王　威　劉文博　唐　偉　遲海濤（.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連6000；.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院，遼寧大連6000）

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黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織PS-1蛋白表達(dá)的影響*

王威1劉文博1唐偉2△遲海濤2
（1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連116000；2.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院，遼寧大連116000）

【摘要】目的通過觀察黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織早老素-1（PS-1）蛋白表達(dá)的影響，以評價(jià)黃精的抗衰老作用及其機(jī)制。方法雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃精多糖組、尼莫地平組，每組6只。采用二血管閉塞（2VO）建立慢性腦缺血大鼠模型，給予0.9%氯化鈉注射液、黃精多糖、尼莫地平灌胃8周。Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；尼氏染色檢測海馬神經(jīng)元損傷；免疫組織化學(xué)法測定前額皮質(zhì)和海馬區(qū)PS-1蛋白表達(dá)。結(jié)果1）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：黃精多糖組較模型組平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿臺次數(shù)增多（P＜0.05），黃精多糖組和尼莫地平組之間無顯著差異（P＞0.05）。2）尼氏染色檢測：模型組前額皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)尼氏體陽性神經(jīng)元明顯減少，染色較淺，黃精多糖組較模型組尼氏體陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，與尼莫地平組比較無顯著性差異（P＞0.05）。3）免疫組化檢測：黃精多糖組較模型組大鼠前額皮層、海馬區(qū)PS-1的蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），黃精多糖組與尼莫地平組比較無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論黃精多糖能改善慢性腦缺血大鼠的一般行為學(xué)評價(jià)及組織學(xué)變化，減輕細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，降低慢性腦缺血大鼠前額皮質(zhì)和海馬區(qū)PS-1的蛋白表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】慢性腦缺血學(xué)習(xí)記憶黃精多糖PS-1蛋白

黃精多糖是黃精根莖提取的具有多種生物活性的植物多糖，有研究表明黃精多糖可顯著改善阿爾茨海默?。ˋD）模型小鼠的記憶功能，減輕突觸變性，增加突觸數(shù)量［1］。近年來基礎(chǔ)和臨床研究均表明慢性腦缺血與AD發(fā)病密切相關(guān)的，而β-淀粉樣蛋白（Aβ）過多聚集是AD主要病理特征［2］。早老素-1（PS-1）基因作為產(chǎn)生Aβ的關(guān)鍵復(fù)合酶γ分泌酶的核心成分，其突變被認(rèn)為與70%～85%的家族性AD發(fā)病有關(guān)［3］。本研究探討黃精多糖對慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織PS-1蛋白表達(dá)的影響，闡述黃精抗衰老作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1試劑黃精多糖由中國藥科大學(xué)藥理研究室提供（每1 mL相當(dāng)于黃精生藥10g），急性毒理試驗(yàn)黃精多糖對大鼠灌胃給藥的LD50為75 mL/kg（相當(dāng)于含生藥750mg/kg），治療劑量無毒副不良反應(yīng)。尼莫地平由拜爾公司提供（批號20140607）。

1.2分組與造模雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量400～450g，SPF級，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，每組6只。采用二血管閉塞法（2VO）建立慢性腦缺血大鼠模型，大鼠以水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉固定在鼠板上，頸正中縱行切開皮膚，找到雙側(cè)頸總動脈，絲線行永久性結(jié)扎，縫合皮膚。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外其他處理同模型組。

1.3給藥方法假手術(shù)組、模型組灌胃0.5mL 0.9%氯化鈉注射液；黃精多糖組將黃精多糖2mL/（kg·d）溶于0.5 mL 0.9%氯化鈉注射液后灌胃；尼莫地平組按10mg/kg（每200mg尼莫地平溶于100mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，配制成0.2%懸濁液）灌胃。造模術(shù)后24 h開始灌胃給藥，每日1次，每8周時(shí)進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.4神經(jīng)行為學(xué)測定Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測定，水迷宮實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)階段，分別為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。1）定位航行實(shí)驗(yàn)：檢測大鼠的學(xué)習(xí)能力，分析逃避潛伏期。2）空間探索實(shí)驗(yàn)：檢測大鼠的記憶能力，觀察60s內(nèi)大鼠的運(yùn)動軌跡和穿越原有平臺位置的次數(shù)。

1.5標(biāo)本采集及檢測神經(jīng)行為學(xué)測定后，各組小鼠用4%水合氯醛以10mL/kg的劑量腹腔注射麻醉后開胸，充分暴露心臟4%多聚甲醛灌流，直至大鼠四肢及尾部僵硬為灌流固定充分，取出腦組織放置于4%多聚甲醛中固定。

1.5.1尼氏染色檢測前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷常規(guī)石蠟包埋，切片厚約5 μm，直接貼于載玻片上。在焦油固紫工作液中染色15～30min，蒸餾水洗去浮色后，乙醇中脫色（共約10s左右），鏡下觀察到清晰的藍(lán)紫色尼氏顆粒即可。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5.2免疫組化法檢測前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達(dá)常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每片厚約5 μm行免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)石蠟脫水，滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)。滴加5%BSA封閉液。滴加稀釋的一抗（PS-1按1∶75稀釋），4℃過夜，二抗孵育，37℃20min（二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG），滴加試劑SABC，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Leiea圖像采集系統(tǒng)顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)上，測定陽性細(xì)胞數(shù)：每組每只大鼠雙側(cè)大腦皮層、海馬CA1區(qū)各5個(gè)高倍視野（10×10）視野下免疫組化、尼氏體陽性細(xì)胞密度（個(gè)/mm2）。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。多樣本均數(shù)比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組神經(jīng)行為學(xué)檢測結(jié)果見表1。通過連續(xù)的訓(xùn)練，黃精多糖組、尼莫地平組較模型組平均逃避潛伏期縮短（P＜0.05），穿臺次數(shù)增多（P＜0.05）。黃精多糖組、藥物對照組兩組間平均逃避潛伏期、穿臺次數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

表1　各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1　各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05。下同。

組　別　n　平均逃避潛伏期（s）　穿臺次數(shù)（次/60s）假手術(shù)組6.　18.34±6.18*　7.13±2.6*模型組6.　34.23±10.78　3.74±0.79黃精多糖組6.　19.55±4.03*　6.41±2.00*尼莫地平組6.　20.76±6.96*　6.87±2.46*

2.2前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色結(jié)果見表2。圖像分析顯示，前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色模型組染色較淺，有明顯的神經(jīng)元丟失，細(xì)胞形態(tài)破壞，排列紊亂。黃精多糖組尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)均較模型組顯著增加，而黃精多糖組、尼莫地平組兩組間無顯著差異（P＞0.05）。

表2　各組前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2　各組前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別　n　前額皮質(zhì)　海馬CA1區(qū)假手術(shù)組6.　32.96±106.74*　42.54±13.68*模型組6.　15.98±6.87　12.88±5.47黃精多糖組6.　28.89±10.34*　37.54±10.78*尼莫地平組6.　34.34±304.78*　29.37±7.70*

2.3前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達(dá)見表3。免疫組化前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白陽性細(xì)胞著色部位在胞漿，細(xì)胞突起和神經(jīng)纖維著色，PS-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)黃精多糖組較模型組明顯減少（P＜0.05），而黃精多糖組、尼莫地平組間無顯著差異（P＞0.05）。

表3　各組前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表3　各組前額皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)PS-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

組別　n　前額皮質(zhì)　海馬CA1區(qū)假手術(shù)組6.　16.46±4.91*　17.97±7.84*模型組6.　44.98±12.36　45.17±13.46黃精多糖組6.　16.31±6.99*　18.57±7.64*尼莫地平組6.　17.88±9.11*　16.43±7.20*

3　討　論

有研究表明黃精多糖具有良好的降血糖［4］、調(diào)血脂［5］、抗炎［6］作用。對老齡大鼠具有提高學(xué)習(xí)、記憶能力［7］。黃精多糖還可以減少腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡［8］，而對慢性腦缺血研究較少。本實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中，黃精多糖組、尼莫地平組較模型組平均逃避潛伏期延長，穿臺次數(shù)增多。黃精多糖組、尼莫地平組組間平均逃避潛伏期、穿臺次數(shù)無顯著差異，表明慢性腦缺血可引起動物的學(xué)習(xí)記憶障礙，黃精多糖組可明顯改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

皮層和海馬神經(jīng)元變性是慢性腦缺血的組織學(xué)改變之一。本研究顯示大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎2個(gè)月后，模型組光鏡觀察發(fā)現(xiàn)海馬CAl區(qū)神經(jīng)元大量變性、死亡，數(shù)目減少，海馬組織結(jié)構(gòu)紊亂，錐體細(xì)胞形態(tài)異常。黃精多糖組皮層、海馬CA1區(qū)尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)均較模型組顯著增加，說明黃精多糖可減少尼氏體的丟失，減輕海馬神經(jīng)元的損傷和破壞，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。

近年來研究表明慢性腦缺血所致癡呆與Aβ的神經(jīng)毒性作用關(guān)系密切，慢性腦缺血模型大鼠有認(rèn)知功能障礙，并在老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)中發(fā)現(xiàn)了大量Aβ，說明了Aβ和慢性腦缺血密切相關(guān)［9］。PS-1是產(chǎn)生Aβ生成的關(guān)鍵復(fù)合酶γ分泌酶的核心成分，是酶復(fù)合物的活性中心，它首先被一種未知的水解酶切割為相對分子質(zhì)量為18 kd的羧基片段（CTF）和28 k氨基片段（NTF），再與其他蛋白質(zhì)一起形成Y分泌酶多聚體，其表達(dá)的水平不同導(dǎo)致了Aβ生成的差異［10］。免疫組化PS-1蛋白表達(dá)陽性著色部位在胞漿，細(xì)胞突起和神經(jīng)纖維著色，假手術(shù)組顯示皮層、海馬CA1區(qū)有少量PS-1表達(dá)，模型組皮層、海馬CA1區(qū)PS-1表達(dá)增加，與假手術(shù)組相比，陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.01）。黃精多糖組皮層、海馬CA1區(qū)PS-1表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均較模型組顯著減少，說明黃精多糖可抑制慢性腦缺血致PS-1異常升高。

本研究結(jié)果表明黃精多糖可改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶，減輕神經(jīng)元損傷，同時(shí)抑制了PS-1的表達(dá)上調(diào)，已知PS-1作為γ分泌酶核心成分是產(chǎn)生Aβ的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此推測黃精多糖可能是通過抑制PS-1而降低了Aβ的生成，提示黃精多糖可能在AD防治中有一定作用。

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中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）03-0408-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.011

*基金項(xiàng)目：遼寧省博士啟動基金項(xiàng)目（20111124）

通信作者△（電子郵箱：1191447970＠qq.com）【Abstract】Objective：To evaluate the anti-aging effect of polygona-polysaccharose and its mechanism by observing the effects of Polygona-polysaccharose on learning and memory and PS-1 protein expression of rats with chronic cerebral hypoperfusion.Methods：24 male SD rats were randomly divided into 4 groups：sham operated group，the model group，Polygona-polysaccharose group，the control group，6rats in each.2VO was adopted to establish the rat model of chronic cerebral hypoperfusion，given lavage of 0.9%sodium chloride injection，Polygonapolysaccharose and nimodipine for 8 weeks.The ability of learning and memory was measured with Morris water maze test；hippocampal neuronal damage was detected with the method of Nylon staining；the expression of PS-1 in prefrontal cortex and hippocampus was determined by immunohistochemistry.Results：1）The experimental result of Morris water maze showed that compared with the model group，average escape latency of polygona -polysaccharose group was shortened（P＜0.05），and the times of drill increased（P＜0.05）.There was no significant difference between polygona-polysaccharose group and the control group（P＞0.05）.2）Nylon staining showed that in the model group，the positive neurons significantly decreased and the staining was light in prefrontal cortex and hippocampal neurons，while the polygona-polysaccharose group was opposite，and compared with the control group，there was no significant difference（P＞0.05）.3）Immunohistochemical detection showed that compared with the model group，PS-1 protein expression in prefrontal cortex and hippocampus of rat reduced in polygonapolysaccharose group（P＜0.05）.There was no significant difference between polygona-polysaccharose group and the control group（P＞0.05）.Conclusion：Polygona-polysaccharose can improve the general behavioral assessment and histological changes，decrease cell structure disorder，and reduce PS-1 protein expression in prefrontalcortex and hippocampus of rats with chronic cerebral hypoperfusion.

收稿日期（2015-10-27）

The Effects of Polygona-polysaccharose on Learning and Memory and PS-1 Protein Expression of Rats with Chronic Cerebral Hypoperfusion

WANG Wei，LIU Wenbo，TANG Wei，et al.
Zhongshan Hospital Af-filiated to Dalian University，Liaoning，Dalian116000，China.

【Key words】Chronic cerebral hypoperfusion；Learning and memory；Polygona-polysaccharose；PS-1 protein