柯昌能，方景玲，李維珊，鄒松云

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院燒傷整形科，廣東 深圳 518100

·基礎(chǔ)研究·

腭胚突發(fā)育過程中survivin蛋白的差異性表達(dá)及意義

柯昌能，方景玲，李維珊，鄒松云

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院燒傷整形科，廣東 深圳 518100

目的 探討腭胚突發(fā)育過程中survivin蛋白的表達(dá)。方法 取孕第13.5天、14.5天、15.5天近交系C57BL/6 J鼠胚；免疫組織化學(xué)和Western blot 檢測survivin蛋白的表達(dá)。結(jié)果 survivin蛋白主要表達(dá)于腭胚突周皮細(xì)胞；孕第13.5天的表達(dá)強度明顯高于孕第14.5天、15.5天。結(jié)論 survivin的表達(dá)在腭胚的發(fā)育過程中存在差異性；這種差異性可能對維持腭胚的生長和融合起重要作用。

Survivin；腭；發(fā)育；胚胎

腭胚的發(fā)育大致分為三個階段：兩側(cè)上頜生長弓處腭原基的誘導(dǎo)生成并沿舌側(cè)邊緣垂直向下生長；兩側(cè)腭板相對上抬致水平位置并向中線靠攏；兩側(cè)腭板的黏附、腭中脊上皮的形成和消失[1]。此過程涉及組織細(xì)胞的遷移、生長、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)分子的合成和信號通路分子等的協(xié)同作用。上述環(huán)節(jié)受到干擾，將導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，survivin在細(xì)胞的分裂、遷移、生存中起重要作用,與胚胎早期的正常發(fā)育有關(guān)。本文研究鼠腭胚的不同發(fā)育階段survivin的表達(dá)情況，探討其在腭胚正常發(fā)育中的作用。

1 材 料 和 方 法

1.1 標(biāo)本的獲取

1.1.1 實驗動物飼養(yǎng)、觀察 8周齡近交系C57BL/6 J小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房, 雌雄比例1∶1 配對，晚6時至次日6時合籠, 次晨檢查雌鼠, 有陰道粘液栓者為交配陽性,, 定此日胎齡為0.5天(E0.5)。

1.1.2 標(biāo)本取材 取妊娠第13.5(E13.5)、14.5(E14.5)、15.5(E15.5)天母鼠，以頸椎脫位方式處死, 剖腹取出胎鼠。部分胎鼠放入4 %的多聚甲醛液中，4℃過夜固定，備作石蠟切片。部分胎鼠在解剖顯微鏡下取出腭胚突，放液氮罐中凍成備用。

1.2 試 劑

survivin蛋白抗體(兔抗鼠，Sigma公司)、全蛋白提取試劑盒(Sigma公司)、β-actin抗體(Sigma公司)、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟,后按說明書操作；光鏡下細(xì)胞呈棕色為陽性。

1.4 Western blot 檢測按常規(guī)操作，包括提取總蛋白、電泳、轉(zhuǎn)印、雜交、洗膜、染色。survivin抗體1:200稀釋和β-actin抗體1:1000稀釋。凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析，以相對灰度值代表蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較用檢驗，多組間比較方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin 在腭胚組織中的免疫組織化學(xué)染色

鼠胚13.5天，兩側(cè)腭胚突組織沿舌側(cè)垂直生長；survivin主要表達(dá)于腭胚突周皮層細(xì)胞的胞漿，間充質(zhì)細(xì)胞無表達(dá)。鼠胚14.5天，兩側(cè)腭胚突組織上抬，黏附；中間形成上皮嵴，腭突未融合；腭胚突周皮層細(xì)胞和中間上皮嵴細(xì)胞survivin表達(dá)減弱；鼠胚15.5天，兩側(cè)腭胚突組織融合，中間上皮帶消失，腭胚周皮層細(xì)胞survivin少許表達(dá)(圖1)。圖1. 小鼠胚胎13.5，14.5，15.5天腭突上皮survivin的表達(dá)(p 腭突，t 舌)

2.2 腭胚組織中survivin蛋白Western blot 檢測Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，鼠胚13.5、14.5、15.5天，腭胚突組織survivin蛋白表達(dá)的灰度比值分別為（0.85±0.12）、（0.42±0.24）、（0.34±15）；15鼠胚E13.5腭突組織survivin蛋白表達(dá)的明顯強于E14.5及E15.5（15.5P＜0.01）0.01

3 討 論

Survivin 是一種凋亡抑制蛋白家,主要表達(dá)于腫瘤組織、造血干細(xì)胞、胚胎發(fā)育組織、分泌期子宮內(nèi)膜等組織；大多數(shù)人類終末分化成熟的成體組織少有表達(dá)。它與細(xì)胞分裂、增殖等功能密切相關(guān)。正常情況下，survivin在維持人類早期胚胎及胸腺的發(fā)育中起重要作用[2][2]。

腭胚的正常發(fā)育涉及兩個重要環(huán)節(jié)：兩側(cè)腭胚的正常生長及融合；該過程與細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡有關(guān)；某一環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，將導(dǎo)致腭裂的發(fā)生[3][3]。本研究發(fā)現(xiàn)，腭胚發(fā)育的早期，survivin主要表達(dá)于腭胚周皮層細(xì)胞，強度較高；可能與survivin維持vin腭胚早期生長，抑制周皮層細(xì)胞的凋亡有關(guān)。在幾個基因敲除的動物模型中發(fā)現(xiàn)，腭裂的發(fā)生與腭胚同口腔組織黏連，限制腭胚突的上抬有關(guān)；其發(fā)生機理涉及腭胚周皮層細(xì)胞的過多、過早凋亡[4,5][4,5]。Survivinvivin維持胚胎的正常發(fā)育與其抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞分裂有關(guān)；IRF6等基因敲除動物所發(fā)生的腭裂模型是否與survivin的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、極性改變，促進腭胚同口腔組織的不正常融合有關(guān)，有待進一步深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著腭胚的發(fā)育，survivin的表達(dá)下降。在胚胎14.5天，兩側(cè)腭胚接觸，形成中間上皮嵴；免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)上皮嵴細(xì)胞survivinvivin的表達(dá)明顯下降。中間上皮嵴的消失是腭胚正常發(fā)育的關(guān)鍵一環(huán)。許多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在腭胚中間上皮嵴消失中起重要作用；抑制細(xì)胞凋亡，將導(dǎo)致腭裂的融合障礙[6,7][6,7]。因此，腭胚的發(fā)育后期，survivinvivin的表達(dá)下降，有利于抑制上皮嵴細(xì)胞的增殖，促進凋亡，引導(dǎo)腭胚的融合。

總之，survivin的表達(dá)在腭胚的發(fā)育過程中存在差異性；這種差異性可能對維持腭胚的生長和融合起重要作用；survivin在腭胚發(fā)育過程中的差異性表達(dá)可能受相關(guān)基因調(diào)控，具體研究有待進一步深入。

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廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金：WSTJJ2012122420205197207095717】

柯昌能，男，1972，博士，副主任醫(yī)師。