顧丹萍， 馮曉丹， 王建軍

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院婦產科，上海 200125； 3. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦產科，上海 200065)

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·基礎研究·

E26轉錄因子和VEGF在卵巢上皮性腫瘤中的表達及意義

顧丹萍1， 馮曉丹2， 王建軍3

(1. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092； 2. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院婦產科，上海 200125； 3. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦產科，上海 200065)

目的 探討E26轉錄因子(E26 transformation specific-1, Ets-1)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在卵巢上皮性腫瘤中的表達及意義。方法 在55例卵巢上皮性腫瘤以及12例正常卵巢組織中，采用免疫組化SP法檢測其中Ets-1及VEGF蛋白的表達；原位雜交法檢測組織中Ets-1mRNA的表達。結果 Ets-1及VEGF在卵巢上皮性癌中的表達顯著高于正常、良性及交界組(P<0.01)。FIGO Ⅲ-Ⅳ期組中Ets-1以及VEGF蛋白的表達均高于FIGO Ⅰ-Ⅱ早期組(P<0.05)；腫瘤細胞低分化組中Ets-1的表達明顯高于中高分化組(P<0.01)；有淋巴結轉移組中兩者表達高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；Ets-1蛋白和m RNA的表達顯著相關(rs為0.609，P<0.01)；腫瘤組織中Ets-1和VEGF的表達密切相關(rs=0.288，P<0.05)。結論 Ets-1和VEGF是卵巢上皮性腫瘤中重要的促血管生成因子，與腫瘤的發(fā)展轉移及患者的預后關系密切。

E26轉錄因子； 血管內皮生長因子； 卵巢上皮性腫瘤； 原位雜交； 免疫組織化學

腫瘤的生長和轉移依賴于腫瘤血管形成。近年來，作為腫瘤組織血管生成的重要因子，E26轉錄因子(E26 transformation specific-1， Ets-1)受到人們越來越多的關注。在卵巢腫瘤中，上皮來源的腫瘤約占原發(fā)性卵巢腫瘤的50%～70%，其中，漿液性腫瘤是最為常見的一種[1]。本研究以卵巢上皮漿液性腫瘤為研究對象，探討Ets-1和VEGF在卵巢腫瘤主要是上皮性腫瘤的血管生成、發(fā)展和轉移中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取2011年1月至2015年1月上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院病理科55例卵巢上皮漿液性腫瘤手術切除的石蠟標本，其中包括漿液性囊腺癌34例，交界性漿液性囊腺瘤8例，漿液性囊腺瘤13例。根據(jù)FIGO標準臨床分期，漿液性囊腺癌34例中包括早期14例(Ⅰ～Ⅱ期)，晚期20例(Ⅲ～Ⅳ期)；盆腔淋巴結轉移陽性者23例，陰性11例；WHO分級高分化7例，中分化9例，低分化18例。在所有病例中，均有明確的病理組織學診斷、以及完整的臨床資料。所選蠟塊均復查H-E切片無誤。另取12例癌旁正常組織為對照。55例腫瘤患者中，其年齡分布為17～77歲，平均年齡(45±14.9)歲；正常對照組中，其年齡分布22～69歲，平均年齡(45±13.5)歲，其組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 試劑

鼠抗人Ets-1多克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、SP試劑盒均購自北京中山生物技術有限公司。原位雜交用寡核苷酸探針由北京奧科生物技術有限公司合成，原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德公司。

1.3 方法

所有標本經固定包埋制成蠟塊后連續(xù) 4～6μm切片，粘貼于0.1%多聚賴氨酸處理過的玻片上，采用免疫組化SP法檢測Ets-1和VEGF蛋白的表達，原位雜交法檢測Ets-1m RNA的表達。鼠抗人Ets-1多克隆抗體濃度1∶400、鼠抗人VEGF單克隆抗體1∶100，以PBS液代替一抗作空白對照，已知的陽性片作為陽性對照，免疫組化SP法操作按照試劑盒步驟進行。原位雜交用寡核苷酸探針遵守分子雜交原則設計合成，并在5′端標記生物素，其序列如下： 5′-CGTCTTGATGATGGT-GAGAGTCGGCTTGAG-3′。陰性對照使用正義探針，即與探針序列互補的mRNA序列，和省去探針的雜交液；陽性對照使用已知的陽性片子。雜交前預處理、預雜交、雜交后處理以及顯色按照試劑盒步驟進行。

1.4 判定方法

根據(jù)每個細胞的染色強度，分為陰性、弱陽性、陽性和強陽性。弱陽性以上為陽性細胞。使用文獻[2]的方法作為對腫瘤組織判定標準的參照并加以修改，即根據(jù)單個細胞的染色深淺以及陽性細胞數(shù)量進行判定。(-)： 陽性細胞數(shù)<30%；(±)： 陽性細胞數(shù)31%～60%；(+)： 陽性細胞數(shù)61%～80%；(++)： 陽性細胞數(shù)≥81%。在每例標本中，若陽性細胞率在61%以上，則認為該例為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件行測試數(shù)據(jù)的χ2檢驗和Spearman相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Ets-1和VEGF的表達及其與腫瘤臨床病理特征之間的關系

Ets-1和VEGF的mRNA和蛋白的陽性顆粒主要分布在腫瘤細胞的胞漿中，陽性細胞的分布有明顯的異質性，在間質血管內皮細胞的胞漿中也可有表達。

卵巢上皮性癌組織中Ets-1和VEGF的陽性表達率明顯高于正常組、良性組及交界性組(P均<0.01)，而VEGF在正常組、良性組和交界性組三者中的表達差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。Ets-1和VEGF的表達均與FIGO分期呈負相關，其陽性表達率Ⅰ～Ⅱ期早期組低于Ⅲ～Ⅳ期組(P<0.05、P<0.01)，見表2。卵巢上皮性癌組織中細胞中、高分化組Ets-1 mRNA及蛋白的表達陽性率明顯低于低分化組(P<0.01)，而中、高分化組間相比較并無顯著性差異(P>0.05)，VEGF蛋白的表達則與腫瘤細胞分化程度無關(P>0.05)，見表3。上皮性癌的淋巴結轉移與兩者的表達密切相關，無淋巴結轉移組中兩者的陽性表達率低于有淋巴結轉移組(P<0.01、P<0.05)，見表4。

表1 Ets-1和VEGF的表達與標本組織類型的關系

與惡性組相比，*P<0.05,**P<0.01

表2 Ets-1和VEGF的表達與臨床病理分期的關系

與Ⅰ～Ⅱ期組相比，*P<0.05,**P<0.01

表3 Ets-1和VEGF的表達與細胞分化程度的關系

與低分化組相比，**P<0.01

表4 Ets-1和VEGF的表達與淋巴結轉移的關系

與無淋巴結轉移組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 Ets-1mRNA和蛋白表達在不同組織類型中的相關性

在36例Ets-1mRNA陽性表達病例中，Ets-1蛋白陽性表達率為83.3%(30/36)；在31例Ets-1mRNA陰性表達病例中，Ets-1蛋白陽性表達率為22.6%(7/31)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Ets-1mRNA和蛋白表達顯著相關(rs=0.609，P<0.01)。

2.3 Ets-1和VEGF蛋白表達在卵巢上皮漿液性腫瘤中的相關性

在37例Ets-1蛋白陽性表達的患者中，VEGF蛋白陽性表達率為78.4%(29/37)；在18例Ets-1蛋白陰性表達的患者中，VEGF蛋白陰性表達率為50.0%(9/18)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腫瘤組織中Ets-1和VEGF的表達密切相關(rs=0.288，P<0.05)。

3 討 論

3.1 Ets-1和VEGF誘導腫瘤血管生成的機制

腫瘤血管的形成及其調節(jié)是多種因素共同作用的結果，是一個極為復雜的過程。在卵巢腫瘤中，作為卵巢腫瘤最為重要的血管生成因子，VEGF可能誘導Ets-1的表達，發(fā)揮原癌基因的作用。而Ets-1則作為血管生成的中介因素，通過其DNA結合Ets結構域，同多種血管生成相關因子(如MMPs，整合素β3等)的啟動子或增強子區(qū)域中富含嘌呤的序列GGA(A/T)相結合，從而在該類基因表達調控中發(fā)揮作用，進而促進腫瘤血管的生成[3-4]。研究[5]表明，間質的微血管密度MVD值與Ets-1和VEGF蛋白表達量密切相關，這表明此二者參與了腫瘤血管生成過程。在本研究中，腫瘤組織內VEGF和Ets-1的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且兩者的表達呈正相關，支持了VEGF通過誘導Ets-1基因表達促進腫瘤血管生成的觀點。

3.2 Ets-1和VEGF在卵巢腫瘤發(fā)展及浸潤轉移中的作用和機制

惡性腫瘤的主要特點包括自主性生長和侵襲性轉移，轉移灶的大量形成往往是腫瘤終末期患者的死因。在侵犯正常組織的過程中，惡性腫瘤細胞一般要經歷黏附、降解、穿越基底膜(ECM)等幾個步驟。由于腫瘤組織中新生血管形成可以被Ets-1和VEGF所誘導，并與腫瘤侵襲過程相關的黏附分子(如整合素β3、VE-cadherin和蛋白水解酶類如u-PA、MMPs等)還可被Ets-1激活，故Ets-1有助于惡性腫瘤穿越基底膜，進而發(fā)生局部浸潤和遠處轉移。研究[5-6]表明，Ets-1和VEGF的高表達與FIGO的較高分期、細胞低分化、淋巴結轉移等密切相關，提示二者在腫瘤的發(fā)展和轉移過程中起著重要的作用。本研究支持上述結論。

另外，多種腫瘤的相關研究表明，Ets-1在腫瘤組織中的表達情況是評價腫瘤細胞惡性潛能和預后的指標，Ets-1的高表達往往預示了患者預后不良，此與其促進腫瘤血管生成和腫瘤浸潤轉移生物學特性密切相關。血管生成對于腫瘤的生長和浸潤轉移是非常必須的，而隨著轉移灶的大量形成，患者的預后也不斷惡化。研究[6]表明，腫瘤組織中Ets-1的表達水平均與微血管計數(shù)MVCs相關，且高表達Ets-1的病例24個月生存率顯著低于Ets-1低表達者，提示其與預后關系密切。

3.3 Ets-1和VEGF在抗血管生成治療腫瘤方面的意義和前景

基于Ets-1和VEGF在腫瘤血管生成和發(fā)生發(fā)展方面的重要作用，近年來，以Ets-1和VEGF為靶點的抗腫瘤治療受到了人們的廣泛關注，也取得了重大進步。作為血管通透性因子以及血管內皮細胞特異性生長因子，VEGF在抗血管新生療法中引起了人們的極大興趣[8]。實驗證實，如果使用結構域陰性突變的Ets-1分子或反義寡核苷酸鏈阻斷其作用，那么如MMPs，整合素β3等相應的靶分子的表達水平也會有所下降，進而使血管的生成受到抑制[9]。Khatunn等[6]發(fā)現(xiàn)，在VEGF和Ets-1兩者共同發(fā)揮作用時，對腫瘤的抑制作用更加有效。作為主要的負性調節(jié)因子和Ets-1的特異性抑制劑，轉優(yōu)勢突變型Ets-1(transdominant mutant Ets-1)可以抑制Ets-1的功能，并且可能成為抑制腫瘤血管生成的有效工具。

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doi： 10.16118/j.1008-0392.2016.02.004

Expression of Ets-1 and VEGF in epithelial ovarian neoplasms and its clinicopathological significance

GUDan-ping1，F(xiàn)ENGXiao-dan2，WANGJian-jun3

(1. Medical College, Tongji University， Shanghai 200092, China; 2. Dept. of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Punan Hospital of Pudong New Area, Shanghai 200125, China; 3. Dept. of Gynecology and Obstetrics, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To examine the expression of E26 transformation specific-1(Ets-1) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in epithelial ovarian neoplasm, and its clinicopathological significance. Methods The expression of Ets-1 and VEGF proteins were detected by immun-ohistochemistry, and the expression of Ets-1mRNA was detected byinsituhybridization in 55 tissue samples of epithelial ovarian neoplasms and 12 samples of pericancerous ovarian tissue. Results Serous cystadenocarcinoma had higher expression of both Ets-1 and VEGF than normal ovarian tissue, serous cystadenoma and borderline serous cystadenoma(P<0.01). The expression of Ets-1 and VEGF in ovarian carcinomaⅠ-Ⅱ stage was lower than that in carcinoma Ⅲ-Ⅳ stage (P<0.05); expression of Ets-1 in low histological grade ovarian carcinoma was higher than that in middle and high histological grade carcinoma (P<0.01); the expression of Ets-1 and VEGF in ovarian carcinoma without lymph nodes metastasis was lower than that in those with metastases (P<0.05). The expression of Ets-1 mRNA was positively correlated with expression of Ets-1 and VEGF proteins (rs=0.609,rs=0.288, respectively, bothP<0.05). Conclusion The results indicate that Ets-1 and VEGF may be involved in the development and metastases of epithelial ovarian neoplasms.

E26 transformation specific-1; vascular endothelial growth factor; epithelial ovarian neoplasm;insituhybridization; immunohistochemistry

10.16118/j.1008-0392.2016.02.003

2015-12-20

顧丹萍(1975—)，女，主治醫(yī)師，學士.E-mail：13501946485@163.com

王建軍.E-mail： jjwang0524@sina.com

R 737.31

A

1008-0392(2016)02-0010-04