王曉麗　謝淑敏　劉偉　任基浩　謝鼎華中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，中南大學(xué)耳科研究所（長(zhǎng)沙400）中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長(zhǎng)沙40008）

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中耳膽脂瘤動(dòng)物模型的建立及研究進(jìn)展

王曉麗1謝淑敏2劉偉1任基浩1謝鼎華1
1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，中南大學(xué)耳科研究所（長(zhǎng)沙410011）2中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長(zhǎng)沙410008）

【摘要】中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)理至今尚未明確，且目前尚無(wú)一種藥物能夠有效地治療中耳膽脂瘤。動(dòng)物模型是研究中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制及防治方法的重要工具。常見(jiàn)的膽脂瘤動(dòng)物模型建立方法有外耳道結(jié)扎方法、咽鼓管封閉方法、中耳化學(xué)試劑注射模型、自體皮膚鼓室移植+綠膿桿菌注射模型和活體電穿孔基因轉(zhuǎn)染法等，本文對(duì)上述5種膽脂瘤動(dòng)物模型的建立方法與特征進(jìn)行綜述，以期為研究中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制（內(nèi)陷囊袋學(xué)說(shuō)、上皮移行學(xué)說(shuō)、基底細(xì)胞層過(guò)度增生學(xué)說(shuō)）及防治方法提供一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)參考。

【關(guān)鍵詞】膽脂瘤；中耳；動(dòng)物模型

Conflict of interest：The authors declare no conflict of interest with regard to this publication.

Foundation：National natural science foundation of China（NO：81400457）

中耳膽脂瘤（cholesteatoma of middle ear，本研究特指后天性膽脂瘤，參照《2012年中耳炎臨床分類和手術(shù)分型指南》［1］）是一種位于中耳乳突腔內(nèi)的囊性結(jié)構(gòu)，具有過(guò)度增殖性、遷移侵襲性、復(fù)發(fā)性等臨床特征。該病病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為復(fù)層鱗狀上皮侵入中耳腔內(nèi)，形成囊袋，并異常增殖，從而導(dǎo)致過(guò)度角化的鱗狀上皮脫落堆積，逐步擴(kuò)展并累及周?chē)M織與結(jié)構(gòu)，可引起嚴(yán)重的骨質(zhì)吸收破壞從而導(dǎo)致耳聾、前庭功能障礙、面神經(jīng)麻痹及顱內(nèi)外并發(fā)癥，甚至威脅到患者的生命［2，3］。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，主要有四種假說(shuō)：內(nèi)陷囊袋學(xué)說(shuō)、上皮移行學(xué)說(shuō)、基底細(xì)胞層過(guò)度增生學(xué)說(shuō)及化生學(xué)說(shuō)［4，5］。目前尚無(wú)一種藥物能夠有效地治療中耳膽脂瘤，手術(shù)切除仍然是臨床上治療該病的唯一選擇，但其術(shù)后易復(fù)發(fā)且常需要多次手術(shù)的特點(diǎn)一直困擾著廣大耳鼻咽喉科醫(yī)生。因此，研究其發(fā)病機(jī)理以指導(dǎo)臨床藥物治療，即經(jīng)外耳道-鼓膜途徑局部應(yīng)用藥物來(lái)預(yù)防與治療中耳膽脂瘤，或作為術(shù)后防止其復(fù)發(fā)的輔助用藥成為治療該病的迫切任務(wù)。

動(dòng)物模型在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制研究中具有重要價(jià)值［6，7］。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要有蒙古沙鼠、長(zhǎng)爪沙鼠、豚鼠、毛絲鼠及大鼠等。其中，沙鼠膽脂瘤模型的應(yīng)用最為廣泛，這是因?yàn)樯呈笫悄壳耙阎某巳祟愅馕ㄒ豢勺园l(fā)形成耳膽脂瘤的動(dòng)物，且沙鼠具有與人類相似的中耳粘膜超微結(jié)構(gòu)，其膽脂瘤的侵襲破壞方式亦與人類非常相似［3］。常見(jiàn)的膽脂瘤動(dòng)物模型建立方法有外耳道結(jié)扎方法、咽鼓管封閉方法、中耳化學(xué)試劑注射模型、自體皮膚鼓室移植+綠膿桿菌注射模型和活體電穿孔基因轉(zhuǎn)染法等，本文針對(duì)這些造模方法進(jìn)行綜述。

1　外耳道結(jié)扎方法

該方法常采用蒙古沙鼠或長(zhǎng)爪沙鼠為造模動(dòng)物，簡(jiǎn)單易行。Chole RA等［8］研究發(fā)現(xiàn)沙鼠隨著年齡增長(zhǎng)可自發(fā)形成耳膽脂瘤，其比率高達(dá)45.7%。沙鼠外耳道結(jié)扎具體步驟為［9］：選取2-6月大的蒙古沙鼠和長(zhǎng)爪沙鼠，戊巴比妥（60mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，做耳后切口，用4-0絲線將外耳道結(jié)扎。結(jié)扎后定期觀察中耳腔及鼓膜形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)扎后2個(gè)月時(shí)，所有結(jié)扎耳鼓膜外側(cè)面均可觀察到角蛋白碎屑堆積，部分鼓膜向鼓室內(nèi)側(cè)面移位；結(jié)扎后3個(gè)月時(shí)，所有受檢耳均出現(xiàn)早期膽脂瘤；9個(gè)月時(shí)可觀察到膽脂瘤增大進(jìn)入聽(tīng)泡，16個(gè)月后大部分膽脂瘤充滿聽(tīng)泡，部分甚至破壞顱底骨質(zhì)進(jìn)入顱中窩或顱后窩。細(xì)菌感染在膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為了研究細(xì)菌感染在沙鼠膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，Chole RA等［10］將沙鼠雙側(cè)外耳道結(jié)扎造模，一側(cè)耳作為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)扎前先向外耳道內(nèi)注入銅綠假單胞菌（P.aeruginosa，PA）；對(duì)側(cè)耳作為對(duì)照組，結(jié)扎前僅向外耳道內(nèi)注入無(wú)菌PBS液。6周后，處死動(dòng)物行顯微CT掃描評(píng)估膽脂瘤體積大小及骨質(zhì)破壞程度。該研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組膽脂瘤（PA感染膽脂瘤）較對(duì)照組膽脂瘤（無(wú)PA感染膽脂瘤）生長(zhǎng)速度顯著增快，同時(shí)膽脂瘤體積及骨質(zhì)破壞范圍顯著增大。值得注意的是，PA感染膽脂瘤造模所需時(shí)間大大縮短，僅需要6周，且造模成功率達(dá)到100%。此外，Chole RA等［9］利用該模型發(fā)現(xiàn)PA野生型菌株（可形成生物膜）和生物膜缺陷型菌株所形成膽脂瘤的侵襲破壞能力無(wú)明顯差異。

為了研究外耳道結(jié)扎造模法膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞的來(lái)源，即究竟是鼓膜來(lái)源還是外耳道來(lái)源，日本學(xué)者Yamamoto-Fukuda T等［12］設(shè)計(jì)了一種新的模型，即局部雜合模型（local hybrid ear model），通過(guò)原位PCR技術(shù)放大靶基因來(lái)觀察細(xì)胞局部的基因復(fù)制情況，從而判斷造模膽脂瘤上皮細(xì)胞的來(lái)源。該方法具體如下：實(shí)驗(yàn)組將公蒙古沙鼠的鼓膜松弛部完全移除，然后取母鼠相應(yīng)位置的鼓膜移植到公鼠的鼓膜缺如處，然后結(jié)扎該組“雜合模型”鼠的外耳道；對(duì)照組直接結(jié)扎正常公鼠和母鼠外耳道，兩組膽脂瘤的發(fā)生率均為100%。作者通過(guò)觀察膽脂瘤細(xì)胞染色體是XY型或是XX型來(lái)分析細(xì)胞的來(lái)源，并采用原位PCR技術(shù)觀察沙鼠X染色體相關(guān)的磷酸甘油酸激酶1（pgk-1）基因的表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)：公鼠膽脂瘤上皮細(xì)胞核中觀測(cè)到1個(gè)pgk-1位點(diǎn)，母鼠中有1個(gè)或者2個(gè)，而雜合耳模型組觀測(cè)到的不只有1個(gè)位點(diǎn)的還有2個(gè)位點(diǎn)的，且其比例與母鼠的幾乎相同。該研究結(jié)果表明：雜合鼠模型中所有膽脂瘤細(xì)胞都有XX染色體表達(dá)，有效證明了該模型中膽脂瘤上皮細(xì)胞來(lái)自鼓膜，而不是中耳上皮細(xì)胞或外耳道皮膚。

外耳道結(jié)扎造模法簡(jiǎn)單易行，造模成功率相對(duì)較高，該造模方法形成的膽脂瘤理論上為外耳道膽脂瘤，但因所形成的膽脂瘤細(xì)胞及生物學(xué)性質(zhì)和人類膽脂瘤相似度較高，且研究發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮細(xì)胞來(lái)自于鼓膜，并壓迫鼓膜向鼓室內(nèi)側(cè)面移位，進(jìn)而破壞聽(tīng)泡等結(jié)構(gòu)，所以常被用于中耳膽脂瘤的實(shí)驗(yàn)研究。國(guó)外眾多學(xué)者利用該模型對(duì)膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)行了深入研究。Park K等［13，14］應(yīng)用該造模法成功建立沙鼠膽脂瘤模型，并檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)記物PCNA、CK13/16在膽脂瘤上皮中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PCNA、CK13/16在膽脂瘤上皮中的表達(dá)顯著增高，表明沙鼠膽脂瘤上皮細(xì)胞處于高度增殖狀態(tài)。Park K等［14］在成功建立沙鼠雙耳膽脂瘤模型基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)組耳采用經(jīng)耳道清除角質(zhì)碎屑及外耳道灌注氧氟沙星滴耳液，對(duì)照組耳不做任何處理，然后檢測(cè)兩組膽脂瘤上皮細(xì)胞PCNA和CK13/16的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組膽脂瘤上皮細(xì)胞PCNA和CK13/16的表達(dá)較對(duì)照組明顯減低，即實(shí)驗(yàn)組膽脂瘤的增殖能力受到抑制。Nageris BI等［15］通過(guò)外耳道結(jié)扎法建立蒙古沙鼠膽脂瘤模型，按照向外耳道所灌注的藥物將動(dòng)物分為3組：實(shí)驗(yàn)組1為維生素A灌注組；實(shí)驗(yàn)組2為Cortisporin灌注組（Cortisporin為一種滴耳劑，其主要成分為氫化可的松、新霉素和硫酸多粘菌素B）；實(shí)驗(yàn)組3為無(wú)干預(yù)對(duì)照組。結(jié)扎后9個(gè)月時(shí)檢測(cè)3組動(dòng)物膽脂瘤形成情況并對(duì)膽脂瘤大小和破壞范圍分級(jí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組動(dòng)物膽脂瘤發(fā)生率分別為65%，60%，100%，其中實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組3、實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3膽脂瘤發(fā)生率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)外耳道局部灌注藥物（維生素A和Cortisporin）可以降低實(shí)驗(yàn)沙鼠膽脂瘤發(fā)生率。PLC-γ1是細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子。Park K等［14］結(jié)扎蒙古沙鼠外耳道建立膽脂瘤模型，應(yīng)用免疫組化法和Western Blot法檢測(cè)膽脂瘤上皮、外耳道深部皮膚及耳后正常皮膚中PLC-γ1的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮中PLC-γ1表達(dá)顯著增高。該實(shí)驗(yàn)表明PLC-γ1在實(shí)驗(yàn)沙鼠膽脂瘤上皮細(xì)胞過(guò)度增殖中發(fā)揮了重要作用。

2　咽鼓管封閉法

咽鼓管功能障礙引起鼓室內(nèi)負(fù)壓及鼓膜松弛部?jī)?nèi)陷囊袋形成，加之鼓膜和外耳道上皮因慢性炎癥影響而喪失自潔能力，此種情況有利于膽脂瘤形成并侵入中耳腔，這是后天原發(fā)性膽脂瘤形成的理論基礎(chǔ)。早在1986年，Wolfman DE和Chole RA［17］就通過(guò)電燒灼沙鼠鼻咽部封閉雙側(cè)咽鼓管咽口成功建立了沙鼠膽脂瘤模型。咽鼓管咽口封閉的具體步驟為：選取6-10周齡的蒙古沙鼠，耳顯微鏡檢查所有沙鼠外耳道及鼓膜均正常，戊巴比妥鈉（1.2μg/g）腹腔內(nèi)注射實(shí)施麻醉，通過(guò)軟腭中線插入電燒灼器頭，分別左右旋轉(zhuǎn)以接觸鼻咽側(cè)壁，燒灼封閉咽鼓管咽口（沙鼠咽鼓管咽口在硬腭與軟腭交界處后方5mm左右）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：術(shù)后2周時(shí)，8只受檢耳均出現(xiàn)中耳漿液滲出及不同程度鼓膜內(nèi)陷；術(shù)后4周時(shí)，8只受檢耳有4只出現(xiàn)中耳積液、內(nèi)陷囊袋及膽脂瘤形成；術(shù)后8周時(shí)，8只受檢耳有5只出現(xiàn)中耳積液，4只耳形成膽脂瘤，其中1只耳膽脂瘤完全充滿鼓室；術(shù)后16周時(shí)，8只受檢耳有6只形成膽脂瘤。

咽鼓管封閉造模法為后天原發(fā)性膽脂瘤的發(fā)生機(jī)制-內(nèi)陷囊袋學(xué)說(shuō)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其操作上相對(duì)較難，造模成功率也較外耳道結(jié)扎法低。Kim HJ等［18，19］通過(guò)電燒灼封閉沙鼠咽鼓管咽口建立沙鼠膽脂瘤模型，并動(dòng)態(tài)觀察了膽脂瘤形成和發(fā)展過(guò)程，將該過(guò)程分為四期：第一期，鼓膜松弛部和緊張部輕度內(nèi)陷，部分可伴有中耳積液；第二期，鼓膜松弛部?jī)?nèi)陷囊袋形成伴有中耳積液，聽(tīng)骨鏈被囊袋部分包繞；第三期，內(nèi)陷囊袋內(nèi)角質(zhì)蛋白堆積，膽脂瘤形成并伴有鄰近骨質(zhì)（聽(tīng)骨鏈和鼓室盾板）吸收；第四期，鼓膜被膽脂瘤壓迫向內(nèi)側(cè)移位和鼓室內(nèi)側(cè)壁相貼，伴有顯著骨質(zhì)破壞。Wilmoth JG［20］電燒灼封閉沙鼠咽鼓管咽口，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)耳和對(duì)照耳鼓膜中炎癥因子TNF-alpha和MMP的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-alpha和MMP表達(dá)量隨著膽脂瘤形成和發(fā)展過(guò)程不斷增加，和上述分期呈現(xiàn)相關(guān)性，該實(shí)驗(yàn)表明炎癥因子TNF-alpha和MMP在沙鼠膽脂瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到了重要作用。

3　中耳化學(xué)試劑注射模型

該方法常采用豚鼠、大鼠、蒙古沙鼠和毛絲鼠等為造模動(dòng)物，通過(guò)向動(dòng)物中耳腔注入化學(xué)試劑引起炎癥反應(yīng)進(jìn)而形成膽脂瘤。炎癥刺激引起鼓膜與外耳道鱗狀上皮經(jīng)鼓膜穿孔處遷移侵入中耳腔是后天性中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的“上皮移行學(xué)說(shuō)”。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)丙二醇（propylene glycol，PG）和中耳腔粘膜接觸后可引起顯著的炎癥反應(yīng)［21］，因此常被用于膽脂瘤動(dòng)物模型建立。具體操作方法如下：選取體重400-680g的成年健康毛絲鼠，術(shù)前經(jīng)耳顯微鏡及聲導(dǎo)抗檢查排除鼓膜穿孔及中耳感染等情況。鹽酸氯胺酮（30mg/kg）肌注實(shí)施麻醉，在聽(tīng)泡表面做一個(gè)小切口，分離皮膚、皮下組織及骨膜，手術(shù)電鉆在聽(tīng)泡表面鉆開(kāi)一個(gè)小孔進(jìn)入聽(tīng)泡，可吸收線縫合切口。然后定期細(xì)針經(jīng)骨質(zhì)缺損區(qū)穿刺進(jìn)入聽(tīng)泡，緩慢注入丙二醇。Vassalli L等［22］向毛絲鼠中耳腔注入不同濃度的丙二醇（10%，50%，90%），發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，膽脂瘤發(fā)生率提高，濃度達(dá)到90%時(shí)膽脂瘤發(fā)生率可達(dá)到100%。

此外，學(xué)者們還常使用乳膠生物膜、膠原和滑石粉等外源性刺激物來(lái)建立中耳膽脂瘤模型。Massu?da和Oliveira等［23］向鼓膜穿孔的大鼠中耳腔置入天然乳膠生物膜，發(fā)現(xiàn)置入乳膠生物膜組大鼠的中耳腔存在顯著的炎癥反應(yīng)，膽脂瘤形成率高達(dá)90%，且在光鏡下可以觀察到外耳道鱗狀上皮向中耳腔遷移過(guò)程；而未放置乳膠生物膜組大鼠的中耳腔未見(jiàn)炎癥反應(yīng)及膽脂瘤形成。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Massuda和Oliveira認(rèn)為乳膠生物膜作為一種刺激物可以引起大鼠中耳腔化膿性炎癥，而炎癥反應(yīng)過(guò)程中所釋放出來(lái)的細(xì)胞因子可以誘發(fā)外耳道鱗狀上皮經(jīng)鼓膜穿孔處遷移進(jìn)入中耳腔，從而形成膽脂瘤。Hueb等［24］經(jīng)穿孔鼓膜向毛絲鼠鼓室置入一種外源性刺激物-膠原可以誘發(fā)中耳膽脂瘤形成。膠原置入鼓室后約12周即被重吸收，此時(shí)膽脂瘤形成率僅20%，此后隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，膽脂瘤形成率不斷增加，膠原置入鼓室后約22周時(shí)膽脂瘤的形成率達(dá)到了80%。據(jù)此，Hueb等認(rèn)為外源性刺激物引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中耳膽脂瘤形成的根本原因是這些刺激物所導(dǎo)致的中耳腔持續(xù)的炎癥反應(yīng)。

中耳化學(xué)試劑注射造模法操作較簡(jiǎn)單，造模成功率相對(duì)較高，國(guó)外眾多學(xué)者利用該模型對(duì)膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)行了深入研究。Antunes ML等［25］將濃度為100%的丙二醇注入豚鼠雙側(cè)聽(tīng)泡建立膽脂瘤模型，右側(cè)外耳道局部灌注反式維甲酸溶液作為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)外耳道局部灌注生理鹽水作為對(duì)照組，6周后處死動(dòng)物取顳骨行石蠟包埋切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組耳膽脂瘤發(fā)生率為30%，而對(duì)照組膽脂瘤發(fā)生率高達(dá)75%，兩者差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.0104），該實(shí)驗(yàn)表明外耳道局部灌注反式維甲酸可有效抑制丙二醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的膽脂瘤。Sennaroglu L等［26］將濃度為50%的丙二醇混合液（含有0.2ml丙二醇、0.1ml慶大霉素和0.1ml強(qiáng)的松龍）注入大鼠左側(cè)聽(tīng)泡作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)將丙二醇混合液（含有0.2ml丙二醇、0.1ml慶大霉素和0.1ml生理鹽水）注入大鼠右側(cè)聽(tīng)泡作為對(duì)照組，2個(gè)月后處死動(dòng)物取顳骨行石蠟包埋切片，觀察兩組中耳炎癥反應(yīng)情況及膽脂瘤發(fā)生率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組廣泛性炎癥發(fā)生率為18%，而對(duì)照組廣泛性炎癥發(fā)生率高達(dá)78%，兩者差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；實(shí)驗(yàn)組中耳膽脂瘤的發(fā)生率為0，而對(duì)照組中耳膽脂瘤的發(fā)生率為28%，，兩者差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。該實(shí)驗(yàn)表明大鼠中耳腔局部使用強(qiáng)的松龍可以抑制丙二醇引起的中耳炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制膽脂瘤形成。

4　自體皮膚鼓室移植+綠膿桿菌注射模型

炎癥刺激引起鼓膜與外耳道鱗狀上皮經(jīng)鼓膜穿孔處遷移侵入中耳腔是后天性中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的“上皮移行學(xué)說(shuō)”，即為該造模方法的理論基礎(chǔ)。研究表明：約85%的中耳膽脂瘤可以培養(yǎng)出細(xì)菌生長(zhǎng)，其中最常見(jiàn)的病原菌為綠膿桿菌［27］。Zhang等［28］通過(guò)向小鼠鼓室內(nèi)移植自體外耳道皮膚并注射綠膿桿菌懸液成功建立了中耳膽脂瘤動(dòng)物模型。具體操作方法如下：采用6-8周齡雌性C57BL/ 6（野生型）小鼠建模。模型建造前，所有實(shí)驗(yàn)小鼠需先行耳顯微鏡檢查外耳道及鼓膜、耳CT掃描及ABR檢查，均正常者入組。水合氯醛0.01ml/g體重麻醉后在耳顯微鏡下劃開(kāi)左側(cè)鼓膜（前下象限），將鼓膜游離緣卷入鼓室，再取0.5×1×1mm大小的外耳道皮膚，經(jīng)穿孔塞入鼓室，然后向鼓室注射5ul含菌量100CFU的綠膿桿菌懸液（ATCC19660菌株）。術(shù)后6周耳顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)膽脂瘤造模成功率高達(dá)92%，HE切片證實(shí)小鼠聽(tīng)泡內(nèi)形成了由復(fù)層鱗狀上皮覆蓋的囊腔，并存在明顯的角化脫屑堆積。此外，炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達(dá)也明顯上調(diào)。

5　活體電穿孔基因轉(zhuǎn)染法

活體電穿孔法（in vivo electroporation）是將外源基因通過(guò)電場(chǎng)作用，導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官的方法，該方法可有效地導(dǎo)入外源基因，效率很高。中耳膽脂瘤上皮組織中角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）的表達(dá)量較正常外耳道皮膚組織顯著增高，其在膽脂瘤上皮高度增殖和角化中發(fā)揮了重要作用［29］。Yamamoto-Fukuda T等［30］應(yīng)用活體電穿孔法向SD大鼠外耳道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染hKGF cDNA，免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)絕大部分外耳道上皮細(xì)胞及部分上皮下間質(zhì)細(xì)胞可成功檢測(cè)到標(biāo)簽蛋白Flag表達(dá)，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KGF蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高；與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染了hKGF cDNA的外耳道上皮細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖核抗原PCNA表達(dá)顯著增高。其中，在連續(xù)轉(zhuǎn)染5次（每4天轉(zhuǎn)染1次）造模完畢后1周行耳內(nèi)鏡檢查及顳骨組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hKGF cDNA轉(zhuǎn)染組中耳膽脂瘤發(fā)生率高達(dá)88.9%（9只耳中有8只耳可觀察到中耳膽脂瘤形成），而對(duì)照組則無(wú)膽脂瘤形成，兩組差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0006）。形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)該膽脂瘤模型是以鼓膜表面形成過(guò)度角化的復(fù)層鱗狀上皮并過(guò)度增殖為特征，最終形成角蛋白珠（keratin pearl）。該模型類似于咽鼓管封閉法所形成的內(nèi)陷囊袋膽脂瘤，隨著角質(zhì)蛋白堆積，膽脂瘤形成并侵入聽(tīng)泡伴有鄰近骨質(zhì)吸收。作者認(rèn)為該模型中耳膽脂瘤的發(fā)生機(jī)制可能是：外耳道上皮間質(zhì)細(xì)胞持續(xù)性釋放KGF，KGF和鼓膜表面鱗狀上皮細(xì)胞膜上的受體KGFR結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路，最終導(dǎo)致鼓膜表面鱗狀上皮的過(guò)度增殖和角化。為了驗(yàn)證KGF在該膽脂瘤模型中的關(guān)鍵作用，Yamamoto-Fukuda T在完成SD大鼠外耳道上皮細(xì)胞hKGF cDNA轉(zhuǎn)染后，采用2mM SU5402（選擇性KGFR抑制劑）溶液滴耳，每天滴入50μl，連續(xù)用5天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SU5402溶液滴耳可以抑制膽脂瘤形成，5只耳無(wú)1例形成膽脂瘤［31］。該實(shí)驗(yàn)表明了KGF/ KGFR信號(hào)通路在中耳膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵性作用，阻斷該通路可以抑制中耳膽脂瘤的發(fā)生，進(jìn)而為經(jīng)外耳道-鼓膜途徑局部用藥治療膽脂瘤帶來(lái)了希望。

綜上，動(dòng)物模型在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制研究中具有重要價(jià)值，常見(jiàn)的膽脂瘤動(dòng)物模型建立方法有外耳道結(jié)扎方法、咽鼓管封閉方法、中耳化學(xué)試劑注射模型、自體皮膚鼓室移植+綠膿桿菌注射模型和活體電穿孔基因轉(zhuǎn)染法等，對(duì)上述各種造模方法進(jìn)行了綜述和比較（表1），期待在今后的研究工作中找到更佳的中耳膽脂瘤動(dòng)物模型，為研究中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制及防治方法提供一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

表1　膽脂瘤動(dòng)物模型不同造模方法間的比較Table 1 Comparison among different cholesteatoma animal models

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·疑難病例討論·

Establishment of animal models of middle ear cholesteatoma and relevant research

WANG Xiaoli1，XIE Shumin2，LIU Wei1，REN Jihao1，XIE Dinghua1
1 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Xiangya Second Hospital，Central South University；Central South University Institute of Otology，Changsha，410011 2 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，The Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan Province，China（410008）.Corresponding author：LIU WeiEmail：lw-007@163.com

【Abstract】The pathogenesis of middle ear cholesteatoma remains unclear and there is no effective nonsurgical therapy.Animal models are very important for studying pathogenesis，prevention and treatment of middle ear cholesteatoma.Common animal models involve ligation of the external ear canal，eustachian tube blocking，chemical injection into the middle ear，autologous skin graft implantation plus intratympanic injection of Pseudomonas aeruginosa，and in vivo electroporation for Flag-hKGF vector transfection.In this paper，we reviewed current animal models of middle ear cholesteatoma in order to provide an experimental basis for further study of the pathogenesis（e.g.retraction pocket theory，immigration theory，basal cell hyperplasia theory），prevention and treatment of middle ear cholesteatoma.

【Key words】Cholesteatoma；Middle ear；Animal model

【中圖分類號(hào)】R764.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1672-2922（2016）03-431-5

DOI：10.3969 / j.issn.1672-2922.2016.03.024

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：81400457）

作者簡(jiǎn)介：王曉麗，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：耳科學(xué)

通訊作者：劉偉，Email：lw-007@163.com

收稿日期：（2015-10-10審核人：翟所強(qiáng)）