陳阿娜，劉秀霞，戴曉峰，詹錦玲，彭?xiàng)鳎铊?，王芬，李松，楊艷坤，白仲虎 江南大學(xué)　生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇　無(wú)錫　4 安徽工程大學(xué)　生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽　蕪湖　4000

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N端截短對(duì)嗜酸普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶酶學(xué)特性及功能的影響

陳阿娜1,2，劉秀霞1，戴曉峰1，詹錦玲1，彭?xiàng)?，李璐1，王芬1，李松2，楊艷坤1，白仲虎1
1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122
2 安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000

陳阿娜, 劉秀霞, 戴曉峰, 等. N端截短對(duì)嗜酸普魯蘭芽孢桿菌普魯蘭酶酶學(xué)特性及功能的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 355–364.

Chen AN, Liu XX, Dai XF, et al. Effect of N-terminal truncation of Bacillus acidopullulyticus pullulanase on enzyme properties and functions. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 355–364.

摘 要:采用N端截短方式對(duì)嗜酸普魯蘭芽孢桿菌Bacillus acidopullulyticus普魯蘭酶進(jìn)行分子精簡(jiǎn)，構(gòu)建不同形式的N端截短突變體，考察截短突變對(duì)表達(dá)水平、酶學(xué)特性及實(shí)用性能的影響。研究結(jié)果表明：缺失X45后，目標(biāo)蛋白幾乎全部以不溶形式的包涵體形式存在；缺失CBM41可引起可溶性表達(dá)量的大幅提升。缺失CBM41 (M1)、X25 (M3)、亦或兩結(jié)構(gòu)域同時(shí)缺失 (M5) 的變體最適溫度 (60 ℃) 和最適pH (5.0) 與野生型相同。突變體M1和M5的Km值分別提高至野生型的2.4倍和3.1倍，kcat/Km測(cè)定結(jié)果顯示M5催化效率下降明顯。突變體M1、M3和M5對(duì)分子量較大底物的水解效率略有下降，但對(duì)小分子底物的水解效率影響不明顯。野生型及突變體M1、M3和M5與糖化酶復(fù)配使用時(shí)，糖化值 (DE) 分別為93.6%、94.7%、94.5%和93.1%。上述結(jié)果表明，切除CBM41和/或X25結(jié)構(gòu)域的普魯蘭酶變體不影響其在淀粉糖化過(guò)程中的應(yīng)用，且由于分子量減小更易于異源表達(dá)，截短突變體可能更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞:N端截短，普魯蘭酶，表達(dá)水平，酶學(xué)特性，應(yīng)用

Received: July 13, 2015; Accepted: September 8, 2015

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB733602), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2015AA020802), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. JUSRP51401A), Provincial Natural Science Foundation for the Youth of Anhui province of China (No: 1408085QC61).

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2013CB733602)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863 計(jì)劃) (No. 2015AA020802)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. JUSRP51401A)，安徽省自然科學(xué)基金青年基金 (No. 1408085QC61) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-12-22 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151222.1416.002.html

普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶，可高效切割多聚葡萄糖類底物分支部位的α-1,6-糖苷鍵[1]。該酶常與糖化酶復(fù)配使用，應(yīng)用于淀粉糖化過(guò)程中：普魯蘭酶切割淀粉α-1,6-糖苷鍵分支點(diǎn)，糖化酶切割α-1,4-糖苷鍵連接的線性低聚糖[2-3]。兩者協(xié)同作用可有效提高淀粉利用率和糖化得率，并顯著縮短糖化時(shí)間[4-5]。在特定條件下，普魯蘭酶具有反向合成α-1,6-糖苷鍵功能，可用于獲得具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的多糖[6-7]，在制藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前已獲得許多微生物編碼的普魯蘭酶[8-11]，其中來(lái)源于嗜酸普魯蘭芽孢桿菌Bacillus acidopullulyticus的普魯蘭酶 (BaPul) 酶學(xué)性質(zhì) (主要是耐熱、耐酸性和比酶活) 能較好地滿足淀粉糖化過(guò)程需求，已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[12]。

BaPul成熟蛋白由921個(gè)氨基酸組成，各結(jié)構(gòu)域的連接順序?yàn)镃BM41-X45a-X25-X45b-CBM48-GH13。CBM為碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，X是未知功能結(jié)構(gòu)域，GH13是CAZY GH13結(jié)構(gòu)域，其本身由GH13家族 (又稱α-淀粉酶家族) 典型的A、B和C三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成[13-16]?？臻g結(jié)構(gòu)上，CBM48和GH13結(jié)合緊密，它們組成的結(jié)構(gòu)與異淀粉酶相似，可能具有淀粉脫支酶完整的催化功能；處于N端的CBM41、X45和X25與催化功能域連接較為松散，推測(cè)這3個(gè)結(jié)構(gòu)域可能與大分子底物的結(jié)合相關(guān)。對(duì)其他種屬的Ⅰ型普魯蘭酶研究表明，N端結(jié)構(gòu)域的切除并不影響普魯蘭酶對(duì)小分子糊精的脫支功能，不影響普魯蘭酶在淀粉糖化過(guò)程中的實(shí)際應(yīng)用[17-19]。

因而當(dāng)前工作中，我們依據(jù)BaPul 3D結(jié)構(gòu)(PDB code 2WAN) 構(gòu)建不同形式的N端截短突變體，對(duì)比考察截短突變體與野生型普魯蘭酶(WT) 在可溶性表達(dá)水平、酶學(xué)特性和淀粉糖化過(guò)程中應(yīng)用的差異。為優(yōu)化/簡(jiǎn)化BaPul編碼基因，解析結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系以及探索酶與底物協(xié)同作用機(jī)制等方面的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和基因

大腸桿菌BL21 (DE3) 和質(zhì)粒pelB-pET28a (+) 分別用于普魯蘭酶及其截短突變體基因重組表達(dá)的宿主菌和質(zhì)粒。pelB-pET28a (+) 的質(zhì)粒骨架是pET28a (+)，pelB信號(hào)肽來(lái)源于pET22b (+)。構(gòu)建過(guò)程中將pET28a (+) 上Bgl Ⅱ到XhoⅠ之間的片段替換為pET22b (+) 上的等位片段。BaPul全長(zhǎng)基因 (GenBank Accession No. Ax203843.1)及其截短突變體基因由Invitrogen上海公司合成，并連接于pMD18-T載體上。

1.2重組載體的構(gòu)建

以含有目標(biāo)基因的pMD18-T載體為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出目標(biāo)基因。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性8 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1–2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。采用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ及XhoⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物及pelB-pET28a (+) 表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞。所用引物及其相關(guān)信息見表1。

1.3培養(yǎng)基和發(fā)酵條件

種子培養(yǎng)基采用LB：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母浸出物，和10 g/L NaCl。發(fā)酵培養(yǎng)基采用改進(jìn)的TB：12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母浸出物，2.31 g/L KH2PO4，9.85 g/L K2HPO4，和10 g/L甘油，pH 7.0。10 mL培養(yǎng)基裝入100 mL三角瓶中滅菌，并在使用前加入卡那霉素至終濃度50 μg/mL。

取–80 ℃保存的菌種按0.1%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，置于搖床上37 ℃、230 r/min培養(yǎng)10 h。取種子培養(yǎng)液按1%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床上37 ℃、230 r/min培養(yǎng)5.5 h (此時(shí)的OD600約為5–6)；加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，并下調(diào)培養(yǎng)溫度至20 ℃，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間18–20 h。

1.4組分分離

取1.0 mL發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液，4 000 × g、4 ℃離心30 min。收集離心上清并定義該組分為胞外組分。將離心所得菌體用10 mmol/L PBS (pH 7.4) 稀釋至OD600= 4.0–5.0后，用超聲破碎方法破碎菌體。超聲條件為25%功率，超2 s停2 s，總超聲時(shí)間6 min。將超聲破碎液12 000 × g、4 ℃離心10 min，收集離心上清定義為胞內(nèi)可溶組分和離心碎片定義為胞內(nèi)不溶組分[20]。所有組分之和為全細(xì)胞蛋白。

1.5酶活分析

普魯蘭酶酶活力測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸方法 (簡(jiǎn)稱DNS方法)[21]。取適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL加入到1.9 mL 1%的普魯蘭溶液中，置于60 ℃水浴中溫浴10 min，迅速加入3 mL DNS試劑終止酶解反應(yīng)，并于沸水浴中煮沸7 min進(jìn)行顯色反應(yīng)。將上述反應(yīng)液置于冰水中冷卻，并加入20 mL蒸餾水，混勻后于540 nm測(cè)定吸光度值。采用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉配制1%的普魯蘭溶液。1個(gè)酶活力單位定義為上述測(cè)定條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量 (還原糖以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)計(jì))。

表1　野生型及其截短突變體擴(kuò)增用引物Table 1 List of nucleotide sequences used in this study

1.6蛋白質(zhì)純化及定量

目標(biāo)蛋白C端連接His-tag，純化采用Ni+柱親和層析方法，具體操作參見文獻(xiàn)[22]。蛋白純度采用SDS-PAGE分析。蛋白定量采用Bradford方法[23]，具體操作參見改良型Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (生工生物工程上海股份有限公司)。

1.7最適pH及酸堿穩(wěn)定性

最適pH測(cè)定采用不同pH值的緩沖液配制1%的普魯蘭溶液、重懸和稀釋酶液，用于酶活測(cè)定。酸堿穩(wěn)定性測(cè)定采用不同pH值的緩沖液重懸和稀釋酶液，于4 ℃冰箱放置24 h，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定酶活。以最高酶活為100%，其余pH值下的酶活以相對(duì)百分比表示。各pH值所用緩沖液：甘氨酸-鹽酸 (pH 3.0，100 mmol/L)，檸檬酸-檸檬酸鈉 (pH 3.5和5.5，100 mmol/L)，醋酸-醋酸鈉 (pH 4.0–5.0，100 mmol/L)，和Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0–7.5，100 mmol/L)。

1.8最適溫度及熱穩(wěn)定性

最適溫度的測(cè)定在水浴溫度為40–80 ℃條件下測(cè)定酶活，其余參數(shù)同標(biāo)準(zhǔn)條件。溫度穩(wěn)定性測(cè)定時(shí)將酶液在60 ℃溫浴，每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定殘余酶活。以未經(jīng)溫浴的酶液酶活作為100%，其余酶活以相對(duì)百分比表示。以ln (殘余酶活%) 對(duì)溫浴時(shí)間作圖，采用線性回歸方法求得一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)kd。半衰期t1/2=ln2/kd[24]。

1.9動(dòng)力學(xué)參數(shù)

用100 mmol/L的醋酸-醋酸鈉 (pH 5.0) 配制濃度為0.25–16.0 mg/mL (0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0和16.0) 的普魯蘭溶液，并在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定酶活[25]。以反應(yīng)速率對(duì)底物濃度作圖，采用非線性回歸方法求得Vmax和Km。kcat= Vmax/[E]，其中[E]是酶濃度。

1.10底物特異性及應(yīng)用

用于測(cè)定底物特異性的底物濃度為0.25%。以普魯蘭為底物時(shí)的酶活計(jì)為100%，其余酶活以相對(duì)百分比表示。

配制干基濃度為30%的玉米淀粉乳 (按15 L配制)，調(diào)節(jié)pH值至5.5–6.2，加入1 mmol/L氯化鈣，加入高溫酸性α-淀粉酶 (10–15 U/g干基)，在劇烈攪拌下，先加熱至72 ℃，保溫15 min，再加熱至95 ℃，并維持60 min，以達(dá)到所需的液化程度(DE值：12–15%)，碘反應(yīng)呈棕紅色。液化結(jié)束后，迅速將料液用鹽酸將pH調(diào)至4.2–4.5，并升溫至120 ℃，保持10 min，以滅活酶。糖化過(guò)程溫度下調(diào)為60 ℃，加入糖化酶(120 U/g干基) 和普魯蘭酶 (0.5 U/g干基)。60 ℃保溫若干小時(shí)后，當(dāng)用無(wú)水酒精檢驗(yàn)無(wú)糊精存在時(shí)，糖化過(guò)程結(jié)束。將料液pH調(diào)至5.0，同時(shí)在沸水浴中煮沸10 min，以滅活酶[26]。

圖1　野生型及其截短突變體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic representation of the WT and the variants. Different color represents different structural domain. Numbers represent the first residues of each domain. The names of the variants are indicated on the left. The predicted molecular sizes are indicated on the right.

2　結(jié)果與討論

2.1截短突變體的設(shè)計(jì)

依據(jù)BaPul的3D結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了6種截短突變體，分別是缺失CBM41的變體M1，缺失X45 (包括X45a和X45b) 的變體M2，缺失X25的變體M3，缺失CBM41和X45的變體M4，缺失CBM41和X25的變體M5，和缺失X45和X25的變體M6。野生型及其截短突變體一級(jí)結(jié)構(gòu)連接順序及各結(jié)構(gòu)域的劃分見圖1。

2.2表達(dá)效果檢測(cè)

將野生型普魯蘭酶及截短突變體的編碼基因亞克隆至pelB-pET28a (+)，并轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3) 中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。由于缺乏信號(hào)肽引導(dǎo)，所有目標(biāo)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)酵液上清中無(wú)可檢測(cè)酶活。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)缺失CBM41的M1和M5酶活高于其他重組菌株，分別達(dá)到84.6 U/mL和71.0 U/mL，野生型酶活僅為29.1 U/mL，缺失X25的M3酶活與野生型相當(dāng)。M2、M4和M6發(fā)酵液上清和胞內(nèi)均未檢測(cè)到酶活，這3個(gè)重組菌株的共同特征是切除了X45結(jié)構(gòu)域。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，M1和M5的可溶性表達(dá)量明顯高于M3和WT；缺失X45的M2、M4和M6可溶性蛋白少 (圖2)。X45結(jié)構(gòu)域可能在促進(jìn)催化結(jié)構(gòu)域正確折疊或維持催化結(jié)構(gòu)域正確構(gòu)象中發(fā)揮作用[17]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將不再涉及這3個(gè)突變體。

2.3酶的純化及比酶活的測(cè)定

為研究酶學(xué)特性的變化，對(duì)野生型及其截短突變體進(jìn)行了純化。細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后，12 000 × g、4 ℃離心10 min，去除細(xì)胞碎片及不溶物，離心上清過(guò)Ni+柱進(jìn)行純化。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示目標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)電泳純，可用于酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定 (圖3)。純化后產(chǎn)物的比酶活測(cè)定結(jié)果表明截短突變體與野生型酶差異較小，因而總酶活比值可近似代表表達(dá)量比值。蛋白定量結(jié)果表明可溶性蛋白表達(dá)量差異較為明顯，如M1和M5的表達(dá)量分別是野生型的2.7倍和2.1倍 (表2)。M1和M5酶活提高倍數(shù)與表達(dá)量提高倍數(shù)相當(dāng)。以上結(jié)果表明酶活升高主要是可溶性表達(dá)量升高引起的。

圖2　野生型普魯蘭酶及其截短突變體全細(xì)胞蛋白的可溶性組分SDS-PAGEFig. 2 The total cell protein SDS-PAGE analysis of the WT and the variants. M: protein molecular mass markers; 1: control (vector pET28a(+) without foreign gene); 2: M1; 3: M2; 4: M3; 5: M4; 6: M5; 7: M6; 8: WT. The values are molecular sizes in kilodaltons.

表2　野生型普魯蘭酶及其截短突變體可溶性蛋白定量及比酶活Table 2 Specific activity and protein concentration of the WT and the variants

2.4最適pH及酸堿穩(wěn)定性

截短突變對(duì)最適pH的影響較小，野生型與各突變體最適pH曲線變化趨勢(shì)幾乎相同，M1、M3、M5和野生型的最適pH為5.0。然而，不同突變體的酸堿穩(wěn)定性有明顯差異，尤其是當(dāng)pH值低于最適pH值時(shí)。如在pH 3.0時(shí)，M5 (ΔCBM41ΔX25) 的殘余酶活不足70%，而其余突變體的殘余酶活均高于80%。當(dāng)pH值偏酸性時(shí)，M1變體的穩(wěn)定性優(yōu)于野生型 (圖4)。上述結(jié)果表明，X25結(jié)構(gòu)域可能對(duì)野生型普魯蘭酶在維持酸堿穩(wěn)定性方面發(fā)揮正向促進(jìn)作用，而CBM41結(jié)構(gòu)域可能不利于維持酸堿穩(wěn)定性。

2.5最適溫度及熱穩(wěn)定性

如圖5所示，M1、M3和M5的最適溫度(60 ℃) 與野生型相同。在70 ℃時(shí)，M1、M3、M5和WT的相對(duì)酶活分別為82%、80%、87% 和63%。該結(jié)果表明，突變體比野生型具有較好的耐熱性。熱穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明切除CBM41變體的半衰期都有所延長(zhǎng)，如M1和M5的半衰期分別是野生型的1.3倍和1.2倍。切除X25對(duì)熱穩(wěn)定性的影響不大 (表3)。

圖4　野生型及其截短突變體的最適pH及酸堿穩(wěn)定性Fig. 4 The optimal pH and pH stability of the WT and the variants. (A) Optimal pH. (B) pH stability.

圖5　野生型及其截短突變體的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig. 5 The optimal temperature and thermostability of the WT and the variants. (A) Optimal temperature. (B) Thermostability.

表3　野生型普魯蘭酶及其截短突變體半衰期Table 3 Half-life of the WT and the variants

根據(jù)已解析的BaPul 3D結(jié)構(gòu)，普魯蘭酶的N端結(jié)構(gòu)域與催化功能域連接較為松散，尤其是CBM41結(jié)構(gòu)域甚至不能以晶體形式呈現(xiàn)[13]。這些柔性結(jié)構(gòu)域可能會(huì)對(duì)普魯蘭酶整體的熱穩(wěn)定性造成一定的負(fù)面影響。前期工作中，我們通過(guò)定點(diǎn)突變CBM41結(jié)構(gòu)域中柔性氨基酸，提高了野生型普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性[22]。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們提出：通過(guò)刪除或替換蛋白分子結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域，可以有效提高蛋白的熱穩(wěn)定性。

2.6酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)

M1和M5變體的Km值分別比野生型提高了2.4倍和3.1倍，M3變體的Km值變化不明顯。該結(jié)果表明截短的CBM41有助于大分子普魯蘭與酶結(jié)合 (Km值越小表示酶對(duì)底物的親和力越大)，X25也可能發(fā)揮相似的作用。kcat/Km測(cè)定結(jié)果顯示M5催化效率下降明顯，M1和M3與野生型相當(dāng)。結(jié)構(gòu)變化引起功能變化的機(jī)制目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步分析。

2.7底物特異性及應(yīng)用

所有普魯蘭酶的最適底物是普魯蘭多糖；所有普魯蘭酶對(duì)高度分支的糖原沒有水解活性。所有突變體對(duì)小分子糊精的相對(duì)活性比野生型略有下降，對(duì)分子量較大的可溶性淀粉下降較為明顯 (表5)。上述結(jié)果表明，CBM41和未知功能的X25有助于酶與底物結(jié)合，尤其是對(duì)大分子底物。N端結(jié)構(gòu)域的切除并不影響普魯蘭酶對(duì)小分子糊精的脫支功能，但是是否影響在淀粉糖化過(guò)程中的實(shí)際應(yīng)用仍需實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。

表4　野生型普魯蘭酶及其截短突變體動(dòng)力學(xué)常數(shù)Table 4 Kinetic parameters of the WT and the variants

表5　野生型普魯蘭酶及其截短突變體底物特異性Table 5 Substrate specificity of the WT and the variants

糖化終點(diǎn)時(shí)，測(cè)定各組料液中DE值 (還原性糖以葡萄糖計(jì))。對(duì)照組中未添加任何普魯蘭酶變體，糖化終點(diǎn)時(shí)DE值為92.1%。當(dāng)野生型及突變體M1，M3和M5與糖化酶復(fù)配使用時(shí)，糖化終點(diǎn)時(shí)DE值分別為93.6%、94.7%、94.5% 和93.1%。添加普魯蘭酶可提高糖化得率，且突變體M1和M3對(duì)DE值的貢獻(xiàn)高于野生型普魯蘭酶。

3　結(jié)論

為解析野生型Bacillus acidopullulyticus普魯蘭酶結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系，本文通過(guò)蛋白質(zhì)工程對(duì)其N端進(jìn)行了不同形式的截短。研究過(guò)程中主要得出以下結(jié)論：缺失CBM41可有效提高突變體的酶活；缺失X25對(duì)酶活影響不大；缺失X45的突變體喪失了催化活力，目標(biāo)蛋白主要以不溶的包涵體形式存在。比酶活測(cè)定結(jié)果表明截短突變體與野生型酶差異較小，酶活升高主要是可溶性表達(dá)量升高引起的。突變體M1、M3和M5的最適pH (5.0) 和最適溫度(60 ℃) 與野生型相同；突變體M1、M3和M5對(duì)小分子葡聚多糖底物的水解效率影響較小，上述結(jié)果表明切除CBM41和X25結(jié)構(gòu)域的普魯蘭酶變體不影響其在淀粉糖化過(guò)程中的應(yīng)用。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

海洋生物技術(shù)

Effect of N-terminal truncation of Bacillus acidopullulyticus pullulanase on enzyme properties and functions

A’na Chen1,2, Xiuxia Liu1, Xiaofeng Dai1, Jinling Zhan1, Feng Peng1, Lu Li1, Fen Wang1, Song Li2, Yankun Yang1, and Zhonghu Bai1
1 National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
2 School of Biochemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, Anhui, China

Abstract:We constructed different N-terminal truncated variants based on Bacillus acidopullulyticus pullulanase 3D structure (PDB code 2WAN), and studied the effects of truncated mutation on soluble expression, enzymatic properties, and application in saccharification. Upon expression, the variants of X45 domain deletion existed as inclusion bodies, whereas deletion of CBM41 domain had an effective effect on soluble expression level. The variants that lack of CBM41 (M1), lack of X25 (M3), and lack both of CBM41 and X25 (M5) had the same optimal pH (5.0) and optimal temperature (60 ℃) with the wild-type pullulanase (WT). The Kmof M1 and M5 were 1.42 mg/mL and 1.85 mg/mL, respectively, 2.4- and 3.1-fold higher than that of the WT. kcat/Kmvalue of M5 was 40% lower than that of the WT. Substrate specificity results show that the enzymes exhibited greater activity with the low-molecular-weight dextrin than with high-molecular-weight soluble starch. When pullulanases were added to the saccharification reaction system, the dextrose equivalent of the WT, M1, M3, and M5 were 93.6%, 94.7%, 94.5%, and93.1%, respectively. These results indicate that the deletion of CBM41 domain and/or X25 domain did not affect the practical application in starch saccharification process. Furthermore, low-molecular-weight variants facilitate the heterologous expression. Truncated variants may be more suitable for industrial production than the WT.

Keywords:N-terminal truncation, pullulanase, expression level, enzyme properties, application

Corresponding authors: Yankun Yang. Tel/Fax: +86-510-85319306; E-mail: yangyankun@jiangnan.edu.cn Zhonghu Bai. Tel/Fax: +86-510-85319306; E-mail: baizhonghu@jiangnan.edu.cn