張雪蓮， 周尊海， 張利強， 王 博， 賈玉芳， 梁愛斌

(1. 同濟大學附屬楊浦醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200090； 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200065； 3. 上海賽金生物醫(yī)藥有限公司，上海 201203； 4. 濟寧市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟寧 272011)

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·基礎(chǔ)研究·

As2O3誘導NB4、HL-60細胞凋亡的機制研究

張雪蓮1， 周尊海1， 張利強3， 王 博1， 賈玉芳4， 梁愛斌2

(1. 同濟大學附屬楊浦醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200090； 2. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院血液科，上海 200065； 3. 上海賽金生物醫(yī)藥有限公司，上海 201203； 4. 濟寧市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟寧 272011)

目的 探討三氧化二砷(As2O3)在體外抑制急性早幼粒白血病(acute promyelocyticleukemia， APL)細胞NB4、HL-60細胞增殖，誘導細胞凋亡的分子機制。方法 通過WST-8法檢測上述兩個細胞株的增殖抑制曲線;用AnnexinV/PI流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡;用Real time PCR檢測凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、p53、C-myc、Survivin在As2O3處理前后的表達變化，同時用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P53在As2O3處理前后的表達變化。結(jié)果 As2O3能夠顯著抑制兩種細胞增殖, Westernblot檢測及Realtime PCR結(jié)果顯示，As2O3處理引起了兩種細胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8 、Caspase-9基因表達水平增加，且蛋白表達水平上都出現(xiàn)了活性形式的Caspases。NB4細胞中Survivin、C-myc、Bcl-2的基因表達水平都顯著降低，突變型p53蛋白在細胞內(nèi)的量同樣顯著下降；HL-60細胞的C-myc表達水平顯著降低，但Survivin、Bcl-2表達水平無明顯變化。結(jié)論 As2O3能在藥物臨床濃度范圍內(nèi)有效抑制急性早幼粒白血病細胞HL-60、NB4的細胞增殖, 但方式不同；1.5μmol/L濃度的As2O3對NB4細胞生長的抑制體現(xiàn)在誘導細胞分化并誘導細胞凋亡，對HL-60細胞生長的抑制只體現(xiàn)在誘導細胞分化。HL-60細胞中高表達的Survivin、Bcl-2抑制了細胞的凋亡。NB4、HL-60細胞株中P53基因的細胞遺傳學變異的不同可能是As2O3對這兩種細胞增殖抑制機制差異的主要原因之一。

As2O3； 細胞凋亡； NB4； HL-60； survivin； p53

20世紀70年代，國內(nèi)醫(yī)務工作者最早發(fā)現(xiàn)As2O3對(acute promyelocytideukmia, APL)有顯著療效。此后國內(nèi)學者研究發(fā)現(xiàn)As2O3對急性早幼粒細胞白血病的治愈率達到了90%。國外學者發(fā)現(xiàn)As2O3可以誘導早幼粒細胞白血病細胞分化和凋亡[1]。 NB4細胞在低濃度條件下，As2O3誘導細胞趨向分化，而在高濃度條件下，As2O3誘導細胞趨向凋亡[2]。在PML-RARa融合蛋白陰性的HL-60細胞中，同樣表現(xiàn)出低濃度As2O3誘導細胞分化，高濃度As2O3誘導凋亡的現(xiàn)象[3]，但誘導凋亡所需的濃度大幅度高于NB4細胞。陳賽娟等發(fā)現(xiàn)了As2O3誘導NB4細胞系分化與凋亡的分子機制[4]，揭示了NB4細胞中的PML-RARa融合蛋白是As2O3的靶蛋白。但在PML-RARa融合蛋白陰性的HL-60細胞中，深入探討As2O3誘導凋亡的研究較少，為此本研究對比研究了在藥理濃度條件下As2O3誘導NB4和HL-60細胞分化與凋亡過程中的區(qū)別，探討其分子機制的異同，以期為As2O3臨床應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑

HL-60和NB4細胞系由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院引進。As2O3購自哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司；RPMI 1640、IMDM培養(yǎng)基及FBS購自Gibco公司；Cell Counting Kit-8購自同仁化學研究所；Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I購自BD公司；BCA蛋白定量分析試劑盒、Chemiluminescent HRP Substrate購自Thermo公司；RNAsimple總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

NB4、HL-60細胞用含有5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細胞密度保持在(1×105～5×105)/ml。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 WST-8法測定細胞增殖抑制率

取細胞密度為1×105/ml的對數(shù)生長期細胞，按不同給藥方式將上述三個細胞系各分8組，其中6組為實驗組(As)： 加入As2O3后使各組終濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0μmol/L；1組為對照組(Ac)： 不含藥物只含細胞的培養(yǎng)基；1組為空白組(Ab)： 不含細胞和藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，每孔加入CCK-8 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)3～5h后，測定波長450nm處的D。根據(jù)如下公式計算細胞存活率： 細胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%。

1.4 流式細胞術(shù)分析細胞凋亡

取細胞密度為1×105/ml的細胞。每個細胞系分為兩組： 未加藥的對照組和加入終濃度為1.5μmol/L As2O3的實驗組。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72h 后將細胞離心、洗滌，加入AnnexinⅤ及PI染色，用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

1.5 實時熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達

收集藥物處理24h、48h、72h的實驗組和對照組細胞，提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR在ABI Prism 7500系統(tǒng)上擴增目的基因。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，應用相對定量法(2-ΔΔCt)進行定量分析。

表1 引物序列

1.6 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達

收取藥物處理后細胞，提取細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性。經(jīng)SDS-PAGE，之后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1h，并一抗4℃孵育過夜，二抗孵育，經(jīng)ECL化學發(fā)光法檢測蛋白的表達，Image QuantTMLAS 4000凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。不同時間點基因表達與對照組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 As2O3對HL-60 、NB4細胞增殖抑制

兩細胞株在不同濃度As2O3處理48h條件時的增殖抑制率結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩株細胞系之間的增殖抑制率有顯著差異(P<0.05，n=5)。從As2O3濃度-細胞增殖抑制率關(guān)系圖(圖1)可得知，NB4對As2O3的細胞增殖抑制敏感性與HL-60接近，但略高。利用Grahpad Prism 5軟件計算得到NB4、HL-60的IC50值分別為1.3μmol/L、2.1μmol/L。

2.2 As2O3處理各細胞系的凋亡情況

以1.5μmol/L的As2O3處理細胞，在不同時間(24h、48h、72h)用AnnexinV-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，隨著處理時間的增加，在NB4中凋亡細胞比例迅速上升，由24h的5.43%上升到48h的52.56%,72h的70.67%，見圖2 A-D。而HL-60凋亡細胞數(shù)量并未隨著As2O3處理時間的延長而明顯增加，只是從對照的1.38%增加到 72h 的2.38%，見圖2 E～H?？梢钥闯鯪B4細胞對1.5μmol/L 的As2O3誘導細胞凋亡的敏感度強，而HL60對1.5μmol/L 的As2O3誘導的細胞凋亡具有抵抗性。

圖1 不同濃度As2O3對細胞的增殖抑制率(n=5)Fig.1 Effect of As2O3 on inhibition rate of cell proliferation in NB4 and HL60 cells

圖2 A-D、E-H分別表示HL60、NB4細胞系control、24h、48h、72h的細胞流式檢測結(jié)果Fig.2 The result of Flow cytometric with Annexin-V/PI staining

2.3 As2O3處理過程中各細胞株的凋亡相關(guān)基因的表達情況

1.5μmol/L As2O3作用于NB4、HL-60后，兩個細胞株在細胞增殖抑制率接近的情況下，出現(xiàn)細胞凋亡率差距顯著的現(xiàn)象。為了探究這一現(xiàn)象背后分子機制的異同，檢測了1.5μmol/L As2O3處理后，兩種細胞中Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2、Bax及Survivin、C-myc、CD11b等基因表達的變化趨勢，也考察了NB4細胞中的突變型p53基因的表達變化。同時也分析了各基因在不同細胞中的相對表達情況。

As2O3處理前后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2、Survivin基因在HL-60細胞株中mRNA表達水平明顯高于NB4，是NB4細胞的mRNA表達水平的2～8倍。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因在藥物處理后各基因表達水平增長趨勢及幅度較為接近，見圖3A、B、C。在對As2O3誘導凋亡敏感的NB4細胞株中，Survivin基因的mRNA表達水平在藥物處理的24h時就顯著下降；Bcl-2基因的mRNA表達水平在藥物處理的24h時也已明顯下降，見圖4D；在對As2O3誘導凋亡不敏感的HL60細胞株中，Bcl-2基因的mRNA表達水平在藥物處理的72h內(nèi)下降不明顯，見圖3D，Survivin基因的mRNA表達水平在藥物處理48h后才明顯下降，見圖4D。

As2O3處理前后HL-60細胞中Bax基因表達無顯著上升，但NB4細胞中Bax基因在藥物處理后其mRNA 表達水平上升趨勢快、增加幅度大，見圖3E。

Bcl-2/Bax值(mRNA表達水平比值)在兩細胞系中表達水平有著明顯的差異P<0.01，見圖3中F所示，Bcl-2/ Bax表達水平的比值在NB4中下降趨勢顯著，24h后即迅速下降，由未處理時的4.47下降到藥物處理48h時的0.86。在NB4細胞株中Bcl-2/Bax值接近1的時間與細胞出現(xiàn)大量凋亡的時間基本一致。HL-60細胞株中的Bcl-2/ Bax表達水平的比值在藥物處理前后一直在6.71～8.48之間波動，下降趨勢不明顯，Bcl-2基因的表達量一直顯著大于Bax。

藥物處理后，NB4細胞、HL-60細胞中的C-myc的基因表達水平急劇下降，處理24h的表達量與未處理前相比分別下降了60.5%和47.9%；兩者細胞中C-myc的基因表達水平下降幅度與其對As As2O3的增殖抑制敏感度強弱呈正相關(guān)(r=0.7582)。

在As2O3誘導下NB4細胞中p53基因表達量稍有增加，而P53缺失的HL60細胞中則檢測不到p53基因的表達，見圖4C。

圖3 As2O3處理NB4、HL60細胞不同時間對Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax及C-myc等基因表達的影響Fig.3 Effect of As2O3 on mRNA expression of Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2, Bax and C-myc in NB4 and HL60 cellsA、B、C、D、E分別表示As2O3處理前后，各細胞株中caspase3/8/9、Bcl-2、Bax基因表達變化情況；F表示As2O3處理前后，各細胞株中Bcl-2與Bax基因表達水平比值的變化情況；誤差棒表示標準偏差(s)，n=3；*P<0.05； **P<0.01

圖4 As2O3處理NB4、HL60細胞不同時間C-myc、CD11b、p53及Survivin等基因表達的變化Fig.4 Effect of As2O3 on the mRNA expression of C-myc、CD11b、P53 and Survivin in NB4 and HL60誤差棒表示標準偏差(s)，n=3,*P<0.05； ** P<0.01

2.4 As2O3處理過程中各細胞系的凋亡相關(guān)蛋白的表達情況

NB4細胞在As2O3處理12h時，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9已經(jīng)都出現(xiàn)裂解帶，并且隨著As2O3處理時間的延長，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的前體蛋白表達量呈不斷增加的趨勢，其活性形式的蛋白量也明顯增加。Bax蛋白表達量也表現(xiàn)出了隨著As2O3處理時間的延長而上升的趨勢,Bcl-2則表現(xiàn)出相反的趨勢(圖5)。這說明NB4細胞內(nèi)，在蛋白水平上Bcl-2/ Bax比值也是不斷下降的,與基因表達比值變化趨勢一致。

HL-60細胞在As2O3處理12h時，Caspase-3、Caspase-8出現(xiàn)了裂解帶，而Caspase-9直到72h時才出現(xiàn)裂解帶。隨著As2O3處理時間的延長，Caspase3、Caspase8、Caspase9的前體蛋白表達量呈不斷增加的趨勢，但其活性形式的蛋白表達量沒有明顯的增加。Bax蛋白表達量也表現(xiàn)出了隨著As2O3處理時間的延長而略上升的趨勢(圖5)，但Bcl-2蛋白表達量下降的趨勢不明顯。

NB4細胞中突變型P53蛋白在As2O3誘導 12h 后表達量即明顯下降，24h后急劇下降，48h后細胞內(nèi)的突變型P53蛋白已檢測不到(圖5)，與此同時細胞出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象(圖2C)。HL60細胞中則始終檢測不到突變型P53蛋白(圖5)。

圖5 Western blot法檢測各細胞系的凋亡相關(guān)蛋白的表達Fig.5 Effect of As2O3 on expression of apoptosis-related protein in NB4 and HL60 cells detected by Western blotting

3 討 論

As2O3通過促進細胞分化、抑制細胞增生、促進細胞凋亡及抑制腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。

已有的研究表明, C-myc作為一種原癌蛋白,有推進細胞周期、促使細胞轉(zhuǎn)化、抑制細胞分化的作用[6]。CDllb是髓系細胞分化的重要標志，在髓系細胞逐漸分化成熟過程中的表達會逐漸升高[7]。在本研究中，As2O3處理后HL-60的CDllb基因表達水平不斷上升，C-myc基因表達水平不斷下降，表明在1.5μmol/L的As2O3濃度處理72h內(nèi)，HL-60趨向于分化，細胞增殖被抑制。NB4在As2O3處理后CD11b基因的表達水平先小幅度上升，48h后細胞出現(xiàn)大量凋亡，同時細胞CD11b表達量下降。而在此過程中C-myc基因表達水平不斷下降。表明在1.5μmol/L As2O3濃度處理后，NB4細胞經(jīng)歷了分化過程后又趨向凋亡，從而細胞增殖被抑制。

正如As2O3對NB4細胞表現(xiàn)出的誘導凋亡作用一樣，As2O3抗腫瘤的作用還表現(xiàn)在促進腫瘤細胞凋亡。細胞的凋亡主要通過兩條途徑進行一條為死亡受體途徑，亦稱外源性途徑；另一條途徑稱為線粒體途徑，亦稱內(nèi)源性途徑。已有的一些研究表明As2O3可以直接抑制癌細胞生長,激活Caspase-8或者Caspase-9、Caspase-3 等機制誘導凋亡[8]。

As2O3處理后，兩株細胞的Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9在基因及蛋白水平的表達上都顯示出了上升的趨勢。在Western blot檢測中，4～12h內(nèi) Caspases-3、Caspases-8在兩株細胞中都出現(xiàn)了活性形式，且NB4中Caspase-9也出現(xiàn)了活性形式,并且隨著時間的延長而增加。而在HL-60細胞中，Caspase-9的活性形式在72h時才出現(xiàn)，顯著晚于 NB4。Caspase-8、Caspase-9活性形式的出現(xiàn)說明在我們所選用的藥物濃度條件下，As2O3可以誘導兩株細胞凋亡信號激活，并最終激活了細胞凋亡的執(zhí)行者caspase-3。在這兩株細胞中，細胞凋亡的死亡受體途徑中的起始因子Caspase-8和線粒體途徑中的起始因子Caspase-9在As2O3處理后都出現(xiàn)了基因及蛋白水平的表達增強，表明這兩條凋亡途徑都被激活。

細胞凋亡結(jié)果表明，NB4細胞在As2O3處理24h、48h、72h后，早中期細胞凋亡率與對照組相比分別顯著增加，見圖2A-D；HL-60細胞在同樣的時間點上細胞凋亡率與對照組相比無明顯變化，見圖2E-H。說明這兩株細胞對As2O3誘導的凋亡敏感度有顯著區(qū)別，NB4對As2O3誘導凋亡高度敏感，而HL60對As2O3誘導凋亡則是耐受的。

HL-60和NB4相比較，在對As2O3細胞增殖生長抑制敏感度方面接近，但在As2O3誘導的凋亡敏感度方面，NB4顯著敏感于HL-60。并且，HL-60在As2O3處理后凋亡通路被激活卻沒有明顯的凋亡現(xiàn)象。為了解釋這些現(xiàn)象，檢測了凋亡抑制基因Bcl-2及凋亡促進基因Bax在基因及蛋白水平的表達情況及凋亡抑制基因Survivin在基因水平的表達情況。

Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡的線粒體途徑中起著非常重要的作用, 它們通過維持抗凋亡、促凋亡成員的平衡來維持線粒體膜的完整性[9],細胞中單獨的Bcl-2表達水平的下降或Bax表達水平的上升并不能決定細胞是否凋亡，而Bcl-2/Bax比值的降低則表明細胞走向凋亡[10-11]。Survivin蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)Survivin基因可以直接抑制Caspase-3和 Caspase-7的活性，從而阻斷細胞的凋亡過程[12]。研究結(jié)果顯示在兩株細胞中其Survivin基因為高表達，說明與文獻報道的造血系統(tǒng)腫瘤經(jīng)常存在Survivin過度表達情況一致[13]。

As2O3處理NB4細胞后，與Survivin基因和Bcl-2基因表達快速下調(diào)。Survivin基因表達的下調(diào)解除了對線粒體中細胞色素C釋放及Caspase-3 活性的的抑制,消除了凋亡抑制環(huán)節(jié)；同時NB4細胞中Bcl-2表達下降，且Bcl-2/bax比值下降，意味著線粒體膜通透增加，有利于細胞色素C的釋放，促進凋亡信號的傳遞[14]，在NB4細胞中，As2O3從抑制Survivin基因表達和上調(diào)Bcl-2/bax比值兩個方面，解除抑制凋亡因素，促進凋亡信號沿著線粒體途徑向下傳遞。這是NB4細胞出現(xiàn)細胞凋亡的重要原因。而在HL-60細胞中，Bcl-2表達量是NB4中表達量的4～9倍，并且隨著As2O3處理時間增加而上調(diào)；同時Bcl-2/bax比值也在As2O3處理過程中沒有明顯的變化，表明線粒體途徑在在As2O3處理過程仍然被高表達的Bcl-2抑制；表達量未明顯下降的Survivin同樣是抑制HL-60細胞中線粒體途徑的重要因素。HL-60細胞株中Caspases-9活性形式的出現(xiàn)較晚，也可以證實該細胞中線粒體途徑被抑制。HL-60細胞中，Caspase-3、Caspase-8在12h時就出現(xiàn)了活性形式，而Caspases-9活性形式的出現(xiàn)較晚，說明HL-60細胞在As2O3誘導12h內(nèi)死亡受體途徑最先激活，并且由此途徑激活了Caspase3,而線粒體途徑在As2O3誘導72h后才被激活。雖然 12h 后HL60細胞中就出現(xiàn)了活性形式的Caspase3，但由于Survivin基因表達未顯著下降，細胞內(nèi)的Survivin蛋白抑制了Caspase3的活性，使得凋亡信號的向下傳導被阻斷，所以HL-60并沒有走向凋亡。這些研究結(jié)果提示： 在NB4細胞中，As2O3通過線粒體途徑和死亡受體途徑有效地誘導凋亡細胞凋亡；而在HL-60細胞中，Bcl-2及Survivin不能被As2O3有效地抑制，線粒體途徑的激活被顯著延滯，通過死亡受體途徑產(chǎn)生的活性形式的Caspase3也被Survivin抑制了活性，導致了HL60細胞凋亡的抑制。

兩種細胞在p53基因的細胞遺傳學變異上有顯著的區(qū)別[15]，NB4細胞中存在野生型p53基因的突變，HL60細胞中p53基因缺失，NB4細胞中有突變型p53基因及蛋白的表達，HL60細胞中則沒有p53基因及蛋白的表達，并且這兩種細胞都存在Survivin基因的過度表達[16]。Survivin與p53在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，兩者之間的關(guān)系密切，通過直接相互作用及p2l-Rb-E2F信號通路等相互作用。有研究表明野生型p53在體內(nèi)可與Survivin啟動子結(jié)合，從而抑制Survivin基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達及p53基因的突變，由于顯性負效應作用，突變型P53蛋白抑制了野生型p53蛋白的功能，喪失了對Survivin基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而可以使Suvivin基因的異常高表達[17-18]。

As2O3處理后，NB4細胞中p53基因的表達量沒有明顯變化,見圖4C，但突變型P53蛋白在細胞內(nèi)的水平呈現(xiàn)出顯著的下降,見圖5。說明As2O3降低了突變型P53蛋白對野生型P53正常生理功能的抑制。已有的研究證實As2O3通過破壞PML及PML-NBs降解PML/RARa，從而保護P53正常的生理功能[19]。Joe等研究結(jié)果也顯示，在NB4細胞中As2O3通過P53途徑誘導細胞凋亡[20]。據(jù)此可推斷出As2O3誘導后,NB4細胞中野生型P53的功能得到恢復，有效抑制了Survivin基因的表達，從而解除了Survivin對細胞凋亡的抑制,使NB4細胞最終走向凋亡。HL60細胞中直接抑制Survivin基因表達的p53基因缺失，造成As2O3不能通過p53信號通路直接抑制Survivin基因表達，所以，HL-60細胞在As2O3誘導后Survivin基因下調(diào)不顯著。由于As2O3誘導HL-60走向分化的同時也顯著下調(diào)C-myc基因表達，所以HL-60細胞增殖被顯著抑制[21]。但高表達的Survivin基因制仍然繼續(xù)抑制細胞凋亡途徑。這可能是NB4和HL60細胞對As2O3的細胞增殖抑制率相近，而對Al2O3誘導的細胞凋亡率差異顯著的原因之一。

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Mechanisms of arsenic trioxide-induced apoptosis in NB4 and HL60 cells

ZHANGXue-lian1，ZHOUZun-hai1，ZHANGLi-qiang3,WANGBo1，JIAYu-fang4，LIANGAi-bin2

(1. Dept. of Endocrinology， Yangpu Hospital, Tongji University， Shanghai 200090， China； 2. Dept. of Hematology， Tongji Hospital, Tongji University， Shanghai 200065， China； 3. Shanghai Cellgene bio Pharmaceutical Co. Ltd.， Shanghai 201203, China； 4. Dept. of Gynecology， Jining First People’s Hospital， Jining 272011, Shandong Province, China)

Objective To investigate the mechanism of arsenic trioxide (As2O3) -induced apoptosis in acute promyelocytic leukemia(APL)NB4 and HL60 cells．Methods NB4 and HL60 cells were treated with As2O3at different concentrations. Cell proliferation was determined by WST-8 assay. The apoptosis rate was detected by flow cytometry with annexinV-FITC/PI double staining．The mRNA expression of apoptosis-related genes caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2,Bax, the proto-oncogene C-myc, survivin, p53 and granulocytes differentiation antigen CD11b was detected by RT-PCR. The expression of apoptosis-related proteins caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, Bcl-2，Bax was determined by Western blotting. Results Arsenic trioxide proliferation of NB4 and HL60 cells with similar sensitivity. As2O3induced apoptosis of NB4 cells, but induced HL-60 differentiation to mature stage. Western blot detection and RT-PCR results showed that As2O3treatment caused up-regulation of Bax, caspase-3, Caspase-8, Caspase-9, CD11b mRNA levels, and protein levels of caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 in both cell lines. The expression of survivin, C-myc, Bcl-2 and mutated p53 in NB4 cells treated with As2O3significantly decreased. The expression of C-myc in HL60 cells treated with As2O3significantly decreased, but survivin and Bcl-2 expression levels were not changed. Conclusion Arsenic trioxide can effectively inhibit proliferation of NB4 and HL60 cells, and induce apoptosis of NB4 cells, while induce HL-60 differentiation to mature stage. These effects may be associated with the altered expression of survivin, Bcl-2 and mutated p53 genes.

arsenic trioxide; cell apoptosis; NB4； HL-60; survivin; p53

10.16118/j.1008-0392.2016.03.002

2015-09-12

國家自然科學基金(81270615)；上海市衛(wèi)生局科研基金(20134470)

張雪蓮(1979—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail: 13761219860@163.com

梁愛斌.E-mail： 1ab7182@#edu.cn

R 551

A

1008-0392(2016)03-0008-08