陽性、弱陽性和陰性樣品中各隨機抽取8支，采用血凝抑制法分別測定各樣品HAI效價，以確定分裝各樣品的均一性。

1.7 樣品發(fā)放及結果反饋

采用隨機編號的方法分別對各樣品進行編號，編號規(guī)則為：CB-VIR-隨機編號。每個參加實驗室提供3份兔血清樣品，每份1管，裝量300 μL，性狀為透明澄清液體。樣品采用內(nèi)外雙層包裝冷鏈運輸，內(nèi)層為封口膜密封，外層用透明塑料自封袋包裝。

各實驗室在收到樣品時，首先確認樣品是否完好，并填寫《被測物品接收狀態(tài)確認表》。檢測實驗室于15個工作日內(nèi)完成檢測工作，并填寫《實驗兔血清中兔出血癥病毒抗體檢測結果報告單》，同時將《被測物品接收狀態(tài)確認表》、《實驗兔血清中兔出血癥病毒抗體檢測結果報告單》、原始記錄復印件和正式檢測報告返回能力驗證組織單位（中國食品藥品檢定研究院）。

1.8 結果評價原則［5］

本次檢測為定性檢測，結果以兔出血癥病毒抗體陽性或陰性來表示，每個參加單位分發(fā)3個樣本，樣本經(jīng)比對實施機構（中國食品食品藥品檢定研究院）檢測已經(jīng)確定陽性或陰性，參加比對的實驗室對發(fā)放的樣本按照國標進行定性檢測，最后將檢測結果與實施機構的結果進行比較確認是否相符。

本次計劃以下列準則評價參加者的結果，即：實驗室結果與標準結果完全一致，即判定為優(yōu)秀；強陽性結果以及陰性結果與標準結果一致，弱陽性結果與標準結果不一致，即判定為合格；強陽性結果或者陰性結果與標準結果不一致，即判定為不合格；未按時限反饋結果，即判定為不合格。

2　結果

2.1 參加實驗室分布

全國14個省市共20家實驗室報名參加本次能力驗證計劃，實際參加20家，其中省級實驗動物質(zhì)檢系統(tǒng)實驗室15家（含國家質(zhì)檢中心），高校以及企業(yè)內(nèi)部實驗室3家，省級疾病預防控制中心實驗室和省級藥檢院實驗室各1家，20家實驗室均反饋了結果。

2.2 樣品穩(wěn)定性檢測結果

取強陽性樣本、弱陽性樣本和陰性樣本各5份，于37℃下放置0、24、48、72 h和96 h，測定其HAI抗體效價，均應符合標準（見表1）。

2.3 樣品均一性檢測結果

將強陽性樣本、弱陽性樣本和陰性樣本分別分裝成100份，各取8份進行檢測，強陽性樣本RHDV抗體HAI效價應≥1∶80，弱陽性樣本RHDV抗體HAI效價應≥1∶20并＜1∶80，陰性樣本RHDV抗體HAI效價應≤1∶10（見表2）。

2.4 各實驗室結果分析

參加驗證的20家實驗室，全部反饋了實驗結果，反饋實驗結果的17家單位均符合預期，大部分實驗室的原始記錄比較詳細明了，檢測結果真實可信，效果比較滿意。滿意率為85%（見表3）。

表1　樣品37℃穩(wěn)定性試驗結果Tab.1 Stability of the samples at 37℃

表2　樣品均一性檢測結果Tab.2 Detection of the uniformity of the samples

表3　實驗室比對實驗結果分析Tab.3 Comparative analysis of the results of different laboratories

3　討論

由于至今還沒有適于RHDV增殖的敏感細胞，使得RHDV的檢測成為實驗動物質(zhì)量控制中的一個難點。RHDV只和人紅血球發(fā)生凝集反應，與兔或其他哺乳動物紅血球均無凝集反應。這是因為人紅血球上存在ABH抗原，而其他哺乳動物均無此抗原［6］。用人“O”型血球和RHDV抗原進行的血凝抑制試驗仍是目前經(jīng)常采用的病毒抗體診斷方法，但是有些RHDV的病毒株在通常溫度下沒有血凝反應，而且血凝抑制實驗操作較為繁雜，受實驗人操作手法影響較大。而酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）在某種程度上比血凝抑制實驗靈敏度更高，更易于標準化。

本次能力驗證共有20個實驗室參加，全部實驗室均反饋結果，僅有3個實驗室為不合格結果，合格率達到85%。其中12個實驗室僅采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，2個實驗室同時采用了ELISA和血凝抑制（HAI）兩種方法，在14個采用ELISA檢測方法的實驗室中，12個實驗室采用進口試劑盒（XpressBio公司），結果均為優(yōu)秀；1個實驗室未注明試劑盒來源，結果為優(yōu)秀；1個實驗室采用國產(chǎn)試劑盒，結果為不合格。其余6個實驗室均采用HAI方法，其中3個實驗室為優(yōu)秀結果。其中14個采用ELISA檢測方法的實驗室對于弱陽性樣品檢測結果均為陽性，8個采用了HAI檢測方法的實驗室對弱陽性樣品檢測結果5個為陽性。分析表明ELISA檢測方法具有更好的靈敏度。

參考文獻

［1］ 田克恭，賀爭鳴，劉群，等.實驗動物疫病學［M］.中國農(nóng)業(yè)出版社，2015.

［2］ GB/T14926.21-2008［S］.2008.

［3］ GB/T14926.54-2001［S］.2001：15-18.

［4］ 中國合格評定國家認可委員會.能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南［S］.CNAS-GL03，2006.

［5］ 中國合格評定國家認可委員會.能力驗證結果的統(tǒng)計處理和能力評價指南［S］.CNAS-GL02，2006.

［6］ Ruvoen-Clouet N，Ganiere JP，André-Fontaine G，et al.Binding of rabbit hemorrhagic disease virus to antigens of the ABH histoblood group family［J］.J Virol.2000，74（24）：11950-11954.

Evaluation of the proficiency of laboratories for detection of rabbit hemorrhagic disease virus antibody

FU Rui，WANG Hong，WANG Shu-jing，LI Xiao-bo，WANG Ji，WEI Li，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective Through the detection of rabbit hemorrhagic disease virus（RHDV）antibody，to investigate the capacity of experimental animal quality control laboratories，so as to improve their detection proficiency.Methods According to the program approved by CNAS，the screened samples were numbered randomly and tested for their stability and homogeneity.The random samples were issued to the participant laboratories with the Standard Operation Procedure （SOP）.The participant laboratories must submit the test reports and original records in time.The feedback results were judged by the rate of concordance with the anticipated results.Results Twenty laboratories from 14 provinces were enrolled in the evaluation，and all of them submitted detection results on time.ELISA methods were used in 14 laboratories，and hemagglutination inhibition（HAI）assay was used in 6 laboratories.The results of 17 laboratories were marked as pass or excellent，with a rate of pass of 85%.Conclusions The ability for detection of RHDV antibody in animal test laboratories in China is high.The implementation of capacity testing can reflect the level of quality control laboratories.

【Key words】Rabbit hemorrhagic disease virus；Proficiency testing；ELISA；Hemagglutination inhibition assay，HAI

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0188-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.014

［基金項目］國家科技支撐計劃（2015BAI07B02）：實驗用動物病原分子生物學快速檢測新技術研究與應用。

［作者簡介］付瑞（1978-），男，副研究員，研究方向：實驗動物病毒學。Email：furui78@126.com

［通訊作者］岳秉飛（1960-），研究員；研究方向：實驗動物學；Email：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13