劉婷婷，王濤，楊翼，王澤建，莊英萍,2，儲炬,2，郭美錦,2 華東理工大學(xué)　生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上?！?00272 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上?！?0027 上海紐邁電子科技有限公司，上?！?0027

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低場核磁共振技術(shù)快速檢測小球藻油脂含量及其在高通量選育中的應(yīng)用

劉婷婷1，王濤1，楊翼3，王澤建1，莊英萍1,2，儲炬1,2，郭美錦1,2
1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237
2 上海生物制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200237
3 上海紐邁電子科技有限公司，上海200237

劉婷婷, 王濤, 楊翼, 等. 低場核磁共振技術(shù)快速檢測小球藻油脂含量及其在高通量選育中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(3): 385–396.

Liu TT, Wang T, Yang Y, et al. Low field nuclear magnetic resonance for rapid quantitation of microalgae lipid and its application in high throughput screening. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 385–396.

摘 要:為了建立一個高效的高產(chǎn)油微藻誘變育種流程，微藻中油脂含量快速和準(zhǔn)確的測定在其中具有重要作用。在本研究中，首先利用低場核磁共振技術(shù)，建立了直接檢測干藻粉和培養(yǎng)液中小球藻油脂含量的方法，其信號強度與細(xì)胞中油脂含量存在特異的線性關(guān)系，干藻粉和藻液中油脂含量與信號值擬合的R2均高于0.99，說明該方法用于小球藻油脂含量的檢測是準(zhǔn)確和可行的。同時該方法與傳統(tǒng)油脂測量方法相比，具有快速、簡便和準(zhǔn)確等優(yōu)點。但其通量不及尼羅紅染色法，因此，我們開發(fā)了將尼羅紅染色法用于初篩，低場核磁共振技術(shù)用于復(fù)篩的新型高通量藻種復(fù)合篩選方法，并將此篩選方法應(yīng)用于一種異養(yǎng)高產(chǎn)油原殼小球藻的誘變育種過程中。首先從3 098株誘變藻種中初篩得到108株具有較高油脂含量的藻株，然后利用低場核磁共振技術(shù)復(fù)篩得到9株高產(chǎn)油性能的藻株，其中一株甘油三酯含量超過20%，比原始藻株提高1倍，培養(yǎng)168 h后培養(yǎng)液油脂濃度達(dá)到5 g/L，證明此誘變育種流程不僅提高了篩選的效率還可靠且可行。

關(guān)鍵詞:低場核磁共振，誘變育種流程，微藻，油脂檢測

Received: November 18, 2015; Accepted: January 6, 2016

Supported by: National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2011CB200900).

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB200900) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160126.0932.001.html

當(dāng)今主要利用的石油資源是不可再生的，且會對環(huán)境造成污染，產(chǎn)生溫室效應(yīng)[1]。生物柴油 (Biodiesel) 是比較理想的可再生能源，其利用生物的光合作用進(jìn)行合成，是一種新型碳中性的能源。利用微藻進(jìn)行生物柴油原材料的開發(fā)和利用近年來受到全球廣泛的關(guān)注，相較于傳統(tǒng)農(nóng)作物而言，微藻具有明顯優(yōu)勢，如單位細(xì)胞油脂含量高、不僅能固定二氧化碳，同時還能吸收廢水中的氮和磷等。因此，利用微藻生產(chǎn)生物柴油在未來是非常具有潛力的對象[2-3]。

但是，目前微藻作為生物柴油的原料成本仍然較高，是阻礙生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)的最大因素之一。為了降低成本，采用微生物育種以期待獲得具有更高油脂含量以及更好生長性能的小球藻藻種是比較可靠的方法之一[4]。由于通過基因改造改良藻種受到單細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展緩慢，高效的誘變育種方法成為小球藻育種的最佳選擇[5]，Ota和馬玉濱等用重離子誘變技術(shù)選育到高產(chǎn)油脂擬微球藻與小球藻[6-7]。

在優(yōu)良藻種獲得中，高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)是傳統(tǒng)篩選技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的快速和高效的篩選方法，但油脂 (Lipid) 的快速檢測是影響藻種進(jìn)行高通量篩選的重要限制因素，因此尋找一種簡單、快速、準(zhǔn)確的油脂測定方法，不僅能夠提高篩選的效率，同時能夠?qū)?yōu)良藻種的培養(yǎng)研究過程中油脂含量的變化進(jìn)行實時監(jiān)控，從而用于對藻種生產(chǎn)性能的評估和培養(yǎng)過程的優(yōu)化。

微藻總脂含量的測定方法有傳統(tǒng)的有機溶劑提取法、索氏提取法、熒光染料測定法、傅里葉變換紅外光譜法、磷酸香草醛法、銅試劑法、蘇丹黑染色法和核磁共振法等[8]。近來，基于低場核磁共振原理的油脂檢測技術(shù)受到廣泛的關(guān)注，低場核磁共振雖然分辨率不及高場核磁共振，不能得到精細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息，但能得到分子之間的相互作用引起的信號變化[9]，憑借成本低廉、快速、簡便等優(yōu)勢，在石油[10]、礦石[11]、食品加工和分析[12]、廢物原料的分析[13]和制藥工業(yè)等許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，但在微藻油脂檢測中的應(yīng)用還甚少。

低場核磁共振測量油脂是基于氫質(zhì)子在不同物質(zhì)中弛豫時間的差異而實現(xiàn)的[14]，蛋白和碳水化合物中氫核的弛豫時間很短，能夠與油脂明顯區(qū)分開。而自由水和油脂中的弛豫時間接近，但通過添加一些順磁性離子 (例如錳離子)能夠大大加快自由水中氫核的弛豫，因此可以去除水對油脂信號的干擾[15-16]。

以上這些油脂檢測方法各有優(yōu)缺點，不論在藻種的篩選還是過程培養(yǎng)中，不能依賴單一的方法來滿足油脂檢測的需求[17]。因此，本文提出了1種基于尼羅紅染色初篩和低場核磁共振復(fù)篩的新型誘變育種方法，并建立了高效的藻種育種流程，獲得高產(chǎn)油的藻株。

表1　培養(yǎng)基成分Table 1 Medium component

1　材料與方法

1.1藻種和培養(yǎng)方法

原殼小球藻Chlorella protothecoides IOCAS038F由中國科學(xué)院青島海洋所劉建國教授贈送。

所用的培養(yǎng)基為經(jīng)過優(yōu)化后的異養(yǎng)培養(yǎng)基，成分如表1所示，配好后調(diào)pH至8.0。在初篩和復(fù)篩中，依次在孔板、搖瓶和5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行。平板篩選所用的培養(yǎng)基是在上述培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂，待其冷卻凝固后涂布藻細(xì)胞，置于30 ℃培養(yǎng)?？装迮囵B(yǎng)先在無菌的48孔板中每個孔中添加2.4 mL滅菌培養(yǎng)基，接種之后于30 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)在500 mL的搖瓶中進(jìn)行，其裝液量為200 mL，接入10% (V/V) 的種子，于30 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)。反應(yīng)器培養(yǎng)在實驗室5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行 (上海國強生化工程技術(shù)有限公司，上海)，反應(yīng)器的裝液量為3 L，并加入0.1%的消泡劑，滅菌后接入10%的搖瓶種子，通氣量 1.8 L/min，在30 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)過程中通過逐步提高轉(zhuǎn)速使得溶氧水平 (DO) 維持在20%飽和濃度以上，全程用2 mol/L HCl溶液將pH自動調(diào)控為7.0。

1.2原殼小球藻誘變方法

紫外 (UV) 誘變：取處于對數(shù)生長期的原殼小球藻培養(yǎng)液10 mL于培養(yǎng)皿中，在15 W的紫外燈下距離40 cm分別照射一定時間，稀釋后均勻涂布于平板上培養(yǎng)7 d。LiCl誘變：取一定量LiCl母液加入處于對數(shù)生長期的原殼小球藻培養(yǎng)液中混勻，30 min后稀釋以終止誘變，再稀釋適當(dāng)倍數(shù)涂布于平板上培養(yǎng)7 d。UV-LiCl聯(lián)合誘變：根據(jù)原殼小球藻UV誘變和LiCl誘變的致死曲線得到各自的最佳處理條件進(jìn)行處理，稀釋后均勻涂布于平板上培養(yǎng)7 d。LV (LiCl-UV) 誘變：將原殼小球藻按照適當(dāng)?shù)臈l件先進(jìn)行LiCl誘變，再進(jìn)行UV誘變，涂平板得到單藻落；VL (UV-LiCl) 誘變：將原殼小球藻進(jìn)行UV誘變再用適當(dāng)濃度的LiCl處理，涂平板得到單藻落；LVL (LiCl-UV-LiCl) 誘變：將原殼小球藻依次進(jìn)行LiCl誘變、UV誘變和LiCl誘變，涂平板得到單藻落。常壓室溫等離子體 (Atmospheric and room temperature plasma, ARTP) 誘變：取處于對數(shù)生長期的原殼小球藻藻液于裝有無菌玻璃珠的瓶中振蕩數(shù)次，然后取10 μL于載片上，載片置于ARTP誘變儀(ARTP-II，無錫思清源生物科技有限公司) 誘變一定時間后，用1 mL無菌水洗下載片上的藻液，均勻涂布于平板上培養(yǎng)7 d。

為了增加誘變后平板上長出的單藻落的正突變率，選用了奧利司他作為誘變后的篩選壓力，以便提高篩選效率。即待平板培養(yǎng)的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50–70 ℃后，添加一定量奧利司他，再按照平板培養(yǎng)的方法培養(yǎng)。將誘變后的小球藻平板培養(yǎng)至長出單藻落后，挑單藻落至48孔板進(jìn)行孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后初篩，然后復(fù)篩，最后將篩選出的藻株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗證。藻株搖瓶培養(yǎng)5 d為第一代，以10%接種量接種后搖瓶培養(yǎng)5 d即為第二代，以此類推，一共傳6代即可。取10 mL每1代藻株培養(yǎng)8 d的藻液用低場核磁共振儀檢測，油脂含量相同或者相近即為遺傳穩(wěn)定性較好。

1.3檢測方法

小球藻生物量用細(xì)胞干重 (Dry cell weight, DCW) 進(jìn)行表示，取40 mL對應(yīng)發(fā)酵液，6 000 r/min離心5 min，棄上清后洗滌2次，離心，80 ℃烘干后稱其干重，計算得到DCW。

油脂檢測分別采用尼羅紅染色、索氏提取和GC-MS，以及低場核磁共振方法。尼羅紅染色是先取100 μL培養(yǎng)好的原殼小球藻于黑色酶標(biāo)板中，加100 μL 30 mg/L的尼羅紅二甲基亞砜溶液，混勻1 min，染色20 min，用熒光酶標(biāo)儀 (BioTek SYNERGY H1) 測定激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm的熒光強度[18]。索氏提取法檢測含油量步驟是先將樣品于80 ℃烘干至恒重，然后用研缽研磨成細(xì)粉，再準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的藻粉，將其置于脫脂濾筒中放于索氏提取儀器中，連接好儀器后由冷凝管上方加入1∶2的氯仿和甲醇混合液，于55 ℃水浴加熱12 h后取下燒瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后置于烘箱烘干，記錄其重量并計算含油率[19]。GC-MS檢測含油量的步驟是先將原殼小球藻藻液離心洗滌后烘干，再將干燥的藻體研磨成均一的細(xì)粉。精確稱取0.02–0.1 g研磨后的藻粉，在稱量好的藻粉中加1 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液后置于70 ℃中水浴30 min，冷卻后加入1 mL 0.3 mol/L H2SO4-CH3OH溶液和0.5 mL 14%的BF3-CH3OH溶液 (Sigma-Aldrich, USA)，再次置于70 ℃中水浴30 min，冷卻后加入2 mL正己烷反復(fù)振蕩多次，靜置10 min，然后加水至10 mL，3 000 r/min離心5 min。最后將正己烷層用0.2 μm油性過濾頭過濾后與400 mg/L 十九烷酸甲酯按照1∶1 (V/V) 的比例混勻，將混勻的樣品用GC-MS儀器 (安捷倫 7 890C GC系統(tǒng)和5 975C inert MSD，美國) 檢測，在分析軟件上計算得到各脂肪酸組分的濃度和各組分的百分比。

低場核磁共振 (Low field nuclear magnetic resonance, LF-NMR) 技術(shù)檢測方法為將一定體積或一定質(zhì)量的原殼小球藻抽提藻油或三油酸甘油酯 (Sigma-Aldrich，美國) 標(biāo)準(zhǔn)液置于玻璃小瓶中，用PQ001型LF-NMR核磁共振分析儀(PQ001-010，上海紐邁電子科技有限公司) 檢測其響應(yīng)值。在直接測定含游離水的油脂樣品中(小球藻培養(yǎng)液或含水樣)，則添加15% MnCl2以排除水信號對油脂信號的干擾。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

致死率計算是先按照稀釋涂布法統(tǒng)計各個樣本的藻落數(shù)，然后根據(jù)處理后藻落數(shù)與總藻落數(shù)計算致死率。

致死率= (未處理藻落數(shù)–相應(yīng)條件處理后藻落數(shù))/未處理藻落數(shù)×100%。正突變率計算中尼羅紅染色法測得的熒光強度高于原始藻株的熒光強度20%的藻株為正突變藻株。

正突變率=正突變藻株數(shù)/所檢測的藻株數(shù)×100%。所有實驗數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實驗結(jié)果的平均值。

2　結(jié)果與討論

2.1低場核磁共振技術(shù)快速檢測小球藻油脂方法的建立

2.1.1三油酸甘油酯標(biāo)液 (TAG) 和干藻粉中油脂量 (GC-MS測得) 與LF-NMR響應(yīng)值的關(guān)系

為了考察低場核磁共振技術(shù)在檢測原殼小球藻油脂中的可行性和適用性，首先考察了標(biāo)準(zhǔn)品三油酸甘油酯及2種形式細(xì)胞中油脂量(用GC-MS測得) 與低場核磁信號響應(yīng)值之間的關(guān)系，結(jié)果見圖1。從圖1中可看出，不管是三油酸甘油酯、抽提藻油和存在于干藻粉中的油脂與低場核磁信號之間都呈良好的線性關(guān)系，特別是TAG標(biāo)液與響應(yīng)值線性擬合R2大于0.999 9，表明低場核磁共振技術(shù)對TAG的定量具有非常高的準(zhǔn)確性。同時，比較分析圖1中A、B和C可發(fā)現(xiàn)，三者線性擬合的斜率是不同的，這是因為不同樣品中的油脂含量差異造成的，抽提藻油由于含有蛋白、色素等雜質(zhì)油脂含量低于標(biāo)品，而藻粉油脂含量僅為13.47%，所以其信號響應(yīng)強度均小于標(biāo)品三油酸甘油酯。因此，結(jié)果表明低場核磁信號與原殼小球藻中的油脂量是專一性的正比關(guān)系，能夠用于原殼小球藻油脂量的測量。

另外，從圖1D中可看出，不同含油率干藻粉質(zhì)量相同的情況下，低場核磁信號值與GC-MS所測得的含油量也呈很好的線性關(guān)系，經(jīng)過線性擬合，得到公式(1)：

式中x為核磁信號，y為用GC-MS測得的細(xì)胞內(nèi)油脂含量。

這也驗證了低場核磁共振技術(shù)用于直接測定藻粉中油脂含量的可行性，用于微藻中油脂含量快速和直接的測定。

圖1　不同類型油脂與低場核磁信號之間的關(guān)系Fig. 1 The linear relationship between LF-NMR signal intensities and the lipids quantity or lipid contents. (A) Glycerol trioleate. (B) Extracted algal lipids by Soxhlet method from C. protothecoides. (C) Dry microalgae cells. (D) The calibration curve of LF-NMR signal intensity with algal lipid content (GC-MS determination) in dry cells.

2.1.2培養(yǎng)液中小球藻用GC-MS測得含油量與LF-NMR響應(yīng)值之間的關(guān)系

快速檢測無論在藻種篩選和過程控制中都具有重要的作用。為了實現(xiàn)低場核磁共振技術(shù)能夠直接檢測藻培養(yǎng)液中的油脂含量，考察了不同原殼小球藻培養(yǎng)液 (體積均為10 mL) 用GC-MS測得的油脂濃度與用低場核磁共振技術(shù)測得的響應(yīng)值的關(guān)系，結(jié)果表明不同原殼小球藻培養(yǎng)液的含油量與響應(yīng)值呈線性關(guān)系 (圖2)。經(jīng)過線性擬合，得到公式(2)：

式中x為核磁信號，y為用GC-MS測得細(xì)胞中總油脂量后計算所得的油脂濃度。

由此可知，利用低場核磁共振技術(shù)不僅可直接檢測干藻粉中的油脂含量，還可以直接測定培養(yǎng)液中的油脂濃度，在獲得細(xì)胞濃度后還可計算得到細(xì)胞含油率。

2.1.3低場核磁共振技術(shù)與現(xiàn)有小球藻含油量定量方法比較

目前，小球藻油脂含量分析的方法主要包括稱重法、染色法、核磁共振法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等。為了從現(xiàn)有的小球藻含油量檢測方法中選出適合于小球藻誘變后篩選的方法，對GC-MS、索氏提取、尼羅紅染色常用微藻油脂定量方法與低場核磁定量方法進(jìn)行比較。對比的數(shù)據(jù)來自于相關(guān)參考文獻(xiàn)[8,10,18]以及本文的實驗結(jié)果，對比結(jié)果見表2。從表2中可以看出低場核磁共振技術(shù)操作最簡單、耗時最短且準(zhǔn)確性高，可以用于小球藻誘變篩選流程中的復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗證，尼羅紅染色可以快速檢測多個樣品，適用于高通量篩選，可以用于初篩。因此，小球藻誘變流程中的初篩選擇尼羅紅染色法，復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性驗證則采用低場核磁共振技術(shù)。

圖2　不同原殼小球藻培養(yǎng)液細(xì)胞油脂利用低場核磁直接測定結(jié)果 (油脂含量都是用GC-MC法測得)Fig. 2 The calibration curve of LF-NMR signal intensity with lipid concentration in algal broth. All the lipid contents were quantified by GC-MS method.

表2　低場核磁和傳統(tǒng)油脂測定方法的比較Table 2 Comparison of lipid determination between conventional determination methods and LF-NMR method

2.2低場核磁共振快速檢測技術(shù)在小球藻誘變育種過程中的應(yīng)用

2.2.1不同誘變方法的致死曲線

為了確定各誘變方法適當(dāng)?shù)恼T變劑量，繪制了原殼小球藻UV誘變、LiCl誘變和ARTP誘變的致死曲線，結(jié)果見圖3。由于出發(fā)藻種是野生藻種，沒有經(jīng)過誘變處理，適合選擇致死率較高的條件進(jìn)行誘變[20]。在UV誘變致死曲線中，原殼小球藻致死率隨處理時間增加而增加，在處理6 min后致死率達(dá)到了95%以上，因此，原殼小球藻UV誘變的劑量為UV照射6 min。在LiCl致死曲線中，原殼小球藻致死率隨LiCl濃度的增加而增加，當(dāng)LiCl濃度達(dá)到9 g/L后致死率基本不再變化，達(dá)到70%左右，因此，選擇LiCl誘變的劑量為9 g/L。在ARTP致死曲線與UV致死曲線類似，在25 s以后原殼小球藻的致死率達(dá)到了95%，因此，ARTP誘變中選擇25 s為處理時間。

圖3　不同誘變方法的致死曲線Fig. 3 Lethal percentages of C. protothecoides cells treated by different mutation methods. (A) UV radiation. (B) LiCl. (C) ARTP.

2.2.2原殼小球藻的誘變育種及初篩

由于單獨誘變效果不能滿足篩選要求，特別是所選的誘變方法中LiCl本身并無直接誘變作用，但是與其他誘變劑聯(lián)用能產(chǎn)生很好的協(xié)同作用[21]，因此對不同的復(fù)合誘變策略進(jìn)行考察。同時，奧利司他是一種脂肪酸合成酶抑制劑，可以抑制脂肪酸的合成[22]，將其作為選擇壓力，提高篩選的正突變率。首先對奧利司他的篩選效果進(jìn)行考察 (圖4A)，顯然，奧利司他在篩選過程中發(fā)揮了作用，提高了篩選的正突變率。此后將小球藻細(xì)胞用5種不同誘變方法處理后在添加20 μg/mL奧利司他的平板培養(yǎng)，然后從平板中共挑取3 098個單藻落至48孔板培養(yǎng)后用尼羅紅染色法對其進(jìn)行初篩，計算得到各自的正突變率 (圖4B)，從圖中可以看出ARTP、LVL和UV的正突變率在30%以上，明顯高于LV和VL。相較于LVL和UV而言，ARTP不僅正突稍高，而且操作更加簡單、快捷，所以選取ARTP作為藻種誘變篩選流程中的誘變方法。

2.2.3基于低場核磁的高產(chǎn)油藻株復(fù)篩

正如2.1中結(jié)果，低場核磁能夠快速和準(zhǔn)確地定量分析微藻中的油脂含量，因此將其利用到高油脂藻細(xì)胞的篩選中。由于其篩選通量不及尼羅紅染色高，所以應(yīng)用到以上誘變藻種的復(fù)篩中，直接檢測微藻培養(yǎng)液，快速和準(zhǔn)確地獲得油脂濃度，共復(fù)篩108株藻株 (圖5)。圖5中所有的突變藻株的含油量都比原始藻株大，驗證了此篩選流程的可靠性。圖5中除了大部分藻株油脂含量在1.5 g/L到2.3 g/L之間，還有9株藻株含油量較高，選取此9株藻株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳6代后結(jié)果見表3。表3中大部分藻株第6代的藻株油脂含量與復(fù)篩時即第一代的油脂含量相近，說明其遺傳穩(wěn)定性良好。選取其中遺傳穩(wěn)定性好且油脂含量也較高的G1H3、4E4、D4G5這3株藻株在5 L攪拌式反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵驗證，結(jié)果見圖6。圖6A中D4G5、G1H3的生長曲線和出發(fā)藻株WT相似，在48 h時微藻細(xì)胞量達(dá)到最大，微藻生長進(jìn)入穩(wěn)定期，而4E4在48 h還處于生長期。G1H3、D4G5的最終生物量比WT高，而4E4和WT相近，表明高油脂含量突變株的生長情況良好，并未受到突變的影響。在圖6B中，所有藻株培養(yǎng)24 h的油脂含量都有所下降，可能是由于藻株處于對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)動大部分能量生長細(xì)胞引起，當(dāng)48 h細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定期后，細(xì)胞中的油脂含量開始快速累積，培養(yǎng)結(jié)束時突變株的油脂含量均高于野生株，分別為21.8%、17.7%和16.9%，而野生株僅為10.2%，尤其是D4G5最終含油脂率為WT的2倍左右，這都說明獲得的突變株不僅油脂含量高，而且生長良好，產(chǎn)油脂的性能比原始藻株好，圖6C中油脂濃度的變化也能驗證這一點，同時這些都證明了此藻細(xì)胞育種流程的可靠性。

圖4　原殼小球藻不同誘變處理方法的正突變率Fig. 4 Positive mutation rates of C. protothecoides cells treated by different mutation methods. (A) Treated by ARTP with or without orlistat. (B) Treated by five different mutation methods with orlistat.

圖5　復(fù)篩結(jié)果Fig. 5 The lipid concentration of rescreened C. protothecoides strains.

表3　高產(chǎn)油藻株的搖瓶發(fā)酵驗證Table 3 Verification of high lipid content strains grown in shaking flask

圖6　高油脂含量原殼小球藻突變株，G1H3、4E4、D4G5及野生株在5 L攪拌式反應(yīng)器中生長和油脂含量變化曲線Fig. 6 Time courses of cell growth and lipid content of G1H3, 4E4, D4G5 and wild strains cultured in a 5-liter stirred bioreactor. (A) Cell growth. (B) Lipid content. (C) Lipid concentration.

3　結(jié)論

低場核磁共振技術(shù)檢測小球藻油脂含量是一個可靠的方法，可以用于小球藻油脂含量快速檢測，因此將低場核磁共振技術(shù)用于藻種篩選流程中可以使篩選更加簡單快捷。

圖7所示為基于尼羅紅染色初篩和低場核磁共振復(fù)篩的一個簡單、高效、易操作的高產(chǎn)油微藻誘變育種流程。藻種誘變篩選工藝流程：微藻細(xì)胞先經(jīng)ARTP誘變后在添加20 μg/mL奧利司他的平板中培養(yǎng)，挑單藻落至48孔板中培養(yǎng)3 d，尼羅紅染色后用熒光酶標(biāo)儀檢測其熒光強度，將熒光強度大的藻種接種至搖瓶培養(yǎng)，8 d后用LF-NMR檢測，油脂含量較大的藻種再傳代檢驗其遺傳穩(wěn)定性，遺傳穩(wěn)定性合格的藻種就是油脂含量較高的新藻種。

此流程不僅優(yōu)化了誘變方式，還選擇了適合的篩選方法，其中的低場核磁共振技術(shù)相較

于索氏提取以及GC-MS等方法，不需要將藻液離心干燥，更不需要索氏提取的復(fù)雜工藝和GC-MS復(fù)雜的前處理。在時間和操作步驟的簡易程度上，低場核磁共振技術(shù)都優(yōu)勝于索氏提取和GC-MS。將低場核磁共振技術(shù)用于誘變流程的復(fù)篩中簡化了篩選的步驟，縮短了篩選的周期，使篩選流程方便、快速和高效。

圖7　高產(chǎn)油脂微藻育種流程Fig. 7 Breeding procedure for high lipid producing strains of microalgae.

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Low field nuclear magnetic resonance for rapid quantitation of microalgae lipid and its application in high throughput screening

Tingting Liu1, Tao Wang1, Yi Yang3, Zejian Wang1, Yingping Zhuang1,2, Ju Chu1,2, and Meijin Guo1,2
1 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
2 Shanghai Collaborative Innovation Center for Biomanufacturing, Shanghai 200237, China
3 Shanghai Niumag Corporation, Shanghai 200237, China

Abstract:A rapid and accurate determination method of lipids in microalgae plays a significant role in an efficient breeding process for high-lipid production of microalgae. Using low field nuclear magnetic resonance (LF-NMR), we developed a direct quantitative method for cellular lipids in Chlorella protothecoides cells. The LF-NMR signal had a linear relationship with the lipid content in the microalgae cells for both dry cell samples and algal broth samples (R2>0.99). These results indicated that we could use this method for accurate determination of microalgal lipids. Although LF-NMR is a rapid and easy lipid determination method in comparison to conventional methods, low efficiency would limit its application in high throughput screening. Therefore, we developed a novel combined high throughput screening method for high-lipid content mutants of C. protothecoides. Namely, we initially applied Nile red staining method for semi-quantification of lipid in the pre-screening process, and following with LF-NMR method for accurate lipid determination in re-screening process. Finally, we adopted this novel screening method in the breeding process of high-lipid content heterotrophic cells of C. protothecoides. From 3 098 mutated strains 108 high-lipid content strains were selected through pre-screening process, and then 9 mutants with high-lipid production were obtained in the re-screening process. In a consequence, with heterotrophical cultivation of 168 h, the lipid concentration could reach 5 g/L, and the highest lipid content exceeded 20% (W/W), which was almost two-fold to that of the wild strain. All these results demonstrated that the novel breeding process was reliable and feasible for improving the screening efficiency.

Keywords:low field nuclear magnetic resonance, mutated breeding process, microalgae, lipid determination

Corresponding author:Meijin Guo. Tel/Fax: +86-21-64251131; E-mail: guo_mj@ecust.edu.cn