李晨晨　周再知　張金浩　梁坤南　馬華明　黃桂華

摘 要 以藥用植物裸花紫珠（Callicarpa nudiflora）一年生半木質(zhì)化枝條為材料，使用吲哚丁酸（IBA，1 500 mg/L）處理插穗，以清水為對(duì)照，每隔6 d取樣1次，測(cè)定生根過(guò)程中插穗基部可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白含量及吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）活性的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，扦插后0～12 d，1 500 mg/L IBA處理增加了插穗內(nèi)可溶性蛋白含量，降低了淀粉含量，可溶性糖含量先降后升，IAAO、POD、PPO活性增加；扦插后12～30 d，淀粉及可溶性糖含量逐漸降低，可溶性蛋白含量先升后降，但仍都高于對(duì)照，IAAO和PPO活性逐漸下降，POD活性先降后增；扦插30 d后，可溶性糖、蛋白、淀粉含量逐步趨于穩(wěn)定，IAAO活性趨于穩(wěn)定，而PPO和POD活性逐漸降低?？傊?，較高濃度的可溶性糖、可溶性蛋白，低濃度的淀粉，較高的IAAO、POD和PPO活性有利于裸花紫珠插穗不定根形成和發(fā)育。

關(guān)鍵詞 扦插繁殖；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；抗氧化酶活性；IBA處理

中圖分類(lèi)號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）為馬鞭草科（Verbenaceae）紫珠屬（Callicarpa）植物，國(guó)內(nèi)主要分布在福建、廣東、廣西、海南等省區(qū)[1]。全株可入藥，具有抗菌、止血、消炎、解毒、收斂等功效，藥用價(jià)值高、應(yīng)用范圍廣[2]。近年來(lái)，種植面積不斷擴(kuò)大，對(duì)苗木的需求不斷增大。由于裸花紫珠采種期短且種子不宜儲(chǔ)藏、發(fā)芽率較低的緣故[3]，扦插繁殖成為主要的繁殖手段。

外源激素類(lèi)物質(zhì)被廣泛用于植物的扦插繁殖，特別是IAA和IBA，對(duì)不定根的誘導(dǎo)和發(fā)生起調(diào)控作用[4-5]。一些研究表明，扦插生根過(guò)程中，插穗內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性與不定根形成密切相關(guān)。茅林春等[6]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IBA處理后的梅（Prunus mume Sieb）插穗在不定根發(fā)生和生長(zhǎng)過(guò)程中，可溶性糖含量和生根率呈顯著的正相關(guān)，而淀粉含量和生根率呈顯著的負(fù)相關(guān)。趙云龍等[7]對(duì)糙葉杜鵑（Rhododendron scabrifoliu）扦插研究發(fā)現(xiàn)，外源激素可顯著的促進(jìn)插穗內(nèi)可溶性糖的增加，有利于插穗不定根的形成。外源激素類(lèi)物質(zhì)對(duì)插穗內(nèi)過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性產(chǎn)生顯著影響[8-10]。魏海蓉等[11]對(duì)甜櫻桃（Prunus avium）矮化砧‘吉塞拉 6號(hào)研究發(fā)現(xiàn)，外源IBA處理能夠提高生根率，其主要原因是提高了PPO、POD活性，降低了IAAO活性。

外源IBA處理可顯著提高裸花紫珠扦插生根率[12]。 周再知等[13]采用4種IBA濃度處理裸花紫珠插穗，確定了1 500 mg/L IBA濃度下生根效果最佳，揭示了此濃度下，插穗內(nèi)源激素IAA、ABA、GA和ZR含量隨生根進(jìn)程的變化規(guī)律。對(duì)扦插過(guò)程中，插穗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和相關(guān)氧化酶活性的變化規(guī)律尚不明確。本研究的目的是探究外源IBA（1 500 mg/L）處理下，裸花紫珠扦插生根過(guò)程中，插穗的可溶性糖、淀粉及可溶性蛋白含量以及POD、PPO和IAAO活性的變化規(guī)律，進(jìn)一步揭示其不定根的形成機(jī)理，為裸花紫珠的扦插繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從海南五指山采集野生裸花紫珠的種子，播種育苗。2年生時(shí)，選用生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條。截取中部，制成長(zhǎng)度9～11 cm，具2～3個(gè)芽眼，上端為平口、保留兩側(cè)半片葉，下端斜切接近馬蹄形的插穗。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置2個(gè)IBA濃度（0和1 500 mg/L）處理，每個(gè)區(qū)組重復(fù)3次，每處理小區(qū)插穗100條。以泥炭 ∶ 蛭石 ∶ 河沙=2 ∶ 1 ∶ 1的體積比配置混合扦插基質(zhì)。扦插前2 d，將其裝入長(zhǎng)540 mm×寬280 mm×深110 mm規(guī)格50穴苗盤(pán)內(nèi)，并用0.5%的高錳酸鉀進(jìn)行淋灌消毒。將制備好的插穗每50條扎成1捆，用質(zhì)量百分比為0.1%的高錳酸鉀溶液消毒1～2 min，取出用蒸餾水沖洗干凈。在IBA不同處理濃度溶液及清水中速蘸15 s，而后豎直插于上述穴盤(pán)中，深度3～4 cm。扦插后，澆水、覆蓋薄膜，每隔3 d交替噴灑質(zhì)量百分比為0.1%的高錳酸鉀溶液和50%多菌靈可濕性粉劑500倍液消毒。20 d以后，仍按此濃度交替消毒，7 d 1次。保持扦插環(huán)境溫度在21～33 ℃之間，相對(duì)濕度在70%以上。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法 扦插后，每隔6 d，取樣1次，總共取樣8次。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取10～12條插穗，迅速用蒸餾水將基部沖洗干凈，濾紙擦干，然后置于冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室。迅速剝?nèi)∷霔l基部2～3 cm韌皮部，剪碎、混勻，經(jīng)過(guò)液氮冷凍處理后，保存于-20 ℃的超低溫冰箱中。采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖和淀粉含量；考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量；吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性和過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定，參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[14]；采用鄰苯二酚比色法測(cè)定多酚氧化酶（PPO）活性，參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[15]。各測(cè)定項(xiàng)目材料均以鮮重（FW）計(jì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 裸花紫珠插穗生根過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

2.1.1 可溶性糖含量的變化 圖1表明，IBA（1 500 mg/L）處理下插穗基部可溶性糖含量，呈現(xiàn)出“下降-上升-下降”的趨勢(shì)。扦插后逐漸下降，第6天時(shí)降到谷值，降幅34.1%，6～12 d快速上升，12～18 d上升速度減緩，在第18天時(shí)達(dá)到峰值，增幅為40.7%。對(duì)照在扦插第6天后，插穗的可溶性糖含量持續(xù)下降，第12天時(shí)達(dá)到谷值，12～18 d上升較為緩慢，18～24 d上升速度加快，第24天時(shí)，達(dá)到峰值，增幅為41.0%。峰值之后，IBA處理的可溶性糖含量持續(xù)下降，第30天后，趨于平穩(wěn)，而對(duì)照處理則延遲到第36天以后。第42天時(shí)，兩者的可溶性糖含量均維持在40.0 mg/g（以鮮重計(jì)，以下類(lèi)同）左右。

2.1.2 淀粉含量的變化 由圖2可知，插穗的淀粉含量總體上均呈現(xiàn)平穩(wěn)下降的趨勢(shì)，不同階段下降幅度有所不同。IBA（1 500 mg/L）處理插穗在扦插后0～12 d內(nèi)淀粉含量大幅度下降，12～18 d時(shí)淀粉含量保持平穩(wěn)，幾乎不變，接下來(lái)的第18～30天又快速下降，第30天時(shí)淀粉含量達(dá)到了最低值，之后開(kāi)始緩慢上升。而對(duì)照插穗在0～12 d緩慢下降，而第12～24天則急劇下降，12～18 d時(shí)淀粉含量下降速率最大，降幅為28.6%，24～30 d時(shí)其含量趨于恒定，第30～36天出現(xiàn)小幅度的下降，之后也開(kāi)始有所回升。

2.1.3 可溶性蛋白含量的變化 從圖3可以看出，扦插后的30 d內(nèi)，IBA（1 500 mg/L）處理插穗的可溶性蛋白的含量始終高于對(duì)照。扦插后12 d，IBA（1 500 mg/L）處理插穗的可溶性蛋白含量大幅下降，第12天后開(kāi)始回升，第18天時(shí)達(dá)到峰值，而后持續(xù)下降，在第36天時(shí)達(dá)谷值，降幅16.2%，之后又大幅度上升。而對(duì)照插穗在第12天后持續(xù)下降，在第18天時(shí)達(dá)到谷值，之后進(jìn)入上升期，在第36天時(shí)達(dá)到峰值，然后又開(kāi)始下降。

2.2 裸花紫珠插穗生根過(guò)程中抗氧化酶活性的變化

2.2.1 吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性變化 從圖4可以看出，IBA（1 500 mg/L）處理和對(duì)照插穗內(nèi)IAAO酶活性大體上都呈現(xiàn)出先上升后下降最后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。IBA（1 500 mg/L）處理插穗的IAAO活性在扦插0～12 d急劇上升，升幅達(dá)172.5%，第12天后又大幅度下降，到第30天時(shí)出現(xiàn)低谷，降幅達(dá)48.1%，之后逐漸趨于平穩(wěn)。對(duì)照處理插穗IAAO活性在扦插0～12 d出現(xiàn)小幅度降低的趨勢(shì)，12～18 d開(kāi)始緩慢上升，18～24 d急劇上升并到達(dá)峰值，升幅126.9%，24 d之后逐漸降低，其降低的幅度越來(lái)越小，在第36天后趨于平穩(wěn)。

2.2.2 過(guò)氧化物酶（POD）活性的變化 POD活性與扦插生根的關(guān)系密切，被一致認(rèn)為是植物生根的標(biāo)志性物質(zhì)之一。IBA（1 500 mg/L）處理和對(duì)照插穗內(nèi)POD活性隨扦插時(shí)間總體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在插穗生根的不同階段差別明顯（圖5）。整個(gè)扦插生根監(jiān)測(cè)過(guò)程中，IBA（1 500 mg/L）處理插穗內(nèi)的POD活性一直都高于對(duì)照處理，說(shuō)明較高水平的POD活性可能會(huì)促進(jìn)插穗生根。IBA（1 500 mg/L）處理插穗的POD活性在扦插后的6 d內(nèi)變化不大，第6～12天時(shí)快速升高并于第12天時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，增幅42.1%，12～18 d逐漸降低，第18天后又開(kāi)始大幅度的升高，第30天時(shí)形成第2個(gè)峰值，此時(shí)也是整條變化曲線的最高點(diǎn)，比扦插前增加了124.1%，之后再次降低，到第42天時(shí)，已接近扦插前POD活性的水平。對(duì)照在扦插后6 d，POD活性急劇降低，在第24天活性到達(dá)最高值，之后其活性緩緩下降，但是變化幅度十分微小，第36天時(shí)POD活性到達(dá)第2個(gè)峰值，兩個(gè)峰值大小接近，36～42 d活性大幅降低。

2.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性的變化 扦插過(guò)程中插穗內(nèi)PPO活性變化見(jiàn)圖6。扦插前，插穗內(nèi)PPO活性比較低，扦插后6 d內(nèi)兩個(gè)處理PPO活性變化幅度都不大，但是IBA（1 500 mg/L）處理表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，而對(duì)照則相反。IBA（1 500 mg/L）處理插穗的PPO活性在第6～12天急劇升高，第18天達(dá)到最大值，增幅60.8%，且比對(duì)照早12 d。之后PPO活性大幅度降低，第30天下降幅度變小至觀測(cè)結(jié)束。對(duì)照的PPO活性在第6～24天之間升高，且升高的幅度是逐漸變大的，第30天達(dá)到最大值，增幅39.0%，第30天之后持續(xù)下降，第42天所測(cè)的PPO活性水平與扦插時(shí)基本一致。

3 討論

3.1 扦插生根過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

魏海蓉等[11]用外源激素IBA（1 000 mg/L）處理甜櫻桃矮化砧‘吉塞拉6號(hào)（Gisela 6，Prunus cerasus × P. canescens）發(fā)現(xiàn)其插穗內(nèi)可溶性糖含量隨生根進(jìn)程呈現(xiàn)“升高-降低”的變化規(guī)律。而本研究發(fā)現(xiàn)，裸花紫珠插穗內(nèi)可溶性糖含量隨生根進(jìn)程呈現(xiàn)“下降-上升-下降”的變化規(guī)律。結(jié)合周再知等[13]對(duì)裸花紫珠扦插不定根形成階段的劃分，即扦插后0～12 d為皮內(nèi)根原基誘導(dǎo)分化、愈傷組織形成期階段，12～30 d為不定根形成及發(fā)生階段，30 d以后為不定根伸長(zhǎng)及發(fā)育階段，IBA（1 500 mg/L）處理的裸花紫珠插穗在不定根誘導(dǎo)分化期的前期（1～6 d），插穗內(nèi)的可溶性糖含量大幅度下降，這可能是由于插穗基部呼吸作用增強(qiáng)、愈傷組織和根原始體形成消耗大量的能量和養(yǎng)分，及可溶性糖的消耗速度遠(yuǎn)大于形成速度所致。在不定根誘導(dǎo)分化期的后期（6～12 d），可溶性糖含量快速回升，而對(duì)照依然在下降，這可能是外源IBA處理加快了插穗內(nèi)淀粉水解成可溶性糖的緣故。在不定根的形成階段（12～30 d），插穗的可溶性糖逐漸降低，可能與生根過(guò)程中快速消耗大量能量有關(guān)；期間，盡管能量物質(zhì)依然在快速水解，但是水解速度小于可溶性糖的消耗速度，這與多數(shù)人的研究結(jié)果一致[16-18]。

淀粉作為植物體內(nèi)能量的儲(chǔ)藏形式，在植物生長(zhǎng)的特殊階段可以轉(zhuǎn)化為可溶性糖，是插穗生根過(guò)程中主要的能量來(lái)源[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，裸花紫珠在扦插生根過(guò)程中，淀粉含量呈逐漸下降的趨勢(shì)，主要是因?yàn)樯^(guò)程中消耗了大量的能量。IBA處理插穗在扦插后0～12 d內(nèi)，淀粉含量大幅度下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照的下降速度，這可能與IBA處理可以增強(qiáng)插穗內(nèi)某些糖類(lèi)水解酶的活性，加強(qiáng)對(duì)淀粉的水解有關(guān)[20]。在不定的形成階段（12～30 d），IBA處理插穗內(nèi)淀粉含量下降速度減緩，而對(duì)照開(kāi)始出現(xiàn)大幅度下降，可能是因?yàn)镮BA處理的插穗在不定根形成的過(guò)程中，地上部分已經(jīng)長(zhǎng)出部分新葉，通過(guò)光合作用，合成少量的淀粉和糖類(lèi)，從而減緩了淀粉的水解速度，而對(duì)照的地上部分新葉形成和生長(zhǎng)則相對(duì)遲緩。當(dāng)插穗進(jìn)入不定根伸長(zhǎng)階段（30 d后），插穗根系生長(zhǎng)較完全、新葉完全長(zhǎng)出，插穗逐漸恢復(fù)光合能力，同化產(chǎn)物得以積累和運(yùn)輸，多余的糖分轉(zhuǎn)化為淀粉，導(dǎo)致淀粉含量的升高。

可溶性蛋白是插穗總氮含量的主要組成部分且可以激活與生根有關(guān)的基因[21]。氮素類(lèi)化合物不僅與根原始體形成有關(guān)，而且還能促進(jìn)根和地上部分的生長(zhǎng)[22]。雖然可溶性蛋白質(zhì)只占總體蛋白質(zhì)的一小部分，但是機(jī)體所能吸收的主要是可溶性蛋白，它在生命體活動(dòng)中發(fā)揮著運(yùn)輸協(xié)調(diào)、免疫保護(hù)、傳導(dǎo)神經(jīng)活動(dòng)等重要功能[23]。在裸花紫珠的生根過(guò)程中，其插穗內(nèi)可溶性蛋白含量表現(xiàn)為“下降-上升-下降-上升”的變化趨勢(shì)，結(jié)合生根進(jìn)程來(lái)看，前期的可溶性蛋白的大幅度降低主要是因?yàn)樵诓欢ǜT導(dǎo)階段，可能是可溶性蛋白大量轉(zhuǎn)化為細(xì)胞分裂和分化過(guò)程中所需要功能蛋白，為不定根的形成做準(zhǔn)備，而后出現(xiàn)短期的上升可能是因?yàn)殡S著根原基形成，插穗吸收能力增強(qiáng)且短期內(nèi)消耗較小，可溶性蛋白合成較多的緣故。待不定根進(jìn)入伸長(zhǎng)期時(shí)，根部分生區(qū)需要大量的進(jìn)行分裂分化，可溶性蛋白消耗大，導(dǎo)致含量下降，當(dāng)插穗地上部分長(zhǎng)出新葉后，光合能力逐漸恢復(fù)，光合產(chǎn)物增多，可溶性蛋白逐漸積累。

3.2 扦插生根過(guò)程中抗氧化酶活性的變化

IAAO是分解IAA的專(zhuān)一性酶，該酶利用氧氣來(lái)氧化IAA，并且與不定根的形成有關(guān)[24-26]。研究表明，難生根的樹(shù)種插穗內(nèi)IAAO活性較低，對(duì)不定根的誘導(dǎo)及形成作用不明顯，而易生根的樹(shù)種插穗內(nèi)IAAO活性高，可降低插穗IAA濃度，有利于誘導(dǎo)不定根的形成[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn) IAAO活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。在裸花紫珠插穗不定根誘導(dǎo)階段（0～12 d），外源激素IBA處理大幅度提高了IAAO活性。裸花紫珠插穗的IAA含量在扦插6～12 d時(shí)，大幅下降[13]，這可能與高活性的IAAO有關(guān)。在不定根的形成階段（12～30 d），IAAO活性逐漸下降。IAAO活性的下降，致使插穗內(nèi)IAA含量升高，有利于不定根的表達(dá)，促進(jìn)根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，這與王小玲等[29]用1 000 mg/L IBA處理四倍體刺槐（tetraploid Robinia pseudoacacia）硬枝進(jìn)行扦插的研究結(jié)果一致，但是扈紅軍等[30]對(duì)歐榛（Corylus avellana）扦插研究表明，不定根表達(dá)期內(nèi)，IAAO活性高有益于促進(jìn)根的伸長(zhǎng)。不同樹(shù)種在扦插生根過(guò)程中IAAO活性及其作用不同，比較復(fù)雜。

POD是一種存在于植物體內(nèi)的含F(xiàn)e卟啉輔基的酶，參與多種生理生化過(guò)程。POD活性與扦插生根密切相關(guān)，被普遍認(rèn)為是植物生根的標(biāo)志性物質(zhì)之一。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IBA處理的插穗生根過(guò)程中，POD活性呈現(xiàn)“上升-下降-上升-下降”的趨勢(shì)。且出現(xiàn)了兩個(gè)高度不同峰值，這與多數(shù)有關(guān)扦插生根過(guò)程中POD活性會(huì)有兩個(gè)高峰的結(jié)果一致[30-33]。第1個(gè)峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)期內(nèi)，它的升高主要與抑制傷呼吸有關(guān)，傷呼吸產(chǎn)生大量的活性氧類(lèi)物質(zhì)（ROS），如O2-等，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的防御酶，例如超氧化物歧化酶，它能夠?qū)2-歧化為H2O2和O2，再由POD氧化為H2O和O2，從而避免活性氧所造成的膜系統(tǒng)的損害[23]。POD活性的升高可以氧化插穗內(nèi)過(guò)多的內(nèi)源IAA，有利于誘導(dǎo)根原基發(fā)育。對(duì)于第二峰值出現(xiàn)在不定根的表達(dá)時(shí)期，扈紅軍等[30]認(rèn)為該峰值的出現(xiàn)也與不定根的表達(dá)有關(guān)，高活性的POD有利于不定根的表達(dá)。在根的伸長(zhǎng)和發(fā)育期，POD活性下降，促使插穗內(nèi)IAA含量增加，有利于根的伸長(zhǎng)和發(fā)育。

PPO是普遍存在植物體內(nèi)的一種含銅的氧化酶，它可以將酚類(lèi)化合物和吲哚乙酸催化成一種“IAA-酚酸化合物”，這種復(fù)合物具有促進(jìn)不定根分化及形成的作用[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，IBA處理顯著提高了裸花紫珠插穗內(nèi)PPO的活性。扦插后，PPO活性先升高， 之后隨不定根的形成和伸長(zhǎng)， 活性逐漸降低。這與趙云龍等[7]對(duì)糙葉杜鵑（Rhododendron scabrifoliu）、扈紅軍等[35]對(duì)榛子（Corylus heterophylla）扦插研究結(jié)論一致。多數(shù)研究表明，易生根植物體內(nèi)PPO活性較高，PPO可以把高濃度的酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為促根物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)了不定根的分化及形成[36-37]。裸花紫珠為較易生根的植物，在不定根的誘導(dǎo)分化階段，IBA（1 500 mg/L）處理的插穗內(nèi)PPO活性明顯升高，可能與PPO促成酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

植物的扦插生根機(jī)理復(fù)雜，一種物質(zhì)含量的變化可能導(dǎo)致其他一種或多種物質(zhì)含量的變化，以及與之相關(guān)的抗氧化酶活性的變化，弄清它們之間內(nèi)在的聯(lián)系，還需從激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝、基因調(diào)控等方面深入研究。

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