劉集鴻　蔣楠楠　張麗科　鄧寧

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靶向c?myc基因的siRNA基因干擾對大腸癌Lovo細胞增殖與凋亡的影響

劉集鴻1蔣楠楠1張麗科1鄧寧2

［摘要］目的闡述靶向c?myc基因的siRNA基因轉染干擾對大腸癌Lovo細胞增殖與凋亡的影響作用。方法將靶向c?myc基因的siRNA片段轉染入大腸癌Lovo細胞，特異沉默c?myc基因，通過實時熒光定量PCR法檢測c?myc mRNA表達水平，原位末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測腫瘤細胞凋亡情況及噻唑藍法［3?（4，5?dimethyl?2?thiazolyl）?2，5?diphenyl?2?H?tetrazolium bromide，MTT］檢測細胞的增殖能力。結果經(jīng)過轉染的Lovo細胞組與未轉染的對照組c?myc mRNA表達量比率為0.22∶1，c?myc mRNA表達量比例有統(tǒng)計學差異（P〈0.05）。經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組的凋亡指數(shù)分別為32.4%與65.4%，具有顯著性統(tǒng)計學差異（P〈0.01）。MTT檢測經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組的細胞增值率，分別為79.28%與38.32%，具有極其顯著性統(tǒng)計學差異（P〈0.001）。結論將靶向c?myc基因的siRNA片段轉染入大腸癌Lovo細胞，特異沉默c?myc基因，從而證實c?myc抑制大腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用，從而為大腸癌的基因治療尋求更多的治療靶點。

［關鍵詞］Survivin；hTERT；c?myc；大腸癌；Lovo細胞；轉染；凋亡

作者單位：1.惠州市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東，惠州516001
2.暨南大學廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣東，廣州510632

大腸癌是嚴重威脅人類生命健康的常見腫瘤之一，我國大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，盡管采用手術、放療、化療等綜合治療的方法，但是療效并不樂觀，而基因免疫治療有其獨特的優(yōu)勢。相關研究推測，c?myc、Survivin及hTERT等基因在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用［1］。c?myc癌基因屬核蛋白基因，具有轉化細胞的能力，并具有與染色體DNA結合的特性，在調節(jié)細胞生長、分化及惡性轉化中發(fā)揮作用?，F(xiàn)有研究證實，c?myc在大腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用［2］。研究提示Survivin可能參與c?myc激活，從而上調hTERT，而相關研究推測c?myc可能是Sur?vivin的上游調控基因，Survivin、hTERT、c?myc致大腸癌細胞凋亡的分子機制目前尚未完全闡明［3］。

現(xiàn)有研究證實，Survivin，hTERT，c?myc在大腸癌組織中均有陽性表達，并且三者的陽性表達呈正相關，提示原癌基因c?myc激活、Survivin表達上調及端粒酶活性的增強，可能在大腸癌發(fā)生機制中起協(xié)同作用［4-5］。本課題將靶向c?myc基因的siRNA片段轉染入大腸癌Lovo細胞，特異沉默c?myc基因，驗證c?myc抑制大腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用，并探討促使細胞凋亡的分子機制，從而為大腸癌的基因治療尋求更多的治療靶點?，F(xiàn)報告如下：

1　材料和方法

1.1研究對象

體外培養(yǎng)大腸癌Lovo細胞，細胞株由暨南大學廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室提供。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1主要試劑與耗材

RP?1640培養(yǎng)液（GBICO，美國）；新生牛血清（GBICO，美國）；轉染試劑Lipofectamine2000 （Invitrogen，美國）；miScriptReverseTranscriptionkit （QIAGEN，德國）；TRIzol（Invitrogen，美國）；胰酶（GBICO，美國）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；Zx蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司）；c?myc引物序列為：上游引物5′?TAT AGA CTC GAG CGG AGT CAT GGG?3′，下游引物5′?AAG TCA GGA AGG CAG TGA TCG CAA?3′生工生物工程（上海）股份有限公司，上海］；TaqMan探針：FAM?TTT TCG TCC GAC TCC CCG TAG GCC GTA TAC GGC?TEMRA（FAM、TEMRA為熒光素）；PCR試劑盒（ABI，美國）RNA上樣緩沖液（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）；RNA電泳液（Amresco，美國）；二甲基亞礬（Sigma，美國）；6孔、96孔細胞培養(yǎng)板（GBICO，美國）；l.5 mL、0.5 mL EP管；1 mL、0.2 mL、10 μ L移液槍頭（Eppendorf，德國）；0.2 μm，20×20 cm PVDF膜（Bio?Rad，美國）。

1.2.2主要儀器

VD650超凈工作臺（蘇州凈化工作臺設備有限公司），l mL、0.2 mL、10 μ L移液槍（Eppendorf，德國），CFX96 TouchReal?time PCR儀（Bio?Rad，美國），MCO?20AICCO2細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本），5804R低溫高速離心機（Eppendorf，德國），ECP3000電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），Multiskan FC酶標儀（Thermo，美國），IX71倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)

Lovo細胞株用含10%新生牛血清RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，傳代培養(yǎng)。

1.3.2構建siRNA片段并轉染入Lovo細胞

首先在GeneBank中查的c?myc基因的全序列，用siRNA設計軟件初篩6對GC比在40%～50%之間的siRNA，把所得序列挑選1條交生工生物工程（上海）股份有限公司，體外合成靶向c?myc基因的siRNA和1條陰性對照siRNA。序列如下：c?my c?siRNA正義鏈：5′?AACAGGCUUGGUCCACUGC?3′對照?siRNA正義鏈：5′?GGUAGCAUUGCU?AUGGGCG?3′采用Invintrogen公司介導的脂質體轉染技術轉染。轉染前24 h把Lovo細胞消化并接種適量于6孔板上1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后把siRNA和Lipofectamine2000以合適計量加入每孔細胞，混勻，37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，換用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，觀察效果。本實驗在暨南大學廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室進行。

1.3.3實時熒光定量PCR法（realtime?fluores?cence quantitative polymerase chain reaction，RT?PCR）檢測c?myc mRNA表達水平

依據(jù)PCR試劑盒說明書，按照說明書步驟操作進行，按照文獻［6］RT?PCR方法檢測。用Trizol試劑提取培養(yǎng)的轉染的細胞，提取未轉染的細胞作為對照組，提取總RNA，加入Trizol 1 mL，氯仿0.2 mL，離心取上清加入0.4 mL異丙醇，離心棄上清，70%乙醇沉淀，凝膠電泳儀測RNA濃度，分光光度計檢測純度［6］。未轉染的細胞與轉染的細胞分別設5個重復組，通過用PCR儀，制備cDNA，具體反應體系和時間為：10 μ L RNA，20 μ L反應液，37℃1 h，95℃3 min。RT?PCR實驗反應體系：5×緩沖液10 μL，上下游引物各1 μL，探針1 μL，核苷1 μL，Taq酶1 μL，cDNA 5 μL，三蒸水30 μL，總體積50 μL。反應時間為：93℃預變性5 min；93℃45 s，55℃1 min，40個循環(huán)；72℃5 min；4℃終止。

樣本中c?myc mRNA模板拷貝數(shù)。設定大于40個循環(huán)仍無熒光信號明顯增加的樣本，c?myc mRNA表達為陰性，數(shù)值以“0”計入統(tǒng)計資料。分析熔解曲線，確定陰陽性結果。

1.3.4細胞檢測方法

采用原位末端標記法（terminal deoxynucleo?tidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測腫瘤細胞凋亡情況以及噻唑藍法［3?（4，5?di?methyl?2?thiazolyl）?2，5?diphenyl?2?H?tetrazolium bromide，MTT］檢測細胞的增殖能力。

轉染培養(yǎng)的Lovo細胞消化后，TUNEL法檢測腫瘤細胞，按照廠家提供的TUNEL試劑盒說明完成操作，以未轉染細胞作為陰性對照，陰性對照以稀釋液代替酶溶液。凋亡細胞形態(tài)可見細胞完整，體積縮小，固縮成團，隨機選個視野，高倍鏡下計數(shù)凋亡細胞占腫瘤細胞的比例，即為凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

轉染培養(yǎng)的Lovo細胞消化后，加入20 μ L MTT，孵育30 min后加入二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）終止反應，酶標儀測定結果，以未轉染細胞作為陰性對照。本實驗在暨南大學廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室進行。

1.4統(tǒng)計學處理

運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計描述和分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間的比較采用student?t檢驗。若方差不齊，則組間比較采用秩和檢驗。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1轉染培養(yǎng)的Lovo細胞

如圖1所示，轉染培養(yǎng)的Lovo細胞在顯微鏡下顯示（×500），細胞生長狀況良好。

2.2c?myc mRNA表達水平

RT?PCR結果如下圖2所示。作為對照的未轉染的Lovo細胞，c?myc熔解曲線呈現(xiàn)S型擴增曲線，結果顯示為陽性，轉染的Lovo細胞c?myc結果為陰性。由各自的Ct值算出對照組2?ΔΔCt為1，轉染組為0.22（表1），顯示轉染組的c?mycmRNA的表達量是對照組的0.22倍，說明轉染組的c?myc表達量比未轉染的表達量顯著降低，結果指示靶向c?myc mRNA的siRNA片段基因干擾成功。

2.3轉染與未轉染Lovo細胞c?myc mRNA表達情況

經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組c?myc mRNA的2?ΔΔCt比值為0.22∶1，P=0.012，有統(tǒng)計學差異（P〈0.05），指示靶向c?myc mRNA的 siRNA片段構建并轉染成功。經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組的凋亡指數(shù)分別為32.4%與65.4%，轉染的細胞與未轉染的細胞凋亡指數(shù)相比，P=0.0 012，具有顯著性統(tǒng)計學差異（P〈0.01），指示靶向c?myc mRNA的siRNA片段基因干擾成功，c?myc基因具有誘導細胞凋亡的作用。MTT檢測經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組的細胞增值率，分別為79.28%與38.32%，轉染的細胞與未轉染的細胞增值率相比，P=0.0 009，具有極其顯著性統(tǒng)計學差異（P〈0.001），指示靶向c?myc mRNA的siRNA片段基因干擾成功，c?myc基因具有抑制細胞增殖的作用。轉染與未轉染Lovo細胞c?myc mRNA的拷貝數(shù)、凋亡指數(shù)、增值率都具有統(tǒng)計學意義（表1）。

表1　轉染與未轉染Lovo細胞c?myc mRNA表達情況Table 1 The expression statuses of c?myc mRNA in the transfection and non?transfection Lovo cells

3　討論

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命健康。隨著我國國民生活水平的改善，飲食結構的改變，大腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，我國大腸癌發(fā)病率位于惡性腫瘤的第3位，而病死率位于第5位［7］。近年來隨著吻合器的廣泛應用及各種新式化療藥物的出現(xiàn)，國際上很多學者建議采用在手術治療的基礎上輔助以化療、放療、同步放化療、生物治療和中醫(yī)藥治療等在內的一系列綜合治療手段，明顯地提高了大腸癌治療效果［8］。

c?myc基因目前是公認的癌基因，在多種惡性腫瘤中c?myc都呈高表達。有研究表明，c?myc和EGFR基因在鼻咽癌中不僅存在過度表達，而且有拷貝數(shù)增加，并認為8q24的c?myc基因是鼻咽癌中最初被激活的靶基因［9-10］。因此，特異性下調c?myc基因的過度表達在對抗鼻咽癌的過程中可能是一個潛在的治療性策略。Li等［11］研究發(fā)現(xiàn)大腸癌中c?myc表達明顯高于大腸腺瘤和正常組織。陶凱雄等［12］用葡聚糖磁性納米微粒作為基因載體，進行磁控靶向RNA干擾抑制大腸癌細胞癌基因c?myc表達的研究，牛朝霞等［13］用構建好的小干擾RNA載體，轉染細胞后研究抑制內源性原癌基因c?myc表達對鼻咽癌細胞5?8F的影響。本實驗使用的是siRNA直接轉染沉默c?myc基因，與之前的構載體的基因治療方法相比，有著強大的優(yōu)勢，微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上［14］。盡管注入細胞的siRNA的濃度遠低于體內同源mRNA的水平，卻足以產(chǎn)生強大的干擾效應［15］。siRNA干擾方法減少了傳統(tǒng)基因治療方法大劑量用藥帶來的毒副作用及免疫效應，為癌癥的治療帶來了新的希望［16］。本研究結果顯示，轉染與未轉染Lovo細胞c?myc mRNA 的2?ΔΔCt表達比值、凋亡指數(shù)、增值率都具有統(tǒng)計學意義。經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組c?mycmRNA表達量相比顯著降低，說明靶向c?myc mRNA的siRNA片段構建并轉染成功。經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組的凋亡指數(shù)相比顯著降低，說明靶向c?myc mRNA的siRNA片段基因干擾成功，并且驗證了c?myc基因的誘導細胞凋亡的作用。MTT檢測經(jīng)過轉染的Lovo細胞與未轉染的對照組的細胞增值率相比顯著升高，說明靶向c?myc mRNA的siRNA片段基因干擾成功，并且驗證了c?myc基因的抑制細胞增殖的作用。本研究特異沉默c?myc基因，從而證實c?myc具有抑制大腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用。通過基因沉默與干擾的方式，可以抑制大腸癌細胞的生長，從而為大腸癌的基因治療尋求更多的治療靶點。

21世紀以來，臨床多學科工作團隊（multidis?ciplinary team，MDT）逐漸成為國際上腫瘤治療的主流模式。MDT是建立在循證醫(yī)學基礎上的由多個相關學科、相對固定的專家組成工作組，針對某一器官或系統(tǒng)疾病，通過定期、定時、定址的會議形式，提出適合患者病情的最優(yōu)治療方案，繼而由相關學科單獨執(zhí)行或多學科聯(lián)合執(zhí)行治療方案，其不但能夠提供給患者個體化的治療，而且能夠更加高效地治療腫瘤患者［17］。日本國立癌癥中心，“Tumor Board”與MDT相似，由各相關學科醫(yī)生組成團隊，經(jīng)團隊討論后并由其提供治療方案，將基礎研究與腫瘤多學科治療聯(lián)系起來，并提升臨床研究質量，使大腸癌治療效果能夠更上一層樓［18］。臨床與科研與多學科的聯(lián)合治療，是未來治療腫瘤的主流模式，也是我們致力的方向。

目前相繼報道有小分子Aurora?A抑制劑，實驗發(fā)現(xiàn)它們具有抗腫瘤活性，Aurora?A有可能成為腫瘤治療的一個新靶點［19］。本研究特將靶向c?myc基因的siRNA片段轉染入大腸癌Lovo細胞，特異沉默c?myc基因，從而證實c?myc抑制大腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用，從而為大腸癌的基因治療尋求更多的治療靶點。c?myc、Survivin及hTERT等基因在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用作用機制本實驗室仍然在研究，在未來的研究中，我們會注重協(xié)同作用機制方面的內容的研究，爭取在大腸癌的基因治療征程上尋求更多的治療靶點。

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論著

論著

The effect of the interference on the siRNA with targeted c?myc gene on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer Lovo cell

LIU Jihong1，JIANG Nannan1，ZHANG Like1，DENG Ning2
（1. Clinical Laboratory，the First People's Hospital of Huizhou City，Huizhou，Guangdong，China，516001；
2.Guangdong Key Laboratories on Molecular Immune Antibody Engineering，Jinan University，Guangzhou，Guangdong，China，510632）

［ABSTRACT］Objective To study the effects that interference of the siRNA with targeted c?myc gene has on the proliferation and apoptosis of colorectal cancer Lovo cell. Methods The siRNA clips with targeted c?myc gene was transfected into the colorectal cancer Lovo cells, then the specific c?myc gene was specifically silenced. The c?myc mRNA expression level was detected using realtime?fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT?PCR), and the apoptosis of the tumor cell was detected through the terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) method, while the proliferation of the tumor cell was detected through the 3?(4, 5?dimethyl?2?thiazolyl)?2, 5?diphenyl?2?H?tetrazolium bromide (MTT) method. Results The rate of the expression of the c?myc mRNA of the transfected Lovo cell group and non?transfected group was 0.22:1, which was statistically significant (P〈0.05). The indices of apoptosis of the transfected Lovo cell group and non?transfected group were 32.4% and 65.4%, respectively, which was also statistically significan (P〈0.01). The rates of the cell proliferation detected by MTT of the transfected Lovo cellbook=2,ebook=44group and non?transfected group were 79.28% and 38.32%, respectively, which was extremely statistically significant (P〈0.001). Conclusion After being targeted with the siRNA, and transfected into the colorectal cancer Lovo cells and silenced specifically, the c?myc gene inhibits the proliferation and induces the apoptosis of colorectal cancer cells, and could provide more therapeutic targets for gene therapy of colorectal cancer.

［KEY WORDS］Survivin；hTERT；c?myc；Colorectal cancer；Lovo cells；Transfection；Apoptosis

基金項目：惠州市2012年科技計劃（2012Y056）

通訊作者：劉集鴻，E?mail：liujihong251@163.com