高國(guó)瑗 鄭希元 彭淵 陶艷艷 劉平 楊濤 劉成海

[摘要]探討扶正化瘀膠囊（Fuzheng Huayu capsules，F(xiàn)HC）對(duì)二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠血清代謝組學(xué)的影響。應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分別建立對(duì)照組、模型組和FHC組的大鼠血清代謝圖譜，并定量分析各組內(nèi)源性代謝物——氨基酸和膽汁酸水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)HC組大鼠的血清代謝指紋譜與模型組存在顯著差異，采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLSDA）初步鑒定了潛在5種溶血磷脂膽堿類生物標(biāo)記物。再通過(guò)定量分析各組大鼠血清氨基酸和膽汁酸的水平，發(fā)現(xiàn)FHC治療4周后血清中失調(diào)的14種氨基酸和5種膽汁酸水平明顯有回歸正常水平的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，F(xiàn)HC抗肝纖維化作用機(jī)制可能涉及到溶血磷脂膽堿類、氨基酸和膽汁酸的代謝過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]扶正化瘀；肝纖維化；代謝組學(xué)；液質(zhì)聯(lián)用；生物標(biāo)記物

[Abstract]To investigate the effect of Fuzheng Huayu capsule（FHC） on serum metabolomics in rats with liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine（DMN） The metabolic profiles of rat serum of normal group， model group， and FHC group were established by liquid chromatographymass spectrometry technology Furthermore， the levels of endogenous metabolites such as amino acids and bile acids were measured in each group The results showed that there were significant differences in the serum metabolic fingerprints between the FHC group and the model group Moreover， 5 potential lysophosphatidylcholines biomarkers were identified by using principal component analysis（PCA） and partial least squares discriminant analysis （PLSDA） Quantitative analysis of amino acids and bile acids in serum of rats showed that 14 kinds of amino acids and 5 kinds of bile acids returned to normal levels after four weeks of FHC treatment In conclusion， the antihepatic fibrosis mechanisms of FHC may be related to the metabolic process of lysophosphatidylcholines， amino acids and bile acids

[Key words]Fuzheng Huayu capsules； liver fibrosis； metabolomics； UPLCMS/MS； biomarker

doi：10.4268/cjcmm20160925

扶正化瘀膠囊（Fuzheng Huayu capsules，F(xiàn)HC）是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）批準(zhǔn)的抗肝纖維化中藥產(chǎn)品，由蟲草菌絲、丹參、桃仁、五味子、松黃粉及絞股藍(lán)組成，針對(duì)慢性乙肝、肝炎后肝硬化正氣（肝、脾、腎）虛損、血瘀阻絡(luò)、濕熱內(nèi)留這一中醫(yī)基本證候病機(jī)特點(diǎn)。該方可改善肝炎后肝硬化患者肝功能、調(diào)整異常免疫功能和降低血清肝纖維化標(biāo)志物水平等，對(duì)乙肝肝纖維化的組織學(xué)逆轉(zhuǎn)率達(dá)52%，且肝組織炎癥活動(dòng)度也有明顯改善[1]。其作用機(jī)制包括抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、保護(hù)肝細(xì)胞炎性壞死與凋亡、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β1/Smads 信號(hào)通路與抑制肝星狀細(xì)胞（HSC）活化、調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)代謝和抑制肝血管新生等[2]。通過(guò)血清成分分析發(fā)現(xiàn)一些潛在抗肝纖維化的活性成分[3]，并發(fā)現(xiàn)這些成分在肝纖維化大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)與組織分布存在明顯的差異[4]。課題組在最近研究中采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)臨床肝硬化腹水的患者血清中3種磷脂膽堿類的潛在標(biāo)志物，并且還發(fā)現(xiàn)血清中氨基酸和膽汁酸代謝均有顯著變化[5]。FHC（片）作為臨床常用的抗肝纖維化中藥，在治療肝纖維化的過(guò)程中對(duì)血清代謝組學(xué)是否會(huì)產(chǎn)生影響還不得而知。本文擬建立二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)考察FHC治療后的肝纖維化大鼠代謝組學(xué)的變化特征，重點(diǎn)對(duì)前期臨床發(fā)現(xiàn)的血清代謝組學(xué)特征物進(jìn)行研究，闡明FHC對(duì)肝纖維化大鼠代謝組學(xué)的影響，為從代謝組學(xué)角度闡明扶正化瘀方的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料

ACQUITYTM超高效液相色譜儀SYNAPT G2高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLCQuattro Premier XE超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀及MassLynxTM 41工作站軟件（美國(guó) Waters 公司）；病理分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司），包括自動(dòng)脫水機(jī)（ASP300）、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM2035）、包埋機(jī)（EG1160）、浸蠟機(jī)（HI1210）、烤片機(jī)（HI1220）；5415R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf 公司）；BP211D 電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；SB5200D超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；VX200渦旋振蕩器（美國(guó) Labnet Inernational公司）；PURELAB classic UVF 純水儀（英國(guó)ELGA公司）。

FHC（批號(hào)110202，規(guī)格03 g）由上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司提供；二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；血清肝功能試劑盒，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、甲硫氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、天門冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、亮氨酸（Lue）、異亮氨酸（Ile）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、膽酸（CA）、去氧膽酸（DCA）、鵝去氧膽酸（CDCA）、豬去氧膽酸（HDCA）、甘氨膽酸（GCA）、牛磺膽酸（TCA）、?；侨パ跄懰幔═DCA）、?；蛆Z去氧膽酸（TCDCA）、?；秦i去氧膽酸（THDCA）等均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；色譜純乙腈和甲醇購(gòu)自Fisher 公司；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水（Millipore 制備）；其他分析純?cè)噭┚?gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

Wister大鼠30只，雄性，體重（180±20） g，SPF級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（滬）20070005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食飲水。

2方法

21模型制備與給藥

所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，按體重分層，隨機(jī)分為對(duì)照（Control）、模型（Model）和FHC 3組，每組10只。模型組與FHC組腹腔注射DMN，劑量10 μg·kg-1，每周連續(xù)3 d ，連續(xù)4周，首次注射劑量為正常劑量2/3[6]。造模第3周，F(xiàn)HC組給予扶正化瘀膠囊40 g·kg-1（相當(dāng)于60 kg成人體重劑量），每周連續(xù)7 d，連續(xù)4周。對(duì)照組大鼠給予等體積雙蒸水灌胃，劑量為2 mL·kg-1。

22樣品的采集與處理

分別于DMN造模前、造模后和給藥4周后（最后一次給藥后24 h），經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采全血2 mL，于4 ℃冰箱靜置2 h，再以4 000 r·min-1離心10 min，分離血清，-80 ℃保存；最后一次取血后，各組大鼠脫頸椎處死，并打開(kāi)腹腔，摘取肝臟，取最大葉03 cm×08 cm×10 cm大小的肝組織2塊，用于普通病理。

23肝功能與肝纖維組織病理學(xué)觀察

血清肝功能指標(biāo)ALT，AST和ALB的活性采用相關(guān)試劑盒檢測(cè)。肝組織經(jīng)40 g·L-1甲醛溶液固定之后，予梯度酒精脫水，石蠟包埋， 分別進(jìn)行蘇木精伊紅染色（HE染色）和天狼猩紅染色，光鏡下觀察肝組織炎癥和纖維化程度。

高國(guó)瑗等：扶正化瘀膠囊對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清代謝組學(xué)的影響24代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集

241血清樣品制備精密吸取100 μL大鼠血清，加入乙腈甲醇（1∶1）混合溶液400 μL，渦旋振蕩1 min，4 ℃離心15 min（20 000×g），得到上清液A。上清A用乙腈甲醇溶液稀釋后，用于UPLCMS樣本分析和氨基酸輪廓分析。取上清A 300 μL并氮?dú)獯蹈桑?5 ℃）。殘?jiān)?00 μL的初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，4 ℃再離心10 min（20 000×g），吸取上清液B，用于UPLCMS膽汁酸輪廓分析。

242代謝指紋譜的色譜質(zhì)譜條件色譜條件：WatersACQUITYTM UPLC系統(tǒng)，配以ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（21 mm×150 mm， 18 μm）；流動(dòng)相水（A）乙腈（B），梯度洗脫，0～6 min，90%～40%A，6～10 min，40%～20%A，10～16 min，20%～10%A，16～165 min，10%～90%A，流速03 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：MALDO SYNAPTTM G2 高分辨質(zhì)譜儀（Waters，美國(guó)），電噴霧離子化（ESI）源。正離子全掃描模式時(shí)，毛細(xì)管電壓35 kV；錐孔電壓35 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度300 ℃；脫溶劑氣流速800 L·h-1（N2）；錐孔氣流50 L·h-1。負(fù)離子全掃描模式時(shí)，毛細(xì)管電壓28 kV；錐孔電壓45 V，其他條件同正離子模式；N2（純度999%）和氬氣（純度99999%）分別用作錐孔氣及碰撞氣。質(zhì)譜范圍m/z 100～1 000；掃描時(shí)間02 s。

243氨基酸和膽汁酸的定量分析氨基酸定量分析參照文獻(xiàn)[7]。色譜條件：WatersACQUITYTM UPLC系統(tǒng)，色譜柱為TSKGEL AMIDE80（50 mm×20 mm， 3 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）5 mmol·L-1醋酸銨（01%甲酸，B），梯度洗脫，0～3 min，70%A，3～55 min，70%～50%A，55～80 min，50%A，流速015 mL·min-1；柱溫45 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。質(zhì)譜條件：ESI源；正離子檢測(cè)；離子源溫度20 ℃；脫溶劑溫度300 ℃；脫溶劑氣（N2）；流速600 L·h-1；錐孔氣（N2）；流速50 L·h-1；碰撞氣為氬氣（Ar）；碰撞能15 eV。

膽汁酸定量分析參照文獻(xiàn)[8]。色譜條件：WatersACQUITYTM UPLC系統(tǒng)，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH 柱 （10 mm × 100 mm，17 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）5 mmol·L-1醋酸銨（01%甲酸，B），梯度洗脫，0～1 min，55%A，1～26 min，55%～62%A，26～114 min，62%～80%A，流速03 mL·min-1；柱溫45 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL。質(zhì)譜條件：ESI源；負(fù)離子檢測(cè)；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度300 ℃；脫溶劑氣（N2）流速700 L·h-1；錐孔氣（N2）流速50 L·h-1；碰撞氣為氬氣（Ar）；碰撞能20～35 eV。

氨基酸和膽汁酸的定量方法學(xué)驗(yàn)證依據(jù)美國(guó)FDA生物樣品分析指導(dǎo)原則實(shí)施，分別進(jìn)行校正曲線、精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率、基質(zhì)效應(yīng)等方法學(xué)驗(yàn)證研究，其結(jié)果均在可接受范圍。

25數(shù)據(jù)采集與處理

采用SPSS 180軟件中OneWay ANOVA對(duì)藥理數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用±s表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，結(jié)果以P<005表示有顯著性差異。血清代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采用MassLynxTM 41工作軟件、SIMCAP（version 120，Umetrics，Umea，瑞典）中主成分分析（PCA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3結(jié)果與分析

31生化及病理實(shí)驗(yàn)

311FHC對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響與對(duì)照組相比，模型組血清ALT和AST水平顯著性上升（P<001），ALB水平顯著性下降（P<001）。經(jīng)FHC給藥后，血清ALT和AST水平顯著性下降（P<001），血清ALB水平有一定差異（P=007），結(jié)果見(jiàn)表1。

312FHC對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理的影響光鏡下HE染色顯示，正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，可見(jiàn)少許竇旁細(xì)胞，匯管區(qū)可見(jiàn)極少量纖維結(jié)締組織。造模4周結(jié)束時(shí)模型大鼠肝臟可見(jiàn)大面積出血壞死，并見(jiàn)大量腫脹壞死的肝細(xì)胞，同時(shí)有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇扭曲變形；匯管區(qū)明顯

表1扶正化瘀膠囊對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化大鼠血清肝功能水平的影響

Table 1Effects of FHC on serum ALT，AST and ALB in rats simulated by DMN

組別ALT/U·L-1AST/U·L-1ALB/g·L-1對(duì)照101±33255±54373±25模型520±1232）615±1242）286±182）FHC184±484）338±834）297±24注：與對(duì)照組相比1）P<005，2）P<001； 與模型組相比3）P<005，4）P<001（圖5，6同）。

增寬，廣泛增生的纖維組織形成間隔，將肝小葉分割包繞成大小不等的假小葉；經(jīng)FHC給藥后，大鼠肝臟的肝細(xì)胞變性、壞死，肝內(nèi)出血、纖維增生都有不同程度的改善。天狼猩紅染色顯示正常大鼠肝臟內(nèi)僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見(jiàn)到少量膠原纖維。模型大鼠肝臟纖維組織彌漫性增生嚴(yán)重，大多數(shù)形成較厚的完全間隔，向肝小葉組織內(nèi)伸展，分割包繞肝組織，形成假小葉；經(jīng)FHC給藥后，大鼠肝臟彌漫性纖維組織增生程度減輕，纖維間隔菲薄，見(jiàn)圖1。

A和D為對(duì)照組，B和E為模型組，C和F為 FHC組；A，B，C為HE染色，D，E，F(xiàn)為肝組織天狼星紅染色。

圖1肝組織HE 染色（×200）和肝組織天狼星紅染色（×100）

Fig1HE staining in hepatic tissue（×200） and sirius red staining in hepatic tissue（×100）

32血清代謝組學(xué)

321各組大鼠血清樣品總離子流色譜圖為了篩選大鼠血清的代謝組學(xué)特征，樣品采用UPLCG2高分辨質(zhì)譜分析。連續(xù)給藥4周后，對(duì)照組、模型組與FHC組大鼠血清樣品總離子色譜圖見(jiàn)圖2。

322主成分分析將所有樣本的UPLCMS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和PLSDA分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，4。結(jié)果顯示，主成分積分值集中分布于橢圓形散點(diǎn)圖的3個(gè)區(qū)域，對(duì)照組分布在右下方，模型組分布在正上方，F(xiàn)HC組分布在左下方。FHC組與對(duì)照組、模型組均存在一定距離，說(shuō)明藥物在代謝過(guò)程中對(duì)血清中化學(xué)成分的影響比較顯著。給藥后，F(xiàn)HC組各點(diǎn)有向?qū)φ战M樣本點(diǎn)接近的趨勢(shì)。

為了找出發(fā)生顯著變化（P<005）的生物標(biāo)志物，對(duì)模型組與對(duì)照組及模型組與各給藥組進(jìn)行PLSDA分析，并得到代謝物載荷圖，結(jié)果見(jiàn)圖3，4。對(duì)照組和模型組能夠很好的分開(kāi)，說(shuō)明2組之間血清中的化學(xué)成分發(fā)生明顯改變。模型組大鼠經(jīng)FHC給藥后，有向?qū)φ战M回歸的趨勢(shì)，且3組樣本間存在明顯的差異物質(zhì)。通過(guò)尋找明顯差異的化學(xué)成分，對(duì)差異物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定（通過(guò)精確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)照品及其二級(jí)碎片比對(duì)），初步鑒定了其中5個(gè)差異性物質(zhì)，即潛在生物標(biāo)記物，分別為溶血磷脂膽堿（C18∶0），溶血磷脂膽堿（C16∶2），溶血磷脂膽堿（C15∶1），TCDCA碎片，TCA碎片，結(jié)果見(jiàn)表2。

323氨基酸代謝輪廓分析連續(xù)給藥4周后，對(duì)照組、模型組和FHC組大鼠血清中氨基酸水平見(jiàn)圖5。與對(duì)照組比較，模型組的芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸的血清水平升高非常顯著（P<001）；而色氨酸、纈氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、亮氨酸、谷氨酸、脯氨酸和組氨酸等12種氨基酸下降非常顯著（P<001）；甲硫氨酸和谷氨酰胺含量無(wú)顯著性差異。經(jīng)FHC治療4周

324膽汁酸代謝輪廓分析連續(xù)給藥4周后，對(duì)照組、模型組和FHC組大鼠血清中膽汁酸水平見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠血清中牛磺豬去氧膽酸、牛磺膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、豬去氧膽酸和膽酸的水平非常顯著高于對(duì)照組（P<001），?；侨パ跄懰崴揭诧@著性上升（P<005）；且鵝去氧膽酸水平呈非常顯著性下降（P<001），甘氨膽酸含量也呈顯著性下降（P<005）；去氧膽酸則無(wú)顯著性差異。經(jīng)FHC治療4周后，與模型組大鼠比較，?；秦i去氧膽酸、?；悄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、豬去氧膽酸、膽酸等5種膽汁酸水平下降非常顯著（P<001），呈回歸正常水平的趨勢(shì)。

4討論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新學(xué)科，是通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，是研究生物體系的一門科學(xué)[9]。代謝組學(xué)與中醫(yī)治療疾病的整體觀念相一致，在疾病診斷及藥物研發(fā)等方面已有廣泛應(yīng)用[1011]。代謝組學(xué)在肝臟相關(guān)研究中已有所應(yīng)用，如關(guān)于逍遙散對(duì)大鼠肝纖維化保護(hù)作用的機(jī)制研究[12]，以及疏肝健脾方防治肝纖維化的可能作用機(jī)制研究[13]。本研究首次采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，考察了FHC對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清代謝組學(xué)的影響，結(jié)合主成分分析法，發(fā)現(xiàn)FHC治療后，代謝指紋譜圖與模型組大鼠存在顯著差異，并且鑒定出溶血磷脂膽堿（C18∶0），溶血磷脂膽堿（C16∶2），溶血磷脂膽堿（C15∶1），TCDCA碎片，TCA碎片等5種潛在生物標(biāo)記物，可用于定性表征FHC的治療作用。此外，肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝的中樞器官，富含與氨基酸分解代謝有關(guān)的酶，是氨基酸代謝的重要場(chǎng)所之一，在氨基酸的新陳代謝及蛋白質(zhì)的合成與分解中發(fā)揮了重要的作用。當(dāng)肝細(xì)胞功能障礙時(shí)，氨基酸代謝受到影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化后，除甲硫氨酸和谷氨酰胺含量無(wú)顯著性差異，血清中有另外16種內(nèi)源氨基酸水平發(fā)生顯著改變。而FHC治療后內(nèi)源氨基酸水平有顯著回歸正常水平的趨勢(shì)，這印證肝功能指標(biāo)和肝纖維化病理切片的數(shù)據(jù)，提示FHC糾正了肝纖維化導(dǎo)致的血清氨基酸水平的紊亂。同樣的現(xiàn)象在膽汁酸代謝中也被發(fā)現(xiàn)。膽汁酸是在肝細(xì)胞內(nèi)由膽固醇轉(zhuǎn)變而來(lái)，是肝臟清除體內(nèi)膽固醇的主要方式，因此，膽汁酸代謝變化可直接反映肝功能的狀態(tài)[15]。FHC的治療使肝纖維化大鼠中的?；秦i去氧膽酸、?；悄懰?、?；蛆Z去氧膽酸、豬去氧膽酸、膽酸等5種紊亂的膽汁酸水平向正常水平回歸趨勢(shì)。總而言之，F(xiàn)HC對(duì)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清代謝物質(zhì)紊亂有明顯的恢復(fù)作用，其抗肝纖維化作用機(jī)制可能涉及到溶血磷脂膽堿類、氨基酸和膽汁酸的代謝過(guò)程，這為將來(lái)從這些代謝途徑闡明FHC的抗纖維化作用奠定了基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]