孫飛+方熱軍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖南·長沙410128）

摘要：尤斯灌流技術(shù)被譽為腸道屏障功能研究的金標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于尤斯灌流系統(tǒng)在腸道屏障功能研究已成為熱點，但有關(guān)尤斯灌流技術(shù)在營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運方面的研究還很匱乏，本文對尤斯灌流室的基本原理和構(gòu)造作簡要綜述，并綜合國內(nèi)外學(xué)者的研究進(jìn)展，總結(jié)了尤斯灌流技術(shù)在腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運研究中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：尤斯灌流；腸上皮組織；營養(yǎng)物質(zhì)；轉(zhuǎn)運

1951年，丹麥學(xué)者Hans Ussing在對上皮組織離子轉(zhuǎn)運的研究中，首次將Ussing chamber（尤斯室，Ussing灌流室）介紹于世，其主要功能是利用微電極檢測整個細(xì)胞膜離子通道變化的電流信號，來反映腸道藥物吸收、通透性和分泌情況的變化。近些年來，關(guān)于尤斯灌流系統(tǒng)在腸道粘膜屏障功能研究已成為熱點，但尤斯灌流系統(tǒng)在腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運中的研究或許可以為養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來更實際的幫助。

尤斯灌流系統(tǒng)的基本構(gòu)造

尤斯灌流系統(tǒng)主要由灌流室、電路系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、恒溫裝置以及配套系統(tǒng)組成。常見的灌流室有2、4、6和8室4種類型。根據(jù)工藝不同可將其分為持續(xù)式和循環(huán)式灌流室。持續(xù)式灌流室包括2個溶液貯器，通過聚乙烯管道將溶液引入2個半室，并設(shè)閥門控制流速。循環(huán)式灌流室由1個U形管道和2個半室組成，2個半室中間是1個用于嵌合組織樣本且可移動的滑塊，它可以有效降低灌流過程中上皮組織所受到的損傷。

上皮組織由密集排列的上皮細(xì)胞和少量細(xì)胞間質(zhì)組成，具有極性和緊密連接，這也是區(qū)別于其他組織的兩大特征。極性是因為細(xì)胞游離面（或頂面）和基底面結(jié)構(gòu)和功能的分布不均造成的；而緊密連接又稱閉鎖小帶，常見于單層柱狀上皮和單層立方上皮中，位于相鄰細(xì)胞間隙的頂端側(cè)面，緊密連接除具機械連接作用外，更重要的是封閉細(xì)胞間隙，阻止細(xì)胞外的大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入組織內(nèi)。緊密連接的形狀和滲透性決定上皮組織的完整性以及對物質(zhì)的阻抗力。

尤斯灌流系統(tǒng)在腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運中的研究

經(jīng)食道而來的物質(zhì)在胃和小腸內(nèi)被降解為葡萄糖、小肽、游離脂肪酸和氨基酸等物質(zhì)，通過胃腸道上皮細(xì)胞基頂膜轉(zhuǎn)運載體進(jìn)入胃腸壁內(nèi)，再通過基底膜轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)出，進(jìn)入血液循環(huán)供腸道和其他組織利用。提高畜禽胃腸道上皮細(xì)胞的分泌作用對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運效率對于減少飼養(yǎng)成本，促進(jìn)動物生長具有重要意義。應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)研究營養(yǎng)物質(zhì)在腸道中的轉(zhuǎn)運主要集中在葡萄糖、氨基酸以及礦物質(zhì)的轉(zhuǎn)運方面。

葡萄糖是自然界分布最廣且最為重要的一種單糖，是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，其主要消化部位在小腸。因此，研究腸道上皮對葡萄糖的轉(zhuǎn)運效率至關(guān)重要。葡萄糖經(jīng)腸道上皮細(xì)胞頂膜Na+-葡萄糖-載體蛋白主動轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞，并由基底膜葡萄糖轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運進(jìn)入血液。葡萄糖轉(zhuǎn)運過程中Na+跨膜轉(zhuǎn)運產(chǎn)生的離子電流，為Ussing chamber技術(shù)在葡萄糖轉(zhuǎn)運研究中的應(yīng)用創(chuàng)造了條件，并以Isc的變化反映葡萄糖的轉(zhuǎn)運規(guī)律。Millar等利用Ussing chamber研究表皮生長因子（EGF）對兔空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響，其結(jié)果表明EGF通過PKC和PI3-激酶途徑促進(jìn)3-O-甲基葡萄糖的轉(zhuǎn)運。Gar-cia-Amado等利用Ussing chamber技術(shù)研究了鵪鶉腸道D-葡萄糖轉(zhuǎn)運，黏膜側(cè)加入D-葡萄糖，之后加入根皮苷，試驗記錄Isc，發(fā)現(xiàn)，D-葡萄糖增加Isc；根皮苷降低Isc，抑制D-葡萄糖轉(zhuǎn)運。

氨基酸（Amino acid）是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，賦予蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使他的分子具有生化活性。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)重要的活性分子，包括催化新陳代謝的酵素和酶。何流琴等在研究缺乏賴氨酸對大鼠血清氨基酸含量和腸道氨基酸通透性的影響，應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)測定腸道轉(zhuǎn)運氨基酸變化及賴氨酸的轉(zhuǎn)運能力，該結(jié)果為研究賴氨酸等內(nèi)源性氨基酸的代謝機制提供了基礎(chǔ)。王斌等在對豬小腸鈉離子依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運的研究中，利用Ussing chamber技術(shù)研究哺乳仔豬空腸對六種氨基酸的鈉離子依賴轉(zhuǎn)運機制，探討不同濃度氨基酸在空腸轉(zhuǎn)運的差異和特點，發(fā)現(xiàn)氨基酸的轉(zhuǎn)運是耗能的主動運輸過程；哺乳仔豬空腸對谷氨酸的轉(zhuǎn)運能力很強，其次為蘇氨酸、絲氨酸和甘氨酸，這些氨基酸的轉(zhuǎn)運載體多為Na+依賴性的，而羥脯氨酸和精氨酸的轉(zhuǎn)運主要不是通過離子性依賴系統(tǒng)進(jìn)行。

礦物元素也稱無機鹽，是構(gòu)成機體組織的重要物質(zhì)。體內(nèi)礦物元素存在形式多種多樣，但主要是以蛋白質(zhì)及氨基酸相結(jié)合的形式存在，也有以游離狀態(tài)存在。張志博等應(yīng)用尤斯灌流技術(shù)研究厚樸酚與和厚樸酚對腸道鈣離子轉(zhuǎn)運的影響及其抗腹瀉機制，結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚均可不同程度影響IEC-6細(xì)胞內(nèi)鈣離子的轉(zhuǎn)運，可通過細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道以及受體操控型鈣通道來調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫的釋放和胞外鈣的內(nèi)流來影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并達(dá)到抗腹瀉作用。賀志雄等應(yīng)用尤斯灌流法測定斷奶后羔羊胃腸道消化吸收能力，結(jié)果表明，動物體生命早期不同時期瘤胃、空腸和回腸有著不同的分泌、屏障及吸收特征； 1-2周（斷奶過渡期）腸道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生紊亂，可能導(dǎo)致動物產(chǎn)生腹瀉。

瘤胃上皮不僅是瘤胃微生物附著生長并進(jìn)行消化和代謝的主要部位也是營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運代謝的主要場所，同時瘤胃上皮組織較其他組織更適合進(jìn)行物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運以及代謝研究。利用尤斯灌流技術(shù)對瘤胃上皮組織的研究或許是今后研究的熱點，同時也可以為瘤胃上皮對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運機制提供更為準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

優(yōu)點與缺點分析

優(yōu)點：尤斯灌流技術(shù)提供一個短期的離體組織培養(yǎng)的方法，較之傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)方法具有快捷，簡便等特點，通過對轉(zhuǎn)運電流等一些列的電參數(shù)的測定，用以說明是否有載體或外流泵參與轉(zhuǎn)運；能對轉(zhuǎn)運的不同階段進(jìn)行研究。尤斯灌流系統(tǒng)的研究對象為上皮組織，而上皮組織廣泛分布在身體表面和體內(nèi)各種囊、管、腔的內(nèi)表面。上皮組織具有保護(hù)、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差異。如分布在身體表面的上皮以保護(hù)功能為主；體內(nèi)各管腔面的上皮，除具有保護(hù)功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮組織，從表面生長到深部結(jié)締組織中去，分化成為具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究對象可擴展到機體任意上皮組織。就某一具體上皮組織而言，可研究的內(nèi)容也更加多樣。

缺點：研究對象單一，尤斯灌流系統(tǒng)研究對象為上皮組織，很少涉及細(xì)胞學(xué)研究，特別是對細(xì)胞內(nèi)藥物吸收與轉(zhuǎn)運機制的研究。用一個相對少量的測量來解釋復(fù)雜的腸粘膜上皮組織的生理系統(tǒng)，無法考慮細(xì)胞間和旁分泌所帶來的影響。胃腸道上皮離體后組織形態(tài)學(xué)和生理活性都會在一定時間之后迅速改變或下降，有研究表明Soderholm，腸道上皮離體90-120min后大部分標(biāo)本都出現(xiàn)了組織形態(tài)學(xué)的改變，生理活性無明顯異常。離體240min后ATP降低至正常值的30%，組織的通透性明顯提高，這與實際應(yīng)用有所矛盾。灌流室片組織樣品固定夾與都是固體，難以保證其密封性，在利用尤斯灌流室研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中發(fā)現(xiàn)有漏液的情況出現(xiàn)，溶液是從安插組織樣品固定夾片的位置滲漏，對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性造成嚴(yán)重的影響。

尤斯灌流技術(shù)是一種首先用于研究離子通道而逐步發(fā)展起來的技術(shù)，以其快捷、簡便等特點，并它能比較真實地反映各種上皮細(xì)胞在體內(nèi)的實時狀態(tài)，受到廣大醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域工作者的青睞。隨著這一技術(shù)的不斷完善，尤斯灌流技術(shù)必將為畜禽胃腸道屏障功能和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程與機制研究作出重要貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)（略）