吳奕征　孫葉丹　陸建紅　陳國軍　董長林

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，浙江　杭州　310029)

薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞因子表達(dá)水平及其免疫功能的影響

吳奕征孫葉丹1陸建紅2陳國軍2董長林2

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，浙江杭州310029)

〔摘要〕目的探討薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞因子表達(dá)水平及其免疫功能影響。方法選擇健康雄性Wistar大鼠，采用Ⅱ型膠原蛋白及弗氏完全佐劑建立大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型，隨機(jī)分為對照組、模型組、藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(分別為30.0、60.0、120.0 mg/kg薯蕷皂苷)，每組10只，第14天開始灌胃給藥，第35天處死大鼠，無菌取大鼠腹腔巨噬細(xì)胞測定其吞噬功能，測定白細(xì)胞介素(IL)-1水平，脾細(xì)胞分泌因子IL-2水平，PCR測定腹腔巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果與模型組比較，薯蕷皂苷藥物組可顯著抑制關(guān)節(jié)腫脹度(P<0.05)，減輕關(guān)節(jié)病理組織損傷，呈現(xiàn)一定劑量依賴性；與模型組比較，藥物組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能下降，IL-1及脾細(xì)胞IL-2分泌水平下降，TNF-α mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，呈現(xiàn)一定劑量依賴性。結(jié)論薯蕷皂苷可顯著抑制膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥程度，改善病理組織損傷，其作用機(jī)制可能與降低大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，下調(diào)炎癥因子分泌表達(dá)水平相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕薯蕷皂苷；巨噬細(xì)胞；免疫功能；TNF-α

目前對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，尚無較好根治方法〔1〕。薯蕷皂苷為薯蕷科植物穿山龍薯蕷根莖提取物，具有抗血栓形成、抗腫瘤、抗感染、抗過敏、抗病毒、降低膽固醇等多種藥理作用〔2〕。近年來研究結(jié)果顯示〔3〕，薯蕷皂苷具有較強(qiáng)抗炎作用，可抑制膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠足趾腫脹，可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性，降低血管生成因子表達(dá)水平，下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨環(huán)氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2表達(dá)水平，可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。本研究旨在探討薯蕷皂苷對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物選擇健康雄性Wistar大鼠，體重120～140 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號：SYXK-2013-0025)，SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，飲食進(jìn)水均符合實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)。

1.2試驗(yàn)藥物與試劑薯蕷皂苷(單體，購自美國Sigma公司，純度95%)采用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(購于南京建成生物工程研究所)配置相應(yīng)濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配，雞Ⅱ型膠原蛋白及弗氏完全佐劑(購于美國Sigma公司)，中性紅(購于美國Sigma公司)，腫瘤壞死因子(TNF)-α逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購于Promega公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動脈模型建立〔4〕?、蛐湍z原蛋白溶于冰乙酸(0.1 mol/L)制成2 g/L溶液，4℃攪拌過夜后等體積與弗氏完全佐劑1 g/L溶液混合乳化，制成混懸乳劑(濃度1 g/L)。分別于第0、7天大鼠背部皮內(nèi)注射1 ml混懸乳劑(每次6個點(diǎn))，對照組大鼠注射等量生理鹽水。造模14 d后選取關(guān)節(jié)評分>2分的大鼠，隨機(jī)分為模型組、藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組(30.0、60.0、120.0 mg/kg薯蕷皂苷)，每組10只，第14天開始灌胃給藥，對照組、模型組的大鼠給予等量CMC-Na，藥物組大鼠給予相應(yīng)劑量藥物，第35天處死大鼠。

1.3.2大鼠足腫脹度測定大鼠造模第7、14、21、28、35天測定體重及左后足爪容積(足爪儀)，足腫脹度=致炎后足爪容積-致炎前足爪容積。

1.3.3病理組織學(xué)觀察取大鼠膝關(guān)節(jié)用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定參考文獻(xiàn)〔5〕方法制備大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L(RPMI-1640培養(yǎng)液)，中性紅試驗(yàn)測定巨噬細(xì)胞吞噬功能〔6〕，酶標(biāo)儀測定吸光度A。

1.3.5脾淋巴細(xì)胞因子表達(dá)水平制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，加入3 mg/L刀豆蛋白誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌(IL)-2，采用脾淋巴細(xì)胞增殖法測定脾細(xì)胞因子IL-2水平〔7〕。

1.3.6巨噬細(xì)胞IL-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平參考文獻(xiàn)方法制備大鼠腹腔巨噬細(xì)胞〔5〕，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L，采用胸腺細(xì)胞增殖法測定巨噬細(xì)胞因子IL-1水平〔8〕，PCR測定腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)水平。引物由上海生物技術(shù)公司提供，重復(fù)循環(huán)30個：94℃變性40 s，54℃ 40 s、72℃1 min。采用Eagle eye TMⅡ型圖像分析系統(tǒng)掃描，TNF-α mRNA相對表達(dá)量=TNF-α吸光度/β-actin吸光度。TNF-α引物：片段長度426 bp，上游5′-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3′，下游5′-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′；β-actin引物：片段長度543 bp，

上游5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游5′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的影響與對照組比較，模型組大鼠7 d后體重增長緩慢，造模后14 d出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥，藥物組大鼠足腫脹有不同程度減輕(P<0.05)，體重有不同程度增加。見圖1。

2.2薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠病理組織損傷的影響對照組大鼠滑膜組織細(xì)胞排列整齊，軟骨表面光滑；模型組大鼠滑膜組織上皮細(xì)胞纖維化，細(xì)胞炎性浸潤增生，軟骨損傷。藥物組炎性細(xì)胞浸潤不同程度減輕，增生減少。見圖2。

A～E：分別為對照組、模型組、藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組圖1　薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠體重、足腫脹影響

圖2　薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠病理組織損傷的影響(HE，×200)

2.3薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及細(xì)胞因子的影響與對照組比較，模型組巨噬細(xì)胞吞噬功能升高，IL-1、IL-2水平增加，TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)，藥物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠吞噬吞噬功能不同程度降低(P<0.05)，IL-1、IL-2水平及TNF-α mRNA表達(dá)受到不同程度抑制，呈現(xiàn)一定劑量依賴性。見表1。

表1　薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與藥物Ⅰ組比較：3)P<0.05；與藥物Ⅱ組比較：4)P<0.05

3討論

膠原性關(guān)節(jié)炎模型與佐劑性關(guān)節(jié)炎模型均為免疫性炎癥模型，與佐劑性關(guān)節(jié)炎模型比較，膠原性關(guān)節(jié)炎模型免疫功能變化表現(xiàn)在細(xì)胞免疫及體液免疫，與人類類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎更接近，為篩選抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用有效模型〔9〕。薯蕷皂苷具有多種藥理活性，近年來研究表明薯蕷皂苷對于膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠有較強(qiáng)抗感染作用，可抑制小鼠耳廓腫脹及減輕小鼠扭體反應(yīng)，減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織增生及關(guān)節(jié)軟骨損傷，降低炎性細(xì)胞浸潤，可通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，降低血管生成因子表達(dá)水平，下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨COX-2、PGE2表達(dá)水平〔10〕。機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷后可導(dǎo)致癌癥、感染及自身免疫疾病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎為由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的炎癥性疾病。本研究提示薯蕷皂苷可明顯治療膠原性關(guān)節(jié)炎。

免疫系統(tǒng)受到特殊抗原及自身抗體刺激時，炎癥介質(zhì)主要來源于活化的巨噬細(xì)胞，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變過程中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)發(fā)揮重要作用，早期感染階段，巨噬細(xì)胞通過吞噬作用發(fā)揮非特異性免疫，活化巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子〔11，12〕。關(guān)節(jié)軟骨分解代謝過程中IL-1、TNF-α具有重要作用，可通過上調(diào)誘導(dǎo)酶、細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)破壞軟骨基質(zhì)，下調(diào)軟骨基因表達(dá)連接蛋白、Ⅱ型膠原等抑制合成軟骨基質(zhì)；IL-1與滑膜細(xì)胞纖維化及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等因素有關(guān)，TNF-α主要促進(jìn)炎癥反應(yīng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1，而IL-1可增加TNF-α活性〔11，12〕。抑制TNF-α、IL-1水平可減輕炎癥程度；IL-2可反映細(xì)胞免疫功能。本研究結(jié)果提示薯蕷皂苷抗感染與調(diào)節(jié)免疫功能與下調(diào)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-2表達(dá)水平相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-07-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：陸建紅(1969-)，女，副主任技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析方面的研究。

〔中圖分類號〕R.593.21

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2607-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.017

1浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院2武警浙江總隊(duì)嘉興醫(yī)院檢驗(yàn)科

第一作者：吳奕征(1994-)，男，在讀本科，主要從事臨床醫(yī)學(xué)及實(shí)驗(yàn)診斷研究。