王均玲, 余 晨

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院腎臟科，上海 200065)

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·基礎(chǔ)研究·

線粒體超離子與血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)纖維化的研究

王均玲, 余 晨

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院腎臟科，上海 200065)

腎臟纖維化； 血管緊張素Ⅱ； 活性氧； 超氧離子； NADPH氧化酶抑制劑； 大鼠

腎臟纖維化指在各種致病因素作用下，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)增多，基質(zhì)蛋白合成增加而降解減少造成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)大量堆積導(dǎo)致的腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[1]。腎臟纖維化的機(jī)制目前還不是很清楚，血管緊張素-Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是體內(nèi)重要的血管活性物質(zhì)之一，它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡以及纖維化進(jìn)程[2]。以往對(duì)于AngⅡ-慢性腎臟疾病的氧化應(yīng)激研究中，缺乏針對(duì)線粒體氧化應(yīng)激的研究，尤其是AngⅡ 介導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激對(duì)腎臟纖維化的機(jī)制，本研究在大鼠腎臟成纖維細(xì)胞中探討氧化應(yīng)激與腎臟纖維化之間的相關(guān)機(jī)制，并驗(yàn)證超氧離子是否介導(dǎo)AngⅡ引起腎臟間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成。

1 材料與方法

NRK-49F細(xì)胞，由復(fù)旦大學(xué)生理與病理教研室贈(zèng)送。

1.1 主要試劑和儀器

細(xì)胞培養(yǎng)液MEM (GIBCO)、FBS(GIBCO)、Apocycin(sigma2501950)，線粒體熒光探針Mito (invitrogen 1252221)， RNA抽提試劑盒(Invitrogen)，RT試劑ReverTra Ace?qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反應(yīng)試劑(TaKaRa)，Col1 抗體(Abcom34710)，Col3抗體(Abcom6310)，F(xiàn)ibronectin 抗體(F3648)二抗(抗IgG-Cy3 Jackson)，PCR引物由上海生工合成，RT試劑ReverTra Ace?qPCR RT Kit(TOYOBO)，Realtime PCR反應(yīng)試劑(TaKaRa)，酶標(biāo)儀，BioTek細(xì)胞流式儀(accun C6)，顯微鏡(Nikon)。

1.2 NRK-49F細(xì)胞線粒體超氧離子流式檢測(cè)

將細(xì)胞分別傳代于5個(gè)細(xì)胞瓶中，24h后進(jìn)行分組： 空白組，AngⅡ組(AngⅡ溶度10-6)，apocynin組(apocynin溶度10-6),AngⅡ+apocynin組(溶度疊加)，每組設(shè)平行3組，藥物干預(yù)24h后抽去含有藥物的培養(yǎng)液，用可與線粒體特異性的超氧化物反應(yīng)的熒光試劑Mito invitrogen 1252221 5μm 的工作溶度覆蓋細(xì)胞，37℃，10min,消化液消化細(xì)胞，血清終止消化并收集細(xì)胞，1500轉(zhuǎn)/min，離心半徑10cm，離心5min，用0.01mol PBS懸浮細(xì)胞，上流式儀檢測(cè)并設(shè)陰性對(duì)照組。

1.3 Mito熒光酶標(biāo)檢測(cè)NRK-49F細(xì)胞內(nèi)線粒體含量

將細(xì)胞消化，離心后以每孔5.3×103的細(xì)胞數(shù)種植于96孔中，24h后進(jìn)行分組： 空白組，AngⅡ組(AngⅡ溶度10-6)，apocynin組(apocynin溶度10-6),AngⅡ+apocynin組(溶度疊加)，每組設(shè)4復(fù)孔，藥物干預(yù)24h后抽去含有藥物的培養(yǎng)液用Mito (invitrogen 1252221)為5μm的工作溶度每孔加入50μl，37℃孵育10min，上酶標(biāo)儀550波長檢測(cè)并讀取數(shù)據(jù)。

平均D值(平均吸光度)的計(jì)算：

復(fù)孔平均D值-空白平均D值 = 每組平均D值

1.4 Mito熒光顯示NRK-49F細(xì)胞內(nèi)線粒體分布

細(xì)胞消化，離心后將細(xì)胞種植于24孔培養(yǎng)板中，24h后進(jìn)行分組，藥物干預(yù)24h后抽去含有藥物的培養(yǎng)液，用Mito 5μm的工作溶度覆蓋細(xì)胞，37℃ 孵育10min，熒光顯微鏡(激發(fā)光： 590nm)下觀察每組細(xì)胞內(nèi)線粒體分布。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)

采用Trizol一步法抽提細(xì)胞RNA, 進(jìn)行電泳與紫外分析檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格依照試劑盒說明進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)如下： RatGAPDH。正向5,AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG,下游CGTTGAA-CTTGCCGTGGGTAG；rCollagenⅠAAGGGTCATC-GTGGCTTCTCT，GACCGTTGAGTCCATCTTTGC；rCollagenⅢTCCCAGAACATTACATACCACTGC，TCTCATGGCCTTGCGTGTT；rFN GCTATGGAGG-AAGCAGAGGTTT，ACCAATCTTGTAGGACTGA-CCCC。擴(kuò)增條件： 94℃變性(30s),56℃退火(30s),72℃延伸(30次循環(huán)，繼續(xù)72℃延伸5min)，使用BIO-RAD(CFX-96)實(shí)時(shí)定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完成后收集熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)包括擴(kuò)增曲線、工作曲線、融解曲線與相應(yīng)Ct值等。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NRK-49F細(xì)胞

圖1 各組超氧離子吸光度比較圖Fig.1 Comparison of superoxides absorbance by enzyme-labelling in different groups注： AngⅡ組與對(duì)照組相比，細(xì)胞熒光增強(qiáng)；AngⅡ+APO較AngⅡ組組熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)

2.2 NRK-49F細(xì)胞

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)熒光陽性細(xì)胞結(jié)果比較圖Fig.2 Comparison of fluorescence positive cells detected by flow cytometry in different groups注： AngⅡ組與對(duì)照組相比，陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，AngⅡ+APO較AngⅡ組陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)

2.3 NRK-49F細(xì)胞

培養(yǎng)24h，藥物干預(yù)24h后，Real-time PCR檢測(cè)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表達(dá)： Ang Ⅱ刺激組較對(duì)照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表達(dá)顯著增加；Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN mRNA表達(dá)有顯著降低(兩者均P<0.05，圖3a，圖3b,圖3c)。

4NRK-49F細(xì)胞培養(yǎng)24h后，藥物干預(yù)24h后，免疫熒光法檢測(cè)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN表達(dá)： Ang Ⅱ刺激組較對(duì)照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)顯著增加，Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)有顯著降低，兩者均(P<0.05，圖4a,4b,4c)。

圖3a 熒光定量PCR結(jié)果各組中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、FN基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量P<0.05Fig.3a The relative expression of Collagen-ⅠmRNA in different groups注： AngⅡ組與對(duì)照組相比，Collagen-ⅠmRNA表達(dá)有顯著增多，AngⅡ+APO較AngⅡ組mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)

圖3b Col-ⅢmRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3b The relative expression of Collagen-Ⅲ mRNA in different groups注： Ang Ⅱ 組與對(duì)照組相比，Collagen-Ⅲ mRNA表達(dá)有顯著增多，Ang Ⅱ+APO較Ang Ⅱ 組mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)

圖4a 免疫熒光檢測(cè)Collagen-Ⅰ蛋白Fig.4a Immunofluorescence staining of Collagen-Ⅰ protein注： Ang Ⅱ刺激組較對(duì)照組，Collagen-Ⅰ表達(dá)顯著增加，Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)有顯著降低(P<0.05)

圖4c 免疫熒光檢測(cè)FN蛋白Fig.4c Immunofluorescence staining of FN protein注： AngⅡ刺激組較對(duì)照組FN表達(dá)顯著增加，Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組FN蛋白表達(dá)有顯著降低(P<0.05)

5NRK-49F細(xì)胞培養(yǎng)24h，藥物干預(yù)24h后，western blot 檢測(cè)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN蛋白表達(dá)。Ang Ⅱ刺激組較對(duì)照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)顯著增加；Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)有顯著降低(兩者均P<0.05，圖5)。

2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)線粒體超氧離子結(jié)果

Ang Ⅱ刺激組較對(duì)照組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)顯著增加；Ang Ⅱ+APO組較Ang Ⅱ組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、FN 蛋白表達(dá)有顯著降低(兩者均P<0.05，圖5)。

圖5 各組的WB蛋白水平圖Fig.5 The collagen Ⅰ, Ⅲ and fibronectin levels in different groups

3 討 論

[1] Hui YL. Diverse roles of TGF-β/smads in renal fibrosis and inflammation[J]. Int J Biol Sci, 2011,7(7)： 1056-1067.

[2] 余瑩，李長明，周沛然,等.坎地沙坦在炎癥過程中抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版，2010，31(3)： 59-63.

[3] Doug YL, Fabien W, Assaad A,et al.Nox4 Nadph oxidase mediates peroxynitrite-dependent uncoupling of endothelial Nitric-oxide synthase and fibronectin expression in response to angiotensin Ⅱ： ROLE of mitochondrial reactive oxygen species[J].J Biol Chem, 2013，288(40)： 28668-28686.

[4] Sovari AA, Morita N. Karagueuzian HS, Apocynin： a potent NADPH oxidase inhibitor for the management of atrial fibrillation[J]. Redox Rep, 2008,13(6)： 242-245.

[5] Garrido AM. NADPH oxidases and angiotensin Ⅱ receptor signaling[J].Mol Cell Endocrinol, 2009,302(2)： 148-158.

[6] Piacenza L, Irigoín F, Alvarez MN, et al. Mitochondrial superoxide radicals mediate programmed cell death in Trypanosoma cruzi： cytoprotective action of mitochondrial iron superoxide dismutase overexpression[J]. Biochem J, 2007,403(2)： 323-334.

Mitochondria superoxides mediates angiontension Ⅱ-induced synthesis of extracelluar matrix

WANGJun-ling，YUChen

(Dept. of Nephrology, Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065, China)

renal fibrosis； angiotensin Ⅱ； reactive oxygen； superoxides； NADPH oxidase inhibitors； rat

10.16118/j.1008-0392.2016.03.003

2015-09-24

國家自然科學(xué)基金(NSFC 81370790)

王均玲(1982—)，女，住院醫(yī)師，碩士研究生.E-mail: 852775856@qq.com

余 晨.E-mail: yuchen@#edu.cn

R 551

A

1008-0392(2016)03-0016-05