楊　敏，陸　雪，黃江菊，龍　銳，李　娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.耳鼻咽喉頭頸外科，2.藥學(xué)部，重慶　400016)

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苯環(huán)喹溴銨對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)MUC5AC的影響

楊敏1，陸雪1，黃江菊1，龍銳2，李娟2

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.耳鼻咽喉頭頸外科，2.藥學(xué)部，重慶400016)

摘要：目的探討苯環(huán)喹溴銨(bencycloquidium bromide，BCQB)對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞(human nasal epithelial cells，HNECs)表達(dá)黏蛋白MUC5AC的影響。方法將體外培養(yǎng)的原代人鼻黏膜上皮細(xì)胞分成對(duì)照組( C，不予任何處理)、LPS組( LPS，加入LPS 1 mg·L-1)、BCQB低劑量組( BCQBL，加入LPS 1 mg·L-1及BCQB 10-8mol·L-1)、BCQB中劑量組( BCQBM，加入LPS 1 mg·L-1及BCQB 10-7mol·L-1)、BCQB高劑量組( BCQBH，加入LPS 1 mg·L-1及BCQB 10-6mol·L-1)和異丙托溴銨組( ipratropium bromide，IB，加入LPS 1 mg·L-1及IB 10-6mol·L-1)。經(jīng)含生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)基37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，采用Real-time PCR法檢測(cè)鼻黏膜上皮細(xì)胞中MUC5AC mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)鼻黏膜上皮細(xì)胞中MUC5AC蛋白表達(dá)，ELISA法檢測(cè)上清液中MUC5AC蛋白表達(dá)。結(jié)果LPS組與對(duì)照組相比，MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(均P<0.01)，BCQB各劑量組與LPS組相比,MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01,P<0.05)，且高劑量組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論BCQB能夠抑制LPS誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)，提示其可能成為鼻腔黏液高分泌性疾病治療新藥。

關(guān)鍵詞：苯環(huán)喹溴銨；脂多糖；鼻黏膜；上皮細(xì)胞；黏液；MUC5AC

黏液分泌亢進(jìn)是很多氣道炎癥性疾病如哮喘、囊性纖維化、變應(yīng)性鼻炎、鼻-鼻竇炎的主要癥狀之一[1]。黏蛋白作為黏液的重要組成成分，是一種高度糖基化的大分子蛋白，分為膜結(jié)合型和分泌型，分泌型黏蛋白決定黏液的黏彈性，MUC5AC是人類氣道上皮細(xì)胞中重要的分泌型黏蛋白，是氣道黏液的主要成分之一。已有研究表明，MUC5AC在人鼻黏膜上皮細(xì)胞炎癥模型中明顯升高[2]。

膽堿能神經(jīng)通路在鼻腔黏膜的高分泌中起了重要的作用[3]，因此抗膽堿治療在理論上應(yīng)是鼻腔炎癥的一種有效藥物治療。近年人們還意識(shí)到，在人體內(nèi)存在著不依賴神經(jīng)的膽堿能系統(tǒng)，這種非神經(jīng)依賴性的膽堿系統(tǒng)失衡可導(dǎo)致疾病的發(fā)生[4]。苯環(huán)喹溴銨是一種新型的抗膽堿藥，能夠選擇性阻斷M3受體，對(duì)氣道炎癥具有較好的抑制作用[5-6]。本課題組前期研究顯示,苯環(huán)喹溴銨能有效抑制鼻炎大鼠鼻黏膜杯狀細(xì)胞的黏液合成和黏蛋白MUC5AC的表達(dá)[7]，但大鼠和人有種屬差異,因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探明苯環(huán)喹溴銨對(duì)LPS誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)的影響，從而為鼻腔炎性高分泌性疾病治療新藥的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

標(biāo)本來源重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科鼻腔擴(kuò)容術(shù)和鼻中隔偏曲患者的鉤突組織，患者無慢性鼻-鼻竇炎、無變態(tài)反應(yīng)性疾病，取材近1月內(nèi)無全身及局部使用糖皮質(zhì)激素及其他抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物及手術(shù)外傷史。

1.2藥品與主要試劑

胎牛血清、DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基購于美國(guó)Gibco公司，表皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、全反式維甲酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鼠抗人單克隆抗體細(xì)胞角蛋白CK18、I型膠原酶、核酸染料Hoechst 33258、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖、苯環(huán)喹溴銨、鼠抗人MUC5AC單克隆抗體均購于美國(guó)Sigma公司，青鏈霉素雙抗購于中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)公司， Dylight 549標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購于美國(guó)Abbkine公司，ELISA試劑盒購于中國(guó)上海西塘生物公司，ECL發(fā)光試劑盒購于美國(guó)Millipore公司，RNA提取試劑盒TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物均購于日本TaKaRa公司，胰島素及兩性霉素B由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥房提供。

1.3鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

參照Wang等[8]的培養(yǎng)方法，做適當(dāng)調(diào)整。將取下的鉤突組織用含有青霉素(1×105IU·L-1)和鏈霉素(100 g·L-1)的生理鹽水反復(fù)沖洗5次，去除黏液、血液、壞死物及黏膜下組織。將組織剪碎成1 mm3大小，質(zhì)量濃度為1 g·L-1Ⅰ型膠原酶37 ℃消化1 h，篩網(wǎng)過濾去除未消化的組織塊。4℃ 1 000 r·min-1離心5 min后棄上清，加入含有15%的胎牛血清、青霉素(1×105IU·L-1)和鏈霉素(100 g·L-1)的DMEM/F-12(1 ∶1)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。差速貼壁1 h去除成纖維細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞活性大于90%，接種于6孔板，置5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。24 h后更換為含1×105IU·L-1青霉素、100 g·L-1鏈霉素、2.5 mg·L-1兩性霉素B、20 μg·L-1表皮生長(zhǎng)因子、4 mg·L-1內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、100 μg·L-1維生素A酸、5 mg·L-1轉(zhuǎn)鐵蛋白、40 IU·L-1胰島素的無血清培養(yǎng)基，隔天換液1次。培養(yǎng)1周左右，細(xì)胞接近匯合時(shí)進(jìn)行傳代，用第2代細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4免疫熒光鑒定

培養(yǎng)細(xì)胞接近匯合時(shí)去培養(yǎng)基，PBS洗2次，每次3 min；經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，每次3 min；體積分?jǐn)?shù)0.002 Triton X-100穿透20 min，PBS洗2次，每次3 min；體積分?jǐn)?shù)為0.05的牛血清白蛋白封閉60 min；加入鼠抗人角蛋白CK18單克隆抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗2次，每次3 min；Dylight 549標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，避光室溫孵育2 h，PBS洗2次，每次3 min；Hoechst 33258避光室溫核染5 min，PBS洗2次，每次3 min；熒光顯微鏡下觀察染色情況。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.5MTT法檢測(cè)BCQB對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞活性的影響

按照文獻(xiàn)介紹的方法做必要調(diào)整[9]。細(xì)胞近匯合時(shí)制備1×105·L-1的含血清細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后吸出上清液，加入100 μL含不同濃度BCQB的無血清培養(yǎng)基，并將其分為對(duì)照組(常規(guī)無血清培養(yǎng))和實(shí)驗(yàn)組(分別加入含10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1BCQB的培養(yǎng)基)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。無血清培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)液及MTT，每孔加入DMSO 150 μL，脫色搖床室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度(A，abstract)值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組抑制率/%=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。為使藥物安全有效，本課題選擇使細(xì)胞抑制率<10%(即存活率>90%)的藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6實(shí)驗(yàn)分組及處理

將培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞分成對(duì)照組、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組、BCQB低劑量組、BCQB中劑量組、BCQB高劑量組和異丙托溴銨組(IB組)(陽性對(duì)照組)。對(duì)照組加入無血清培養(yǎng)基；LPS組加入含LPS(1 mg·L-1)的無血清培養(yǎng)基；BCQB低劑量組、中劑量組和高劑量組先加入含BCQB(濃度分別為10-8、10-7、10-6mol·L-1)的無血清培養(yǎng)基孵育30 min后，再加入LPS(1 mg·L-1)；IB組先加入含IB(10-6mol·L-1)的無血清培養(yǎng)基孵育30 min后，再加入LPS(1 mg·L-1)。干預(yù)后各組放5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.7Real-time PCR檢測(cè)MUC5AC mRNA表達(dá)

收集細(xì)胞分別提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用CFX96熒光定量PCR儀檢測(cè)MUC5AC mRNA的表達(dá)。MUC5AC上游引物5′-TACCAGTGCCAGTGTGTGTGC-3′，下游引物5′-GCCATACACGGGCACAATCT-3′，擴(kuò)增片段大小為126 bp；GAPDH上游引物5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，下游引物5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′，擴(kuò)增片段大小為132 bp。反應(yīng)體系為：模板1 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，SYBR熒光酶5 μL，DEPC水3.2 μL，共10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，軟件自動(dòng)分析出MUC5AC mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8Western blot檢測(cè)MUC5AC蛋白表達(dá)

收集已處理好的各組細(xì)胞，提取總蛋白，分別進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，蛋白變性處理。取40 μg待測(cè)蛋白樣品行SDS-PAGE電泳(90 V 2 h)，電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5% BSA封閉2 h后，加入一抗(1 ∶100)，4 ℃過夜；加入二抗(1 ∶3 000，)常溫1 h；顯色、曝光、Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9ELISA法檢測(cè)MUC5AC蛋白表達(dá)

收集各組上清液，2 000 r·min-1，離心15 min，采用雙抗夾心法定量檢測(cè)上清液中黏蛋白MUC5AC的表達(dá)量，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。ELISA試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司，檢測(cè)靈敏度為300 μg·L-1，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在450 nm處吸光值(A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將A值換算成濃度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1鼻黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)情況

細(xì)胞懸液接種后于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)，分散呈單個(gè)懸浮于培養(yǎng)基中，未見明顯纖毛運(yùn)動(dòng)。培養(yǎng)24 h后，大部分細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)，部分呈圓形，部分呈多角形。3～4 d后細(xì)胞聚集成短梭形，多個(gè)小集落生長(zhǎng)。6～7 d后細(xì)胞集落進(jìn)一步增大、增多，逐漸匯合成“鋪路石”狀，未見明顯纖毛擺動(dòng)。

Fig 1　Primary culture of human nasal epithelial cells(×200)

A: Cells after 24 hours；B: Cells after 3～4 days；C: Cells after 6～7 days

2.2免疫熒光鑒定結(jié)果

經(jīng)免疫熒光染色細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin antibody18，CK 18)陽性，呈紅色熒光，證實(shí)為上皮源性細(xì)胞(Fig 2)。

Fig 2　Immunofluorescence staining for expression of CK 18 in HNECs(×200)

A：Hoechst33258；B：CK18；C：Merge

2.3BCQB對(duì)鼻黏膜上皮細(xì)胞活性的影響

不同濃度的BCQB作用于鼻黏膜上皮細(xì)胞24 h后能不同程度抑制細(xì)胞活性，其抑制作用隨藥物濃度增加而不斷加強(qiáng)。當(dāng)BCQB濃度在10-6,10-7,10-8mol·L-1時(shí)，抑制率在10%以下(即細(xì)胞存活率>90%)，即藥物濃度安全，因此本研究選擇10-6、10-7、10-8mol·L-1作為高、中、低劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(Fig 3)。

2.4Real-time PCR檢測(cè)MUC5AC mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，LPS組MUC5AC mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，表明LPS能夠成功誘導(dǎo)鼻黏膜上皮MUC5AC mRNA表達(dá)； BCQB低劑量組MUC5AC mRNA低于LPS組(P<0.05)，高于對(duì)照組(P<0.01)，表明低劑量組能夠降低LPS誘導(dǎo)的MUC5AC，但不能完全使其恢復(fù)正常；BCQB中劑量組表達(dá)低于LPS組(P<0.01)，但高于對(duì)照組(P<0.01)，表明中劑量組能夠降低LPS誘導(dǎo)的MUC5AC，但不能完全使其恢復(fù)正常；高劑量組和IB組的表達(dá)均低于LPS組(P<0.01)，與對(duì)照組相比差異不明顯(P>0.05)，表明高劑量組能夠降低LPS誘導(dǎo)的MUC5AC，并使其基本恢復(fù)正常水平(Fig 4)。

Fig 3　The inhibition effect of BCQB on HNECs(%)

Fig 4　MUC5AC mRNA expression in HNECs

**P<0.01vsC;#P<0.05,##P<0.01vsLPS

2.5Western blot檢測(cè)MUC5AC蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示，LPS組MUC5AC蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，表明LPS能夠成功誘導(dǎo)鼻黏膜上皮MUC5AC蛋白表達(dá)。苯環(huán)喹溴銨中、低劑量組均低于LPS組(P<0.01)，但高于對(duì)照組(P<0.01)，表明中、低劑量組能夠降低LPS誘導(dǎo)的MUC5AC，但不能完全使其恢復(fù)正常；高劑量組和IB組的表達(dá)均低于LPS組(P<0.01)，與對(duì)照組相比差異不明顯(P>0.05)，表明高劑量組能夠降低LPS誘導(dǎo)的MUC5AC，并使其基本恢復(fù)正常水平(Fig 5,6)。

Fig 5　MUC5AC protein expression

1：C；2：LPS；3：BCQBL；4：BCQBM；5：BCQBH；6：IB

Fig 6　The protein expression of MUC5AC

**P<0.01vsC；##P<0.01vsLPS

2.6ELISA檢測(cè)MUC5AC蛋白表達(dá)

LPS組上清液中MUC5AC蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，表明LPS能夠成功誘導(dǎo)鼻黏膜上皮MUC5AC蛋白表達(dá)。苯環(huán)喹溴銨高、中、低劑量組及異丙托溴銨組均低于LPS組(P<0.01)，與對(duì)照組水平相當(dāng)(P>0.05)，苯環(huán)喹溴銨高、中、低劑量組及異丙托溴銨組MUC5AC表達(dá)水平接近，差異無顯著性(P>0.05)，表明BCQB各劑量組對(duì)LPS誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮高表達(dá)MUC5AC治療有效，且各劑量組均能使MUC5AC基本恢復(fù)正常(Fig 7)。

3討論

在氣道炎癥性疾病過程中，黏蛋白基因表達(dá)上調(diào), 分泌細(xì)胞增生肥大, 產(chǎn)生大量黏蛋白, 是氣道高分泌的首要現(xiàn)象[10]。黏蛋白是氣道黏液的主要分子組成，在已知的20多種人類黏蛋白基因中，MUC5AC被認(rèn)為是鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的主要黏蛋白基因[11]。因此,本研究選定MUC5AC 為炎性高分泌調(diào)控的靶蛋白。脂多糖是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分，可引起呼吸道上皮損傷，常被用來制作各種炎癥模型[12-13]。Rhee等[14]的研究中LPS可成功誘導(dǎo)大鼠氣道高表達(dá)MUC5AC，Kim等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠誘導(dǎo)鼻竇炎大鼠模型的鼻黏膜MUC5AC基因表達(dá)升高，Wang等[2]的研究表明LPS能夠使體外培養(yǎng)的正常人鼻黏膜上皮細(xì)胞高表達(dá)MUC5AC。因此，本研究選擇LPS作為誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功誘導(dǎo)了體外培養(yǎng)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞高表達(dá)MUC5AC，證明其可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 7　The protein expression of MUC5AC in supernatant detected by ELISA(μg·L-1)

**P<0.01vsC；##P<0.01vsLPS

Cortijo等[16]的研究發(fā)現(xiàn),M受體拮抗藥阿地溴銨能夠減少人支氣管和培養(yǎng)的呼吸道上皮細(xì)胞中MUC5AC 表達(dá)水平，抑制杯狀細(xì)胞增生。Bos 等[17]的研究也發(fā)現(xiàn), M 受體拮抗藥噻托溴銨不僅能抑制過敏原誘導(dǎo)的黏液腺增生、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，還能降低杯狀細(xì)胞黏蛋白基因MUC5AC 表達(dá)水平。提示，M 受體拮抗劑能下調(diào)氣道黏蛋白基因的表達(dá)，從而緩解氣道的炎性高分泌現(xiàn)象。目前，世界各國(guó)耳鼻咽喉科專家一致承認(rèn)“同一氣道同一疾病”(one airway one disease)的觀點(diǎn)[18]，認(rèn)為上、下氣道在組織結(jié)構(gòu)上是連續(xù)的，上、下氣道的疾病是密切相關(guān)的。因此，M 受體拮抗劑可能通過下調(diào)氣道MUC5AC 的表達(dá)來發(fā)揮對(duì)鼻炎鼻分泌亢進(jìn)的緩解作用。

苯環(huán)喹溴銨是我國(guó)自主研發(fā)的選擇性M3膽堿受體拮抗藥，已獲得中國(guó)專利，目前該藥的三期臨床試驗(yàn)已經(jīng)基本完成，有望獲得批準(zhǔn)治療各型鼻炎、哮喘等分泌亢進(jìn)的疾病。本課題組前期研究提示苯環(huán)喹溴銨能夠緩解大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀，減少鼻黏膜黏蛋白MUC5AC的表達(dá)[7]。本研究中，我們?cè)隗w外研究了苯環(huán)喹溴銨對(duì)LPS誘導(dǎo)的鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC的影響。從熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果可以看出，苯環(huán)喹溴銨各劑量組MUC5AC mRNA的表達(dá)均較LPS組明顯降低，提示BCQB能夠從核酸水平對(duì)LPS誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞MUC5AC的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。從Western blot和ELISA檢測(cè)結(jié)果中我們觀察到，苯環(huán)喹溴銨高、中、低劑量組MUC5AC蛋白表達(dá)與LPS組相比均明顯下降。這表明，苯環(huán)喹溴銨能夠從蛋白水平抑制LPS誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)MUC5AC。結(jié)合PCR、Western blot和ELISA 結(jié)果,我們從體外實(shí)驗(yàn)證明BCQB對(duì)于鼻黏膜上皮細(xì)胞高分泌MUC5AC具有抑制作用。

綜上所述，本研究提示苯環(huán)喹溴銨能夠抑制LPS誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞MUC5AC的表達(dá)，這與我們前期的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說明BCQB能有效抑制鼻炎狀態(tài)下鼻黏膜MUC5AC的表達(dá)，但其在體外具體的作用機(jī)制，通過何種細(xì)胞內(nèi)外通路起作用的，有待進(jìn)一步研究闡明。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)完成于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心。實(shí)驗(yàn)過程中的標(biāo)本采集得到重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科柯霞老師、楊玉成老師等的幫助，實(shí)驗(yàn)中所涉及的技術(shù)方法得到實(shí)驗(yàn)研究中心湯為學(xué)老師、陳力學(xué)老師及鄧曉娟老師的幫助，在此深表感謝！)

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Effects of bencycloquidium bromide on the expression of MUC5AC induced by lipopolysaccharide in cultured human nasal epithelial cells

YANG Min1，LU Xue1，HUANG Jiang-ju1，LONG Rui2，LI Juan2

(1.DeptofOtorhinolaryngology-HeadandNeckSurgery，2.DeptofPharmacology，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Abstract:AimTo investigate the effect of bencycloquidium bromide(BCQB) on mucus MUC5AC expression induced by lipopolysaccharide in cultured human nasal epithelial cells(HNECs).MethodsPrimary culture of human nasal epithelial cells(HNECs) was randomly divided into control group(C，with no treatment),LPS group(LPS，with LPS 1 mg·L-1added in),BCQB low dose group(BCQBL，with LPS 1 mg·L-1and BCQB 10-8mol·L-1added in), BCQB middle dose group(BCQBM，with LPS 1 mg·L-1and BCQB 10-7mol·L-1added in),BCQB high dose group(BCQBH，with LPS 1 mg·L-1and BCQB 10-6mol·L-1added in) and ipratropium bromide group(IB，with LPS 1 mg·L-1and IB 10-6mol·L-1added in). After incubation at 37 ℃ with 5% CO2for 24 h, the expression of MUC5AC mRNA was detected with Real-time PCR and the expression of MUC5AC protein in HNECs was detected with Western blot, while the expression of MUC5AC protein in supernatant was detected with ELISA in each group.ResultsAs compared with control group，the expression of MUC5AC mRNA and protein increased significantly in LPS group(eachP<0.01).As compared with LPS group，the expression of MUC5AC mRNA and protein decreased significantly in each group of BCQB(P<0.01，P<0.05)，and there was no statistical difference between BCQB high dose group and control group(eachP>0.05).ConclusionBencycloquidium bromide can suppress MUC5AC expression induced by LPS in cultured human nasal epithelial cells，indicating that BCQB may be a new drug for nasal mucous hypersecretion diseases.

Key words：bencycloquidium bromide；lipopolysaccharide；nasal mucosa； epithelial cell；mucus；MUC5AC

收稿日期:2016-01-06,修回日期:2016-03-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No 81200008);國(guó)家臨床重點(diǎn)專科項(xiàng)目(No 衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號(hào));重慶市衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(No 2011-2-047)

作者簡(jiǎn)介：楊敏(1988-)，女，碩士生，研究方向：鼻科學(xué)疾病，E-mail:yangmin2006112511@163.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.010

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0783-06

中國(guó)圖書分類號(hào)：R322.31；R329.24；R765.25

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.020.html

黃江菊(1965-)，女，博士，副教授，研究方向：鼻科學(xué)疾病，通訊作者，Tel:023-89012015,E-mail：huangjiangju@foxmail.com