朱波 劉京晶 斯金平 秦路平 韓婷 趙鸝 吳令上

[摘要]為揭示初篩所得7株活樹附生鐵皮石斛內(nèi)生真菌對宿主生長及代謝成分的影響，該研究觀察測量了接菌與未接菌鐵皮石斛組培苗形態(tài)特征與農(nóng)藝性狀，采用苯酚硫酸法與熱浸法測定組培苗莖總多糖含量與浸出物含量，柱前衍生HPLC分析莖多糖中單糖組成，HPLC分析莖醇溶性成分。研究表明，供試7個菌株可改變鐵皮石斛組培苗莖節(jié)變紫進程，并影響莖糖類及醇溶性成分組成及含量積累，除DO34外均能促進組培苗生長與提高多糖含量，除DO12外均能促進甘露糖含量積累，DO18，DO19，DO120可促進醇溶性浸出物含量積累，綜合生長及代謝成分多項指標篩選出DO14，DO18，DO19與DO120 4個優(yōu)良菌株，為鐵皮石斛內(nèi)生真菌和宿主相互作用機制研究與微生物工程研究提供了菌種材料與研究基礎。

[關鍵詞]鐵皮石斛； 內(nèi)生真菌； 生長發(fā)育； 代謝成分

[Abstract]The paper aims to study the effects of endophytic fungi from D officinale cultivated on living trees on growth and components metabolism of tissue culture seedlings Morphological characteristics and agronomic characters of tissue culture seedlings infected and uninfected by endophytic fungus were observed and measured Polysaccharides and alcoholsoluble extracts contents were determined by phenolsulfuric acid method and hotdipmethod， respectively Monosacchride composition of polysaccharides and alcoholsoluble extracts components were analyzed by precolumn derivatives HPLC and HPLC method， respectively It showed that effects of turning to purple of stem nodes could be changed by endophytic fungus Besides， the endophytic fungus could affect the contents and constitutions of polysaccharides and alcoholsoluble extracts The strains tested， expect DO34， could promote growth and polysaccharides content of tissue culture seedlings The strains tested， expect DO12， could promote the accumulation of mannose Furthermore， DO18， DO19 and DO120 could increase alcoholsoluble extracts On the basis， four superior strains were selected for mechanism research between endophytic fungus and their hosts and microbiology engineering

[Key words]Dendrobium officinale； endophytic fungi； growth and development； components metabolism

doi：10.4268/cjcmm20160906

中藥材的品質(zhì)與其生長環(huán)境密切相關，生長環(huán)境包括生物性因素與非生物性因素，植物內(nèi)生真菌作為一個重要的生物性因素已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外學者的關注[14]，現(xiàn)有研究表明植物內(nèi)生真菌能促進宿主生長、提高宿主對生物脅迫或非生物脅迫的抗性[5]，能參與宿主次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，影響藥用植物的品質(zhì)[67]。

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔等癥，收載于2015年版《中國藥典》[8]。近年來，鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究引起國內(nèi)外學者的關注，但主要集中在內(nèi)生真菌分離純化、菌根真菌對植物種子萌發(fā)與幼苗生長的促進作用等方面[917]，從形態(tài)特征、農(nóng)藝性狀與代謝成分等方面系統(tǒng)評價鐵皮石斛內(nèi)生真菌與宿主間相互關系的研究鮮有報道。本試驗在前期初篩所得內(nèi)生真菌的基礎上，評價內(nèi)生真菌對組培苗生長發(fā)育與代謝成分的影響，篩選優(yōu)良菌株，為研究內(nèi)生真菌與宿主相互作用機制，改良鐵皮石斛藥材品質(zhì)提供了一條新的途徑。

1材料

供試菌株來自本課題組前期從不同活樹附生鐵皮石斛中分離的內(nèi)生真菌菌株，菌株編號為DO12，DO14，DO18，DO19，DO34，DO38，DO120（表1）。供試鐵皮石斛組培苗為D6品系，由浙江農(nóng)林大學國家林業(yè)局鐵皮石斛工程技術研究中心選育。

2方法

21形態(tài)特征觀察

將備選菌株用接種針從斜面保存試管中挑出，接入含有PDA培養(yǎng)基的平板上，放入霉菌培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)（25 ℃），待菌絲長滿平板后，用5 mm打孔器打成均勻小塊，接種至鐵皮石斛組培苗中，每瓶苗接1個菌塊，每個菌株接種組培苗30瓶。接種后，統(tǒng)計組培苗莖段出現(xiàn)紫色瓶數(shù)（以單株莖節(jié)變紫為標準），計算紫色莖節(jié)比例=紫色莖節(jié)瓶數(shù)/總瓶數(shù)×100%，不接菌的組培苗作為對照。

22農(nóng)藝性狀考察

將培養(yǎng)到一定階段的組培苗取出，洗去培養(yǎng)基，用紙巾擦拭干凈進行農(nóng)藝性狀考察。用直尺測量每株幼苗的苗高與根長，用游標卡尺測量莖基部粗、莖中部粗、葉長（葉片中脈長）與葉寬，計算葉長寬比=葉長/葉寬，統(tǒng)計每株苗根數(shù)、葉片數(shù)與萌條數(shù)，用電子天平稱量接種組培苗莖鮮重與葉總鮮重，將莖與葉放置60 ℃烘箱烘干至恒重，分別稱量莖與葉干重。每個處理測200株苗，每株苗取頂端3片葉進行考察，葉面積參考劉志高等[18]的方法估算。

23組培苗代謝成分分析

將烘至恒重的莖與葉樣品粉碎，過60目篩，待用。莖總多糖含量測定采用苯酚硫酸法[19]，標準曲線方程為Y=0012X-002，R2=0999 5，X為濃度，Y為吸光度，3次重復；參考俞巧仙等[20]的方法測定莖醇溶性浸出物，3次重復；莖醇溶性高效液相色譜條件：采用XB C18色譜柱（46 mm×250 mm，05 μm），25 ℃柱溫，流動相為純水（C）乙腈（D），采用梯度洗脫，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μL；單糖衍生參照苑鶴等[21]的方法。用SPSS 170軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。

3結果與分析

31內(nèi)生真菌對組培苗形態(tài)特征的影響

接種內(nèi)生真菌的組培苗生長一段時間后，莖段會出現(xiàn)莖節(jié)變紫現(xiàn)象，出現(xiàn)的數(shù)量、時間與對照存在明顯差異（圖1）。接種DO38的組培苗莖節(jié)變紫最早，接種后第4天即有變紫現(xiàn)象出現(xiàn)；接種DO14，DO18，DO19的組培苗，莖節(jié)在第5天開始變紫，接種上述4個菌株的組培苗莖節(jié)變紫時間均比CK提前，數(shù)量比CK增加；不論是否接種內(nèi)生真菌，多數(shù)組培苗第16～19天莖節(jié)變紫數(shù)量最多，隨后紫色逐漸褪去，但接種DO38與DO19的組培苗紫色莖節(jié)比例基本保持不變，見圖1。

32內(nèi)生真菌對組培苗農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量的影響

供試組培苗接種內(nèi)生真菌后，農(nóng)藝性狀間存在極顯著差異（表2，P<001），其中接種DO12，DO19苗高，接種DO14，DO18，DO19，DO34，DO38，DO120苗粗，接種DO12，DO18，DO19，DO38，DO120葉面積均極顯著高于CK（表2，P<001）；莖總鮮重與總干重最高為接種DO19組培苗，分別為1273，1040 g；鐵皮石斛產(chǎn)量指標為莖段，除接種DO34組培苗莖總鮮重低于CK組外，其余6個菌株組培苗產(chǎn)量指標均高于CK。根據(jù)主要農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量指標，接種DO12，DO18，DO19與DO120組培苗表現(xiàn)較好，表現(xiàn)出苗高，莖粗，葉片大，莖分枝少，根系生長適中等特點。

33內(nèi)生真菌對組培苗代謝成分的影響

331莖總多糖與醇溶性浸出物含量的差異接種不同菌株的組培苗莖總多糖與醇溶性浸出物含量存在極顯著差異（表3，P<001）。接種供試菌株的組培苗莖總多糖含量均極顯著高于CK（P<001），其中接種DO19組培苗莖總多糖質(zhì)量分數(shù)最高（1486%），是CK的296倍；接種DO18，DO19，DO34組培苗莖醇溶性浸出物含量極顯著高于CK（P<001），其中DO19組培苗莖醇溶性浸出物質(zhì)量分數(shù)最高（1041%），是CK組的119倍。

332多糖中單糖組成的差異未接菌的CK組培苗莖多糖衍生后檢測出4種單糖成分，分別為甘露糖，葡萄糖，半乳糖與阿拉伯糖，接種內(nèi)生真菌后，組培苗單糖組成發(fā)生變化（表4，圖2）。接種DO12，DO18，DO19，DO34與DO38組培苗除4種單糖組分與CK相同外，還檢測出木糖成分；而接種DO14與DO120的組培苗單糖組成比CK少，接種DO14的組培苗只檢測出甘露糖與葡萄糖，接種DO120的組培苗只檢測出甘露糖，葡萄糖與阿拉伯糖。甘露糖是鐵皮石斛多糖的主要組分，除DO12外接種其他菌株的組培苗甘露糖峰面積均高于CK，其中接種DO19的組培苗峰面積最高，是CK的261倍。

333莖醇溶性成分差異接種內(nèi)生真菌的鐵皮石斛組培苗莖醇溶性成分發(fā)生變化，HPLC差異特征峰（表5）可知，接菌后的組培苗中共有21個HPLC差異特征峰均比CK多，其中接種DO19的組培苗特征峰最多，達14個，其次為接種DO18，DO120，DO14的組培苗，分別為11，11，9個。在這些特征峰中，3，13，15，18，19，20號峰表現(xiàn)為峰面積大，分離度較好或為單一特征峰，可進一步重點分析（圖3）。

4結論與討論

供試的7個備選菌株對鐵皮石斛組培苗形態(tài)特征、農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量指標及主要代謝成分等方面均有不同程度的影響，除DO12菌株外其余6個菌株均促進了組培苗莖節(jié)變紫進程，且接種該6個菌株組培苗莖總多糖含量均極顯著高于CK（P<001），可能莖段顏色與總多糖含量存在相關性，莖段紫紅色越明顯，多糖含量越高[2223]。綜合接種內(nèi)生真菌后組培苗農(nóng)藝性狀，莖總多糖，浸出物與甘露糖峰面積，莖醇溶性成分特征峰等指標，篩選出DO14，DO18，DO19與DO120 4株優(yōu)良菌株，均能明顯促進組培苗生長發(fā)育，莖鮮重分別提高56%，44%，649%，14%，莖中總多糖含量提高1137%，707%，1960%，1574%，甘露糖含量提高422%，1058%，1607%，1320%，其中接種DO18，DO19菌株還可分別提高莖中浸出物含量43%，63%。

為了進一步揭示內(nèi)生真菌對組培苗代謝成分的影響規(guī)律，從莖節(jié)顏色變化分析代謝成分動態(tài)變異規(guī)律，擬選擇臨界時間點進行轉(zhuǎn)錄組學分析，從而闡釋鐵皮石斛代謝成分變化的分子機制。目前鐵皮石斛水溶性與醇溶性成分鑒定相關報道較少，藥效成分不夠明確，本試驗初步探索了接種內(nèi)生真菌后組培苗莖醇溶性成分變化，檢測出6個HPLC特征差異峰，可優(yōu)先選擇高分辨質(zhì)譜技術進一步分析，通過相對分子質(zhì)量初步鑒定可能成分，為闡明內(nèi)生真菌影響鐵皮石斛醇溶性成分變化機制提供基礎。

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[責任編輯呂冬梅]