徐偉，晁天柱，劉麗均，李凱，肖君華*

（1.東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620；2.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615）

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研究報(bào)告

小鼠冷凍胚胎和精子SNP遺傳鑒定方法的建立

徐偉1，晁天柱1，劉麗均2，李凱1，肖君華1*

（1.東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620；2.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615）

【摘要】目的 建立小鼠冷凍胚胎和精子SNP（single nucleotide polymorphism）分型方法，用于冷凍胚胎和精子快速遺傳鑒定方案。方法 以中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心）提供的小鼠冷凍胚胎和精子為樣本，采用全基因組擴(kuò)增技術(shù)和PCR-LDR分型技術(shù)建立小鼠冷凍物SNP遺傳鑒定方法。結(jié)果 全基因組擴(kuò)增技術(shù)能大幅度增加冷凍胚胎樣本的DNA總量；PCR-LDR分型方法適用于小鼠全基因組45個(gè)SNPs的分型；分型確定C57BL/6，BALB/c，F(xiàn)VB/NJ等胚胎和精子各10種近交系，SNP位點(diǎn)信息與測(cè)序結(jié)果一致；小鼠冷凍胚胎個(gè)數(shù)與SNPs檢出個(gè)數(shù)成正比，當(dāng)胚胎數(shù)達(dá)到12以上時(shí)SNP檢出率100%。結(jié)論 實(shí)現(xiàn)近交系小鼠冷凍胚胎和精子快速SNP基因分型及遺傳質(zhì)量鑒定。

【關(guān)鍵詞】小鼠；冷凍胚胎和精子；全基因組擴(kuò)增；PCR-LDR分型；SNP遺傳鑒定

模式動(dòng)物小鼠已建立超過(guò)32 000個(gè)品系［1］，美國(guó)［2］、歐洲［3］和日本［4］先后建立冷凍胚胎和精子保存庫(kù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的連續(xù)繁殖方式，以保護(hù)、保存小鼠這一重要遺傳資源，并預(yù)防小鼠資源流失和重復(fù)性工作［5］。美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室具有世界上最豐富的小鼠資源和最大的冷凍胚胎保存庫(kù)［6］，我國(guó)也先后成立國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心和國(guó)家遺傳工程小鼠資源庫(kù)［7］，并建立了大型低溫冷凍庫(kù)。低溫保存過(guò)程中，冷凍物遺傳特征的穩(wěn)定性是影響小鼠遺傳質(zhì)量的重要影響因素之一，但國(guó)內(nèi)尚缺乏小鼠冷凍胚胎和精子的遺傳鑒定方法。主要是因?yàn)闃颖居邢耷沂终滟F，相應(yīng)的DNA量又遠(yuǎn)低于常規(guī)的個(gè)體，因此就需要對(duì)少量的DNA進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)SNP遺傳鑒定。

遺傳質(zhì)量鑒定旨在保持實(shí)驗(yàn)小鼠的遺傳穩(wěn)定性，檢測(cè)小鼠品系是否發(fā)生隨機(jī)的遺傳漂變、遺傳突變和基因污染等現(xiàn)象，以確保被檢測(cè)的品系符合其本身的要求［8］。迄今，針對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠個(gè)體的遺傳檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及同功酶和DNA分子標(biāo)記檢測(cè)方法［9］，其中DNA分子標(biāo)記檢測(cè)法已成為趨勢(shì)［10-13］。DNA分子標(biāo)記檢測(cè)法包括長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)遺傳擴(kuò)增多態(tài)性、STR、SB-ASA、SNP等。雖然STR具有雜合度高、多態(tài)性好、易于檢測(cè)和利于實(shí)現(xiàn)分型標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，并應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、有關(guān)疾病基因的定位、法醫(yī)學(xué)親子鑒定等領(lǐng)域，但是STR在分型中側(cè)翼序列易發(fā)生變異，且不適用于大規(guī)?；蚪M研究［11］。因此，具有高通量、可自動(dòng)操作、費(fèi)用相對(duì)低廉的第三代遺傳標(biāo)記SNP被廣泛應(yīng)用于小鼠的遺傳檢測(cè)［14］。

基于高溫連接酶的連接檢測(cè)反應(yīng) （ligase detection reaction，LDR），是一種高通量靈敏度與特異性的SNP分型方法［15-18］。本研究以上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的近交系小鼠冷凍胚胎和精子為樣本，采用直接裂解法、全基因組擴(kuò)增技術(shù)和 PCRLDR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)近交系小鼠冷凍物基因組上45個(gè)SNPs的基因分型和遺傳質(zhì)量鑒定。

1　材料與方法

1.1 DNA抽提及全擴(kuò)

SPF級(jí)C57BL/6、BALB/c、SJL/J、NOD、DBA1、Scid、EG、KKTA、FVB/NJ、ACA小鼠冷凍胚胎和C57BL/6、NOD、129S3、C3H-Scid、C3H/ORL、MRL/ MPJ、NOD-Scid、Tuskuba、B10A、Scid-BG精子由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心）【SCXK（滬）2012-0002】提供，每個(gè)品系各取兩只，雌鼠周齡4周、雄鼠周齡10周，體重20～30 g，冷凍胚胎和精子均來(lái)自以上小鼠，且其冷凍時(shí)間為一、二周或一、二月。冷凍精子的DNA提取采用動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司），操作步驟依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。冷凍胚胎的細(xì)胞裂解和DNA擴(kuò)增，顯微鏡下挑出二細(xì)胞期冷凍胚胎（19～40個(gè)），清洗后加入1.5 μL裂解液 （200 mmol/L KOH，50 mmol/L二硫蘇糖醇）65℃ 10 min，添加1.5 μL中和液（900 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，300 mmol/L KCl，200 mmol/L HCl）［19］4℃靜置1 h后，DNA擴(kuò)增采用 illustraTMReady-To-GoTMGenomiPhiTMV3（GE Healthcare）全基因組擴(kuò)增試劑盒，操作步驟依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以1%的瓊脂糖凝膠電泳確定DNA質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)MGI數(shù)據(jù)庫(kù)中C57BL/6、FVB、BALB/c、DBA1、NOD等10個(gè)近交系品系中已知的SNP遺傳標(biāo)記，挑選各品系間存在差異的45個(gè)SNPs位點(diǎn)，建立PCR-LDR分型方案。針對(duì)各SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物和探針。用Primer3在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物 （http：// frodo.wi.mit.edu/primer3/）［20］，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。設(shè)計(jì)的探針［21］由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 測(cè)序反應(yīng)

PCR產(chǎn)物純化后均用雙脫氧終止法進(jìn)行測(cè)序（美國(guó)ABI 3730XL測(cè)序儀），測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同。所有測(cè)序反應(yīng)由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.4 PCR-LDR

PCR反應(yīng)終濃度體系為 （15 μL）包括10× PCR buffer 1.5 μL，dNTPs 1.5 μL，45對(duì)引物分為4組，每組分別為12、11、10、12對(duì)1.5 μL，BSA 0.2 μL，HotStarTaq DNA polymerase 1 μL，DEPC水7.8 μL，DNA模版1.5 μL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min 30 s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異性。

LDR反應(yīng)體系終濃度 （5 L）包括10×ligase buffer（NEB）0.5 L，探針各0.05 mol/L，TaqDNAigase 1 unit，PCR產(chǎn)物10 ng/L，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照LDR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性2 min；94℃變性30 s，50℃復(fù)性延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。

LDR連接產(chǎn)物用標(biāo)準(zhǔn)5%變性PAGE膠進(jìn)行電泳通過(guò)ABI 377A測(cè)序儀進(jìn)行（Applied Biosystems）數(shù)據(jù)采集與分析使用GeneScanTM 672和GeneMapper軟件（Applied Biosystems）。

2　結(jié)果

2.1 小鼠冷凍精子、胚胎全基因組擴(kuò)增DNA電泳

圖1表示10種近交系小鼠冷凍精子抽提DNA在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)結(jié)果，10個(gè)泳道對(duì)應(yīng)著不同的品系，從電泳圖譜可以看出，DNA條帶清晰明亮、無(wú)降解現(xiàn)象，可保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。圖2表示胚胎全基因組擴(kuò)增DNA在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)結(jié)果。圖中DNA的條帶大小范圍在2027～21 226 bp，且條帶清晰。

圖1　10種小鼠冷凍精子全基因組擴(kuò)增DNA電泳結(jié)果Note.Lane 1，2，3，4，5，6，7，8，9 and 10 represent the electrophoresis of samples of frozen sperm whole genome DNA amplification of C57BL/6，NOD，129S3，C3H-Scid，C3H/ORL，MRL/MPJ，NOD-Scid，Tuskuba，B10A and Scid-BG mice.M：MarkerFig.1 The electrophoresis results of whole genome DNA amplification of 10 kinds of mouse sperms.

圖2　10種小鼠冷凍胚胎全基因組擴(kuò)增DNA電泳結(jié)果Note.Lane 1，2，3，4，5，6，7，8，9 and 10 represent the electrophoresis of samples of frozen embryo whole genome DNA amplification of C57BL/6，BALB/c，SJL/J，NOD，DBA1，Scid，EG，KKTA，F(xiàn)VB/NJ and ACA mice.M：MarkerFig.2 The electrophoresis results of whole genome DNA amplification of 10 kinds of mouse frozen embryos

2.2 SNP位點(diǎn)驗(yàn)證

測(cè)序結(jié)果表明，NCBI和MGI數(shù)據(jù)庫(kù)中近交系小鼠 C57BL/6、BALB/c、SJL/J、NOD、DBA1、Scid、EG、KKTA、FVB/NJ、ACA、129S3、C3H-Scid、C3H/ ORL、MRL/MPJ、NOD-Scid、Tuskuba、B10A和 Scid-BG 45個(gè)SNPs遺傳標(biāo)記的基因型與PCR-LDR分型結(jié)果一致，未出現(xiàn)雜峰和雙峰，說(shuō)明小鼠的來(lái)源都是純系。以品系C57BL/6、FVB冷凍胚胎第Ⅱ組 rs 13477094位點(diǎn)為例，該處對(duì)應(yīng)的PCR-LDR分型結(jié)果基因型分別是G、C，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后（圖3）箭頭處標(biāo)出，測(cè)序結(jié)果與分型結(jié)果一致。

圖3　rs 13477094位點(diǎn)測(cè)序和PCR-LDR Note.A represents the sequencing chart of frozen embryos of C57BL/6 mouse strain in rs13477094 point.B represents the sequencing chart of VB mouse strain frozen embryos in rs13477094 point.C represents 377　electrophoretogram of G homozygosis C57BL/6 mouse strain frozen embryos in rs13477094 point.D represents 377 electrophoretogram of C homozygosis FVB mouse strain frozen embryos in rs13477094 point.Fig.3 The sequencing and PCR-LDR results of rs 13477094 points

2.3 四組標(biāo)準(zhǔn)PCR-LDR方案

圖4是以FVB為模版的四組多重PCR-LDR結(jié)果。第Ⅰ組和第Ⅳ組出12個(gè)峰，第Ⅱ組出11個(gè)峰，第Ⅲ組出10個(gè)峰。LDR連接產(chǎn)物長(zhǎng)度與設(shè)定探針長(zhǎng)度一致。如I-1峰 （圖4）的大小為79，與 rs 4177540的純合子的連接探針長(zhǎng)度一致，因此該SNP位點(diǎn)為G，并與MGI上的數(shù)據(jù)相同。

表1表示的 BALB/c、FVB/NJ、NOD胚胎和129S3、C3H/ORL、Scid-BG10精子近交系小鼠的PCR-LDR檢測(cè)結(jié)果，10種胚胎和精子的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表2），胚胎和精子45個(gè)位點(diǎn)的基因型與MGI 和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息完全一致。

圖4　FVB小鼠胚胎四組PCR-LDR分型方案的377聚丙烯酰胺凝膠電泳Note.The templatesre present FVB.Each I-IV peak（I-1 to IV-12）represents SNPs 377 electrophoretogram. Fig.4 Polyacrylamide gel 377 electrophoresis of frozen embryos of FVB mice in the four panels

2.4 SNP位點(diǎn)在同一冷凍胚胎細(xì)胞中的梯度差異分析

為了探索SNP的檢出率與胚胎細(xì)胞個(gè)數(shù)的關(guān)系，本研究以C57BL/6小鼠的2細(xì)胞期冷凍胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)在不同個(gè)數(shù)胚胎細(xì)胞下SNPs的分型情況。從圖5可以看出隨著細(xì)胞個(gè)數(shù)的增多，SNPs位點(diǎn)被檢出的點(diǎn)是逐漸遞增的，其中當(dāng)小鼠冷凍胚胎小于等于2個(gè)2細(xì)胞期時(shí)，未鑒定出SNPs；當(dāng)2細(xì)胞期細(xì)胞個(gè)數(shù)為4時(shí)，SNPs為5；當(dāng)2細(xì)胞期細(xì)胞個(gè)數(shù)為6時(shí)，SNPs為18；當(dāng)2細(xì)胞期細(xì)胞個(gè)數(shù)為8時(shí)，SNPs為27；當(dāng)2細(xì)胞期細(xì)胞個(gè)數(shù)為10時(shí)，SNPs為38；當(dāng)大于等于12個(gè)2細(xì)胞期時(shí)，SNPs為45，檢出率100%。

3　討論

隨著國(guó)內(nèi)各地大型低溫冷凍庫(kù)的建立，其中小鼠的冷凍胚胎和精子在長(zhǎng)期低溫的狀態(tài)下，是否能一直有效的保證其遺傳特性完整值得關(guān)注。然而，一直以來(lái)因冷凍樣本十分珍貴、DNA含量又遠(yuǎn)低于常規(guī)個(gè)體樣本，導(dǎo)致小鼠的冷凍胚胎和精子的遺傳鑒定方案仍舊缺乏。本實(shí)驗(yàn)建立的冷凍物遺傳鑒定方案，能快速實(shí)現(xiàn)樣本的基因分型和品系鑒定。

在遺傳鑒定檢測(cè)中，分子生物學(xué)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)具有對(duì)各發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、組織甚至細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，不僅不受環(huán)境、基因表達(dá)等的限制，而且數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單快捷，同時(shí)能檢測(cè)基因組上多個(gè)位點(diǎn)，有豐富的多態(tài)性［22］。

本研究建立了針對(duì)特定區(qū)段、極微量樣本的前處理和擴(kuò)增方案，以及進(jìn)一步的PCR-LDR的DNA分子分型檢測(cè)，能準(zhǔn)確判斷出樣本的遺傳背景和品系。其中因冷凍胚胎（2細(xì)胞期）樣本僅含有19～40個(gè)細(xì)胞，為此本研究采用全基因組擴(kuò)增的方法直接對(duì)冷凍胚胎獲得的微量DNA進(jìn)行擴(kuò)增，DNA條帶大小在2027～21 226 bp，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是由于胚胎冷凍保存使DNA部分降解，但仍舊不影響分型結(jié)果。

本研究中建立的PCR-LDR對(duì)于10種近交系小鼠胚胎和精子的45個(gè)SNPs分型方案，能夠快速、準(zhǔn)確的鑒別出該SNP位點(diǎn)的基因型，并且測(cè)出的部分?jǐn)?shù)據(jù)與MGI和NCBI上的數(shù)據(jù)庫(kù)SNP信息一致，另外，部分品系的SNP信息數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有與之相對(duì)應(yīng)，這需要我們補(bǔ)充。因此，在建立標(biāo)準(zhǔn)化的SNP分型方案前，應(yīng)有準(zhǔn)確而且完整的SNP數(shù)據(jù)可供查閱。

表1　PCR-LDR對(duì)近交系小鼠胚胎和精子的分型結(jié)果Tab.1 Genotyping results of frozen embryos and sperms of inbred mouse strains by PCR-LDR

本研究建立的多重PCR-LDR每組分布的位點(diǎn)多達(dá)10組以上，四組總共含有45個(gè)SNPs位點(diǎn)，表1中C57BL/6分別與胚胎和精子中兩兩比對(duì)差異位點(diǎn)數(shù)中值為20，冷凍胚胎3個(gè)品系間兩兩比對(duì)差異位點(diǎn)中值為19，精子3個(gè)品系間兩兩比對(duì)差異位點(diǎn)中值為21，由此可見(jiàn)45個(gè)SNP位點(diǎn)在檢測(cè)的冷凍胚胎和精子近交系小鼠品系中的鑒定效果較高，可以避免只通過(guò)幾個(gè)SNP區(qū)分品系的情況。

圖5　C57BL/6小鼠胚胎2細(xì)胞期不同數(shù)目相對(duì)應(yīng)的SNPs數(shù)目Note.The numbers of cells in the 2-cell stage embryos is represented by the horizontal coordinates，and the longitudinal coordinates represent the number of expressed SNPs.Fig.5 SNPs number corresponding to different number of 2-cell stage embryos of C57BL/6 mice

本研究以C57BL/6小鼠的2細(xì)胞期冷凍胚胎來(lái)探索SNPs的檢出率與胚胎細(xì)胞個(gè)數(shù)的關(guān)系，從結(jié)果中可以看出隨著冷凍胚胎個(gè)數(shù)的增加SNPs檢出個(gè)數(shù)也增加，當(dāng)胚胎數(shù)大于等于12時(shí)，檢出率達(dá)到峰值100%。雖然全基因組擴(kuò)試劑盒能擴(kuò)增冷凍胚胎DNA的量，但是由于PCR-LDR分型系統(tǒng)對(duì)于DNA的量需求比較大，因此有可能才會(huì)出現(xiàn)冷凍胚胎個(gè)數(shù)≤2或≤10時(shí)，SNP分型檢測(cè)不出或者檢測(cè)率不到100%的現(xiàn)象。

PCR-LDR方案在本實(shí)驗(yàn)室作為一種常規(guī)的SNP高通量分型方案已經(jīng)進(jìn)展多年，該方案技術(shù)成熟、易操作、費(fèi)用低，相信該方案在冷凍胚胎、精子遺傳鑒定，能確保大型冷凍庫(kù)的可靠、穩(wěn)定運(yùn)行，并為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)長(zhǎng)期穩(wěn)定的繁榮發(fā)展提供保證。

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Establishment of a SNP genetic identification method for frozen embryos and sperm of inbred mice

XU Wei1，CHAO Tian-zhu1，LIU Li-jun2，LI Kai1，XIAO Jun-hua1*
（1.Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China；2.SLAC Laboratory Animal Co.Lit.Shanghai 201615）

【Abstract】Objective To establish a rapid SNP（single-nucleotide polymorphism）genetic identification method for the frozen samples，such as frozen embryos and sperm of inbred mice.Methods In this study，the frozen embryos and sperm of inbred mice were provided by Shanghai Lab.Animal Research Center.Whole genome amplification and PCR-LDR genotyping system were used to get the rich DNA sample.Forty-five SNP were genotyped by multiple polymerase chain reaction and ligase detection reaction（PCR-LDR）.Results The electrophoresis results showed that the whole genome amplification technique could highly increase the total DNA of frozen embryos.PCR-LDR typing method was suitable for the mouse genome typing of 45 SNPs.Ten strains of inbred frozen embryos and sperms of C57BL/6，BALB/c，F(xiàn)VB/NJ mice were genotyping identified，and their SNP loci data obtained by PCR-LDR were as the same as those of database.The number of frozen mouse embryos was proportional to the number of SNPs detected，and when the embryo number reached more than 12，the detection rate of SNP was 100%.Conclusions This method can be used to the genetic quality identification，and rapidly identify the inbreed frozen mouse embryos and sperms.

【Key words】Mouse；Frozen embryos and sperms；Genetic identification；Polymerase chain reaction and ligase detection reaction（PCR-LDR）；Single-nucleotide polymorphism（SNP）

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0169-06

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.011

［基金項(xiàng)目］上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：14140900502，15140900500）。

［作者簡(jiǎn)介］徐偉（1990-），男，碩士研究生，研究方向：小鼠遺傳學(xué)。Tel：021-67792650；E-mail：xuweidhu@163.com

［通訊作者］肖君華（1968-），男，教授，研究方向：小鼠遺傳學(xué)。Tel：021-67792652；E-mail：xiaojunhua@dhu.edu.cn

Corresponding author：XIAO Jun-hua，Email：xiaojunhua@dhu.edu.cn

［收稿日期］2015-11-16