王　爽，許堅(jiān)吉，劉曉霓，陳德喜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所，北京　100069)

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人ASPP2重組腺病毒質(zhì)量控制研究

王爽，許堅(jiān)吉，劉曉霓，陳德喜

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所，北京100069)

摘要：目的對(duì)人ASPP2重組腺病毒制劑進(jìn)行質(zhì)量分析，并針對(duì)其關(guān)鍵質(zhì)量特性建立質(zhì)控方法。方法采用PCR法對(duì)重組腺病毒的載體結(jié)構(gòu)特征基因E2B和目的基因ASPP2進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖電泳進(jìn)行分子量鑒定；采用UV-SDS法測(cè)定重組腺病毒的病毒顆粒數(shù)；采用組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量法(TCID50)測(cè)定重組腺病毒的感染滴度；采用Western blot法對(duì)重組腺病毒感染靶細(xì)胞后目的蛋白ASPP2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)；通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)觀察重組腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)；采用A549細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒的復(fù)制型病毒檢測(cè)。結(jié)果腺病毒載體E2B基因和目的基因ASPP2的鑒定結(jié)果與理論值相符；重組腺病毒的病毒顆粒數(shù)為每毫升5.6×1012VP，病毒滴度為每毫升2×1011IU，比活性為3.5%；病毒感染靶細(xì)胞24 h后可檢測(cè)出ASPP2蛋白的表達(dá)；重組腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用；復(fù)制型腺病毒(RCA)水平小于1 RCA/3.0×1010VP，符合中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論>建立了人ASPP2重組腺病毒的關(guān)鍵特征的質(zhì)量控制方法，為該重組腺病毒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及相關(guān)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：基因治療；腺病毒；ASPP2；質(zhì)量控制；病毒比活；MTT

基因治療是指運(yùn)用DNA轉(zhuǎn)移來(lái)治療甚至預(yù)防人類疾患。將DNA送入細(xì)胞的方法雖然很多，但進(jìn)行基因治療時(shí)，必須讓多數(shù)的細(xì)胞都獲得DNA，一般的DNA傳送方法都無(wú)法達(dá)到此目標(biāo)。由于病毒感染細(xì)胞的效率很高，因此適合做基因治療的載體，將預(yù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因送入細(xì)胞內(nèi)。腺病毒載體是現(xiàn)在基因治療最為常用的治療載體之一。腺病毒雖然不能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，但其轉(zhuǎn)移效率高的特點(diǎn)使其目前在治療惡性腫瘤方面具有了其它病毒載體難以替代的優(yōu)勢(shì)[1-2]。

ASPP2是p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of p53, ASPP)家族的一員，能特異性地調(diào)節(jié) p53 依賴性凋亡作用。早在10多年前，ASPP2就被發(fā)現(xiàn)是p53的結(jié)合蛋白[4]，它作為p53介導(dǎo)凋亡的正調(diào)節(jié)子的作用已經(jīng)被明確證實(shí)。同時(shí)，ASPP2的生理學(xué)重要性也已經(jīng)通過(guò)ASPP2缺陷型鼠的產(chǎn)生及特征分析展現(xiàn)出來(lái)[5-6]。我們現(xiàn)在已經(jīng)知道ASPP2是一種單倍劑量不足型腫瘤抑制因子，在鼠的發(fā)育和腫瘤形成過(guò)程中是p53的重要激活劑。臨床研究顯示包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織ASPP2表達(dá)下降，與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[7-9]，ASPP2可能是未來(lái)癌癥治療的一個(gè)新的重要靶點(diǎn)。

我們前期構(gòu)建并大量擴(kuò)增純化了人ASPP2重組腺病毒，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)《人基因治療和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》[10]及《中國(guó)藥典》三部(2010版)相關(guān)要求，結(jié)合該重組腺病毒的特點(diǎn)，針對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量特征，從重組腺病毒的鑒定、病毒顆粒數(shù)、滴度檢測(cè)、目的蛋白表達(dá)、生物學(xué)活性以及復(fù)制型腺病毒(RCA)檢測(cè)幾方面對(duì)人ASPP2重組腺病毒進(jìn)行質(zhì)量分析，建立關(guān)鍵質(zhì)量特征的質(zhì)量控制方法，為其下一步研究奠定質(zhì)量基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；人ASPP2重組腺病毒由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院夏海濱教授基因治療研究室構(gòu)建；人胚腎293T細(xì)胞、人肺癌A549、人肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞株為本室保存。10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；ASPP2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；通用型基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；MTT 噻唑藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Nikon ECLIPSE TE2000-U倒置熒光顯微鏡；BioTeke ND5000超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Thermo Scientific 8000型恒溫CO2培養(yǎng)箱；BACKMAN L-80XP 超速離心機(jī)；BioTeke CYTATION3細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)；BIO-RAD DNA Engine PCR儀；Alpha Imager凝膠成像儀；Thermo Scientific Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。

1.2方法

1.2.1PCR-電泳法鑒定腺病毒E2B和人ASPP2基因重組腺病毒由載體DNA和目的基因兩部分構(gòu)成。按照試劑盒方法提取病毒基因組DNA，通過(guò)對(duì)重組腺病毒載體結(jié)構(gòu)基因E2B和目的基因ASPP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分子量鑒定。以滅菌純水代替模板同步反應(yīng)作為陰性對(duì)照。

E2B區(qū)引物序列為：上游引物5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′，下游引物5′-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3′，擴(kuò)增片段大小為880 bp。擴(kuò)增條件為：94℃變性5 min；94℃變性20 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min[10]。

ASPP2的引物序列為：上游引物5′ -AGCTGCCATGGAGACCATCT-3′，下游引物5′- ACTGTTCTCCGTACTGGCAC-3′，擴(kuò)增片段大小為220 bp。擴(kuò)增條件為：95℃變性3 min；94℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共3個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，共27個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.2.2UV-SDS法測(cè)定人ASPP2重組腺病毒病毒顆粒數(shù)用病毒保存液配制0.2% SDS；取等量的人ASPP2重組腺病毒待測(cè)液與0.2% SDS液混合；振蕩混勻，56 ℃水浴中放置10 min；等溫度降至室溫時(shí)，瞬時(shí)離心。病毒保存液配制的0.2% SDS作為空白對(duì)照，測(cè)定波長(zhǎng)260和280 nm處的吸光度值，平行實(shí)驗(yàn)2次。按公式計(jì)算：病毒顆粒數(shù)=A260 nm×稀釋倍數(shù)×1.1×1012。

1.2.3半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)法測(cè)定病毒滴度在實(shí)驗(yàn)前24 h，向96孔板每孔加入100 μL人胚腎293T細(xì)胞懸液，1×103個(gè)細(xì)胞；待測(cè)病毒液的稀釋，按10倍稀釋度(106～1013)稀釋病毒樣品；從孵箱中取出96孔板，在顯微鏡下確定每孔的細(xì)胞均生長(zhǎng)良好。吸棄舊培養(yǎng)液，然后依次將106～1013稀釋的病毒加入96孔板中，每一稀釋度占用一行，每行10孔重復(fù)，每孔加入90 μL 病毒稀釋液，而每行的第11～12孔均加入90 μL不含病毒的完全培養(yǎng)基作為對(duì)照；37℃培養(yǎng)10 d后觀察細(xì)胞病變現(xiàn)象，并對(duì)CPE孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每行的陽(yáng)性率，計(jì)算病毒滴度(Spearman-Karber Method)：病毒滴度=10(x+0.8)IU/mL,x=101～1012依次稀釋度下CPE陽(yáng)性率總和。公式使用條件：陰性對(duì)照沒(méi)有CPE和生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象；加入最小稀釋濃度病毒液的孔均有CPE。

1.2.4Western blot方法檢測(cè)人ASPP2重組腺病毒目的蛋白的表達(dá)取人ASPP2重組腺病毒，以MOI=100感染人肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞，24 h后提取細(xì)胞蛋白；用BCA法進(jìn)行蛋白定量；經(jīng)8% SDS-PAGE，后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用ASPP2單克隆抗體1 ∶1 000稀釋，二抗1 ∶2 000稀釋；室溫下孵育一抗2 h，用1×TBST洗膜3次；室溫下孵育二抗1 h，用1×TBST洗膜3次；用ECL試劑盒檢測(cè)，壓片后顯影。

1.2.5人ASPP2重組腺病毒生物學(xué)活性測(cè)定培養(yǎng)肝癌Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液以每孔細(xì)胞數(shù)2 500個(gè)/100 μL培養(yǎng)液接種4塊96孔板；次日加入相應(yīng)滴度的病毒液(Huh7細(xì)胞病毒終濃度為1×107和1×108pfu·mL-1，HepG2細(xì)胞病毒終濃度為5×106和5×107pfu·mL-1)，每個(gè)滴度同時(shí)做3個(gè)復(fù)孔；在病毒加入后的24、48、72、96 h時(shí)傾倒培養(yǎng)液，每孔加MTT(5 g·L-1)20 μL后，于37℃孵育4 h；傾倒板中液體并向每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算公式：生長(zhǎng)抑制率/%=(1-ASPP2干預(yù)組/陰性對(duì)照)×100%

1.2.6復(fù)制性腺病毒(RCA)的檢測(cè)收集A549細(xì)胞并配成濃度為4×108·L-1的細(xì)胞懸液，共132 mL。接種細(xì)胞于11個(gè)12孔板，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，置于孵箱，37℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜。將3×1010VP待測(cè)樣品稀釋于120 mL DMEM完全培養(yǎng)基。移去12孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，并加入1 mL待檢樣品，一共感染10個(gè)12孔板。同時(shí)設(shè)定一板陰性對(duì)照，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基，置于孵箱，37℃培養(yǎng)14 d。在d 7補(bǔ)液，每孔加1 mL完全DMEM。結(jié)果判定：加入待檢樣品的10板均無(wú)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)出現(xiàn)，同時(shí)陰性對(duì)照的細(xì)胞正常，無(wú)CPE產(chǎn)生，則判定病毒樣品的RCA檢測(cè)合格。

2結(jié)果

2.1人ASPP2重組腺病毒鑒定

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，ASPP2基因擴(kuò)增產(chǎn)物可見(jiàn)220 bp的特異性條帶，E2B基因擴(kuò)增產(chǎn)物可見(jiàn)880 bp的特異性條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相符。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1　Electrophoretic profile of PCR products of ASPP2 and E2B genes

1：negative control(ASPP2 gene)；2：PCR products of 293T cells(ASPP2 gene)；3：recombinant adenovirus(ASPP2 gene)；4：PCR products of 293T cells(E2B gene)；5：recombinant adenovirus(E2B gene)；6：negative control(E2B gene)；M：DNA marker 2000.

2.2人ASPP2重組腺病毒的顆粒數(shù)與滴度測(cè)定

病毒可以通過(guò)測(cè)定吸光度值來(lái)計(jì)算病毒總顆粒數(shù)，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，使病毒液在260 nm處的吸光度值處于0～1.0之間，根據(jù)公式：病毒顆粒數(shù)=A260 nm×稀釋倍數(shù)×1.1×1012計(jì)算重組ASPP2腺病毒的病毒顆粒數(shù)為5.6×1012VP/mL。同時(shí)計(jì)算A260/A280的比值為1.21，落在規(guī)定值的1.2～1.3之間，初步分析結(jié)果顯示人ASPP2重組腺病毒純度達(dá)到要求。病毒滴度的測(cè)定采用SFDA和FDA推薦的TCID50法，此方法已被用于測(cè)定許多病毒的滴度，病毒稀釋液與細(xì)胞在96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，然后監(jiān)測(cè)每孔是否出現(xiàn)CPE。根據(jù)公式計(jì)算后得到人ASPP2重組腺病毒的病毒滴度為2×1011IU/mL。病毒比活即病毒感染滴度與病毒顆粒數(shù)的比值(IU/VP)。目前，SFDA規(guī)定重組腺病毒作為基因治療制品的比活性應(yīng)高于3.3%。人ASPP2重組腺病毒的比活值為3.5%，符合SFDA規(guī)定的要求。

2.3人ASPP2重組腺病毒目的蛋白的表達(dá)情況

在確定目的基因存在后，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證存在于制劑中的目的基因經(jīng)腺病毒載體介導(dǎo)后，是否可在靶細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人ASPP2重組腺病毒感染人肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中目的蛋白的過(guò)表達(dá)情況。結(jié)果顯示在病毒感染24 h，ASPP2腺病毒感染細(xì)胞比未感染細(xì)胞存在ASPP2蛋白的高表達(dá)現(xiàn)象。見(jiàn)Fig 2。

Fig 2　ASPP2 protein expression in infected HepG2 and Huh7 cells by human ASPP2 recombinant adenovirus

1：HepG2 cells；2：HepG2 cells infected by human ASPP2 recombinant adenovirus；3：Huh7 cells；4：Huh7 cells infected by human ASPP2 recombinant adenovirus

2.4生物學(xué)活性

效應(yīng)實(shí)驗(yàn)除了基因表達(dá)檢測(cè)外，還應(yīng)觀察表達(dá)的目的蛋白是否產(chǎn)生特定的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照腺病毒相比，人ASPP2重組腺病毒(劑量)在不同時(shí)間段都存在不同程度的生長(zhǎng)抑制情況。當(dāng)人ASPP2重組腺病毒在5×107pfu/mL滴度下作用HepG2細(xì)胞72 h時(shí)的生長(zhǎng)抑制率為50.5%；當(dāng)人ASPP2重組腺病毒在1×108pfu/mL滴度下作用Huh7細(xì)胞72h時(shí)的生長(zhǎng)抑制率為61.69%，說(shuō)明ASPP2對(duì)肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。見(jiàn)Fig 3。

Fig 3　Growth inhibitory effect of ASPP2 recombinant adenovirus on HepG2 and Huh7 cells

2.5復(fù)制型腺病毒(RCA)檢測(cè)

由于復(fù)制型腺病毒(RCA)數(shù)量會(huì)隨著293細(xì)胞的傳代次數(shù)增加而增加，而RCA的產(chǎn)生會(huì)嚴(yán)重干擾重組腺病毒載體的使用效果，并帶來(lái)安全隱患。RCA檢測(cè)是重組腺病毒制品安全性檢查的核心指標(biāo)。目前，SFDA和FDA推薦采用A549細(xì)胞生物學(xué)方法檢測(cè)RCA。非復(fù)制型腺病毒不會(huì)造成A549細(xì)胞產(chǎn)生CPE。規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)為：每3.0×1010VP中應(yīng)不高于1RCA(即≤1RCA/3.0×1010VP)。Fig 4顯示，實(shí)驗(yàn)組加入重組腺病毒樣品后，持續(xù)培養(yǎng)2周后未見(jiàn)CPE，而對(duì)照組293細(xì)胞則出現(xiàn)明顯的CPE。結(jié)果表明重組ASPP2腺病毒中的RCA符合SFDA標(biāo)準(zhǔn)。

Fig 4　RCA detection of ASPP2 recombinant adenovirus(×40)

A：Human ASPP2 recombinant adenovirus infected A549 cells for 14 days;B：Human ASPP2 recombinant adenovirus infected 293 cells for 7 days

3討論

癌癥是一種獲得性遺傳疾病，通過(guò)引入治療性腫瘤抑制基因或使癌基因失活，基因治療有望成為一種非常有效的抗腫瘤治療方式。其可產(chǎn)生針對(duì)每個(gè)腫瘤的精確遺傳結(jié)構(gòu)，因此能產(chǎn)生較低的全身毒性[11]。在眾多腫瘤抑制基因中，p53是最具潛力的治療性基因之一，作為“基因組衛(wèi)士”，它在受到癌基因、DNA損傷以及氧化應(yīng)激等刺激下，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制、衰老以及凋亡等途徑來(lái)發(fā)揮作用。而作為p53的結(jié)合蛋白，ASPP2在p53介導(dǎo)的凋亡基因轉(zhuǎn)錄的激活和細(xì)胞周期抑制上扮演重要角色[2]，同時(shí)ASPP2也具有p53非依賴的腫瘤抑制作用[12-13]，ASPP2可能成為未來(lái)腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。

臨床應(yīng)用腺病毒能夠高水平瞬時(shí)表達(dá)外源基因，腺病毒能夠促進(jìn)分裂、不分裂細(xì)胞系的局部和系統(tǒng)性的基因遞送和傳導(dǎo)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，重組腺病毒基因組能夠插入大量的外源DNA堿基，且不整合到宿主染色體上，這也是重組腺病毒的最大安全優(yōu)勢(shì)。作為基因治療載體必需符合兩個(gè)必要條件，一是進(jìn)入細(xì)胞后無(wú)法復(fù)制，不會(huì)產(chǎn)生具有感染力的病毒。另一是能在試管內(nèi)繁殖，并被組裝成具有感染力的病毒顆粒[14]。因此，批量擴(kuò)增的腺病毒制劑則需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制以保證藥物安全有效。

腺病毒顆粒數(shù)的檢測(cè)多采用A260紫外光吸收法，通過(guò)病毒基因組的光吸收值來(lái)計(jì)算，該方法要求病毒濃度和純度都要足夠高，同時(shí)此種方法不能區(qū)分感染型和缺陷型病毒顆粒。滴度代表具有感染能力的病毒顆粒數(shù)，它更為直觀地反映能進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的病毒顆粒，即有效劑量，是衡量腺病毒特性更為重要的指標(biāo)。我們選擇SFDA和FDA推薦的TCID50方法測(cè)定病毒滴度。這一方法的原理基于最高稀釋度下293細(xì)胞中病變效應(yīng)(CPE)的形成。該方法只需10 d就可以獲得結(jié)果，而且人為因素對(duì)結(jié)果的影響較小，結(jié)果的重復(fù)性更高。同時(shí)將滴度與顆粒數(shù)相比可得到腺病毒制品的比活性，F(xiàn)DA和SFDA推薦增加比活的概念來(lái)完善對(duì)此類產(chǎn)品的質(zhì)控，規(guī)定重組臨床級(jí)制品的比活性必須大于3.3%。在重組腺病毒的擴(kuò)增中，嚴(yán)格控制病毒種子的代數(shù)，盡量減少RCA的產(chǎn)生，以保證制劑的安全。

基因治療的體外藥效測(cè)定是評(píng)價(jià)其有效性的關(guān)鍵指標(biāo)。一般情況下，在體外將重組病毒感染細(xì)胞并培養(yǎng)后，可通過(guò)Western blot定性實(shí)驗(yàn)或ELISA定量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)上清中的目的蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，將ASPP2重組腺病毒感染HepG2和Huh7細(xì)胞后，采用Western blot方法鑒定出目的基因在靶細(xì)胞中獲得有效表達(dá)。在生物學(xué)活性測(cè)定中，為驗(yàn)證試驗(yàn)品是否具有抗腫瘤作用，我們選擇了兩種肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7，將ASPP2重組腺病毒同時(shí)作用這兩種細(xì)胞，觀察到其可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，證實(shí)了其體外具有抗腫瘤活性。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)《人基因治療和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》及《中國(guó)藥典》三部(2010版)相關(guān)要求，針對(duì)人ASPP2重組腺病毒的關(guān)鍵質(zhì)量屬性建立了質(zhì)控方法，初步為該制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善，保證其安全、有效、質(zhì)量可控以及后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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Quality control of human ASPP2 recombinant adenovirus

WANG Shuang，XU Jian-ji，LIU Xiao-ni, CHEN De-xi

(BeijingInstituteofHepatologyandBeijingYouanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Abstract:AimTo analyze the key quality and establish methods for essential quality control of human recombinant ASPP2 adenovirus. MethodsThe viral structural gene of E2B and target gene of ASPP2 were identified by PCR; The number of virus particles was measured by UV-SDS methods; Infectious titer was determined by TCID50 assay; Target protein of ASPP2 was observed by Western blot assay; The biological effects of recombinant adenovirus on liver cancer cells were evaluated by MTT assay; A549 cells were used to check replication of the competent adenovirus(RCA) by the observation of the cytopathic effect.ResultsPCR analysis of E2B and ASPP2 was in consistent with theoretical values; Particle numbers of virus were 5.6×1012VP/mL, infectious titer was 2×1011IU/mL and specific activity was 3.5%; ASPP2 protein expression could be detected when cells were infected with virus for 24 h; Growth inhibition of liver cancer cells could be found by adding recombinant ASPP2 adenovirus; The level of RCA was less than 1 RCA/3.0×1010VP, in line with the standards of China Food and Drug Administration(SFDA).ConclusionThe quality control methods were established aiming at key characters of human recombinant ASPP2 adenovirus, which may provide foundations for its quality standard and future applications.

Key words:gene therapy; adenovirus; ASPP2; quality control；virus specific activity；MTT

收稿日期:2016-01-06,修回日期:2016-02-01

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81272266)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助(No 2015-3-101)；國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(No 81361120401);北京市肝病研究所自主課題基金(No BJIH-01604)

作者簡(jiǎn)介：王爽(1984-)，女，博士生，助理研究員，研究方向：腫瘤生物學(xué)，E-mail：wsh1029@126.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.027

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0881-05

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R373.1；R394.2；R459.9；R735.7

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.054.html

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

劉曉霓(1972-)，女，博士，研究員，研究方向：抗腫瘤藥理學(xué)，通訊作者,E-mail：lxnlxm@126.com；

陳德喜(1962-)，男，博士，教授，研究方向：肝病基礎(chǔ)和臨床，通訊作者，E-mail:dexi09@yahoo.com