鄧偉明　廖澤濤　黃志祥　郭欣　李天旺

強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞踝蛋白1表達(dá)的研究

鄧偉明廖澤濤黃志祥郭欣李天旺

510317 廣州，廣東省第二人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(鄧偉明，黃志祥，郭欣，李天旺)；510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(廖澤濤)

【摘要】目的探討強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者及健康志愿者(HV)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中踝蛋白1的表達(dá)水平及其差異。方法采集AS、RA患者及HV外周血樣本各30例，流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+ T細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞中踝蛋白1蛋白平均熒光強(qiáng)度(MFI)，逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)PBMC中踝蛋白1 mRNA表達(dá)水平，比較組間踝蛋白1在蛋白及mRNA表達(dá)的差異。結(jié)果在CD3+ T細(xì)胞及CD14+單核細(xì)胞中，AS患者的踝蛋白1 MFI水平均高于HV和RA患者(P均<0.05)，而HV與RA患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RT-PCR提示AS患者、HV及RA患者踝蛋白1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為1.37±0.22、0.26±0.05、0.27±0.06，AS患者的踝蛋白1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于HV和RA患者(P均<0.05)。結(jié)論AS患者PBMC中踝蛋白1表達(dá)水平明顯高于HV及RA患者，提示踝蛋白1可能在AS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】強(qiáng)直性脊柱炎；外周血單個(gè)核細(xì)胞；踝蛋白1；平均熒光強(qiáng)度；

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

Mean fluorescence intensity; Reverse transcription-polymerase chain reaction

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種常見(jiàn)的炎癥性系統(tǒng)性風(fēng)濕病，其發(fā)病率及致殘率均較高，但病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確[1-2]。整合素是一類普遍存在的跨膜糖蛋白，參與細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)(ECM)間的黏附及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)包括炎癥性疾病在內(nèi)多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[3]。踝蛋白1在整合素信號(hào)通路的活化過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。既往的蛋白質(zhì)組學(xué)研究初步發(fā)現(xiàn)，AS患者PBMC的踝蛋白1表達(dá)上調(diào)，提示整合素信號(hào)通路可能涉及AS的發(fā)病及炎癥調(diào)節(jié)[4]。故本研究擬通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)AS患者單核及T細(xì)胞中踝蛋白1蛋白平均熒光強(qiáng)度(MFI)，并以逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)法檢測(cè)AS患者PBMC中踝蛋白1 mRNA的表達(dá)情況，同時(shí)以健康志愿者(HV)及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者為對(duì)照，比較踝蛋白1在3組中的表達(dá)差異，初步探討踝蛋白1在AS發(fā)病及炎癥活動(dòng)中的作用及其臨床意義。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入初診活動(dòng)期AS患者30例(AS組)，同時(shí)納入活動(dòng)期RA患者30例(RA組)。AS組患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40歲；②符合1984年修訂的AS紐約標(biāo)準(zhǔn)；③無(wú)其他慢性病病史；④入選前3個(gè)月內(nèi)無(wú)急性感染史；⑤入組前3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)任何緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物及糖皮質(zhì)激素；⑥無(wú)生物制劑使用史；⑦畢氏AS疾病活動(dòng)指數(shù)(BASDAI)≥4。RA組患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40歲；②診斷上滿足1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；③為初治或病情反復(fù)的患者，近3月內(nèi)未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑；④疾病活動(dòng)度評(píng)分(DAS28-4)均>5.1分；⑤近2月內(nèi)無(wú)任何急性感染病史；⑥無(wú)其他慢性病病史。另納入年齡20～40歲的30名HV(HV組)作對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組的個(gè)體均為自愿參加試驗(yàn)，并于入選時(shí)簽署知情同意書(shū)。

二、標(biāo)本采集

對(duì)入組的每例個(gè)體，均以真空EDTA抗凝管(2 ml及4 ml各1管)于空腹?fàn)顟B(tài)經(jīng)外周靜脈采血6 ml，立刻置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ渲? ml靜脈血于6 h內(nèi)進(jìn)行免疫熒光染色處理并于當(dāng)日進(jìn)行FCM分析；4 ml靜脈血于2 h內(nèi)用于分離PBMC，并提取總RNA用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

三、方法

1. 踝蛋白1的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取依地酸二鈉(EDTA)抗凝全血標(biāo)本100 μl，分別加入PE anti-human CD14(美國(guó)BD Biosciences)、PE-CY5 anti-human CD3(美國(guó)BD Biosciences)各5 μl混勻，經(jīng)過(guò)避光孵育及離心后，加入紅細(xì)胞裂解液并離心，棄去上清后充分固定，在破膜之后加入踝蛋白 1抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)，最后加入FITC標(biāo)記的二抗(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)，避光孵育待測(cè)。以FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson)檢測(cè)及分析PBMC(CD14+單核細(xì)胞及CD3+T細(xì)胞)中踝蛋白1的MFI值。

2. 踝蛋白1的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

采用RT-PCR法，將Trizol Regent(美國(guó)Introgen公司)加入PBMC裂解細(xì)胞，然后按1 ml含細(xì)胞裂解產(chǎn)物的Trizol加200 μl氯仿的比例加入氯仿萃取總RNA，并以異丙醇將總RNA析出后加入DEPC水溶解。按照RevertAid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas)說(shuō)明書(shū)合成模板DNA。通過(guò)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，其中踝蛋白1基因的引物序列為：上游5′-CTGACAACAACCCTCAACGA-3′，下游5′-CTGTGGCAATGACATCTTCC-3′，踝蛋白 1基因擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 186 bp；選用GAPDH為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游5′-TCCACCACCCTGTTGGTGTA-3′，下游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，GAPDH基因擴(kuò)增長(zhǎng)度為452 bp。PCR反應(yīng)總體積20 μl，按照2倍體積Taq Plus PCR Masker Mix(中國(guó)天根生物技術(shù))說(shuō)明書(shū)將各成分充分混合后，按照94℃預(yù)變性3 min、 94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。最后取PCR產(chǎn)物置2%瓊脂糖凝膠電泳，成像儀拍攝并分析踝蛋白 1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(踝蛋白 1 mRNA的光密度值/GAPDH mRNA的光密度值)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、研究對(duì)象的臨床特征

AS組30例患者，年齡(27.6±7.6)歲，男18例、女12例；RA組30例患者，年齡(30.1±5.9)歲，男12例、女18例；HV組30名，年齡(27.4±6.2)歲，男17例、女13例。3組研究對(duì)象的年齡和性別構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

二、PBMC中踝蛋白1的蛋白表達(dá)水平比較

在CD14+單核細(xì)胞及CD3+T細(xì)胞中， AS組踝蛋白1的MFI值均高于HV組及RA組(P均<0.05)，而HV組與RA組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　　　　AS、HV與RA的PBMC中

注：CD14+單核細(xì)胞中，AS組與HV組比較q=5.21、aP<0.05，AS組與RA組比較q=6.24、bP<0.05；CD3+T細(xì)胞中，AS組與HV組比較q=9.49、aP<0.05，AS與RA組比較q=10.16、bP<0.05

三、PBMC中踝蛋白1 mRNA表達(dá)水平比較

AS組、HV組及RA組PBMC中踝蛋白1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.37±0.22、0.26±0.05及0.27±0.06，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=536.948，P<0.001)，AS組PBMC中踝蛋白 1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于HV組(q=37.70，P<0.05)及RA組(q=37.36，P<0.05)，而RA組與HV組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.34，P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1　AS、HV與RA組間PBMC中踝蛋白1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

A：踝蛋白1及內(nèi)參GAPDH mRNA在PBMC中的表達(dá)情況，其中M為標(biāo)記物、泳道1～4為AS患者、泳道5～8為HV個(gè)體、泳道9～12為RA患者；B：3組研究對(duì)象踝蛋白 1 mRNA定量結(jié)果

討論

AS是一種以中軸關(guān)節(jié)受累為特征的慢性炎癥性風(fēng)濕病，其發(fā)病機(jī)制仍未清楚。有研究表明其發(fā)生、發(fā)展與自身炎癥或免疫系統(tǒng)功能異常有關(guān)[5-6]。多項(xiàng)研究表明，單核細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在AS發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用[7-8]。AS的主要臨床癥狀是慢性炎癥反應(yīng)，但免疫細(xì)胞在其發(fā)病過(guò)程中的作用日益受關(guān)注，研究表明，抑制T細(xì)胞反應(yīng)可以提高TNF-α拮抗劑對(duì)AS的療效[9]。淋巴細(xì)胞在AS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[10]。但其具體機(jī)制尚未明確。本研究探討了AS、RA及HV中踝蛋白1在單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的表達(dá)是否存在差異。

整合素家族是一組介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與ECM間相互作用的受體，它們不僅可識(shí)別細(xì)胞外環(huán)境，將信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)，還可經(jīng)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)節(jié)其與配體的親和力，這個(gè)過(guò)程也稱為整合素的活化。它們參與了細(xì)胞增殖、遷移、凋亡與信號(hào)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。嚴(yán)重的整合素結(jié)構(gòu)改變及整合素通路異常，可導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變乃至疾病的發(fā)生。整合素參與了炎癥細(xì)胞的活化與遷移[10-12]。Van Damme等[13]研究顯示，AS患者腸黏膜T細(xì)胞中整合素αEβ7表達(dá)增高。許多研究表明，整合素參與RA、AS疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[14-16]。

踝蛋白1是整合素的一個(gè)重要配體，是免疫細(xì)胞踝蛋白的關(guān)鍵部分，在整合素介導(dǎo)細(xì)胞黏附過(guò)程中起關(guān)鍵作用。其通過(guò)與其胞內(nèi)亞單位結(jié)合從而參與整合素通路的活化。在炎癥細(xì)胞因子刺激下，白細(xì)胞表面的整合素受體由靜止構(gòu)象轉(zhuǎn)換為活性構(gòu)象，促使其活化并向炎癥區(qū)域遷移，參與炎癥性疾病的病理生理過(guò)程[17-18]。AS是一類慢性炎癥性疾病，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制雖未完全明確，但整合素在其發(fā)病過(guò)程中的作用日益受關(guān)注。本研究通過(guò)基因及蛋白水平檢測(cè)表明AS患者中踝蛋白1表達(dá)明顯高于HV，提示踝蛋白1在AS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

AS與RA是本質(zhì)不同的兩種疾病，但AS與RA在臨床表現(xiàn)、病理過(guò)程及病變部位上，均存在交叉及相似的地方，對(duì)于某些早期或不典型病例，有時(shí)臨床上也難以鑒別。因此，本研究中除了設(shè)立HV對(duì)照組外，同時(shí)用RA患者作為疾病對(duì)照組，以了解AS與RA患者間蛋白表達(dá)差異的情況。結(jié)果顯示，在RA患者中并未發(fā)現(xiàn)踝蛋白1表達(dá)增高，說(shuō)明AS與RA炎癥的產(chǎn)生可能是通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)的，踝蛋白1可能是AS潛在的、具有較高特異性的疾病標(biāo)志物，經(jīng)進(jìn)一步證實(shí)后既有可能為AS的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，也有可能作為AS特異的診斷指標(biāo)，用于AS的早期診斷及鑒別診斷。

綜上所述，踝蛋白1在AS患者PBMC中的表達(dá)水平明顯高于HV及RA患者，提示踝蛋白1可能在AS發(fā)病及炎癥活動(dòng)過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，但其與踝蛋白1的內(nèi)在聯(lián)系尚需繼續(xù)深入探討。

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Expression of Talin 1 in peripheral blood mononuclear cell in patients with ankylosing spondylitis

DengWeiming,LiaoZetao,HuangZhixiang,GuoXin，LiTianwang.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,GuangdongNo.2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of Talin 1(TLN 1) in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) among patients with ankylosing spondylitis (AS), rheumatoid arthritis (RA) and healthy volunteer (HV). MethodsCollect samples of peripheral blood in 30 patients with AS, HV and RA respectively. The mean fluorescence intensity (MFI) of TLN 1 in the CD3+ T lymphocytes and CD14+ monocytes were analyzed by flow cytometry. Also, the mRNA expression of TLN 1 in PBMC was detected by the reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein and mRNA level of TLN 1 were compared among AS, RA and HV groups. ResultsMFI of TLN 1 in CD3+ T lymphocytes and CD14+ monocytes of AS patients were both significantly higher than those of HV and RA patients (P<0.05), while there was no statistically significant difference between HV and RA patients (P>0.05). Moreover, the relative mRNA level of TLN 1 in patients with AS was 1.37 ± 0.22, significantly higher than that of HV and RA patients (0.05±0.27 and 0.26±0.06 respectively,both P<0.05). ConclusionTLN 1 was up-regulated in the PBMC of AS patients, indicated that TLN 1 might play an important role in the pathogenesis of AS.

【Key words】Ankylosing spondylitis; Peripheral blood mononuclear cell; Talin 1;

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.006

基金項(xiàng)目：廣東省第二人民醫(yī)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金(2014001)

通訊作者，李天旺，E-mail：litian-wang@163.com

Corresponding author, Li Tianwang, E-mail：litian-wang@163.com

(收稿日期：2016-03-10)(本文編輯：林燕薇)

·臨床研究論著·