梁航華，高洪燕，徐曼，譚鵬，崔紅娟西南大學(xué)　家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶　400716

?

家蠶BmBrat基因的克隆與鑒定

梁航華，高洪燕，徐曼，譚鵬，崔紅娟
西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716

梁航華, 高洪燕, 徐曼, 等. 家蠶BmBrat基因的克隆與鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(3): 375–384.

Liang HH, Gao HY, Xu M, et al. Cloning and characterization of BmBrat in silkworm, Bombyx mori. Chin J Biotech, 2016, 32(3): 375–384.

摘 要:NHL家族蛋白具有調(diào)控細(xì)胞增殖與分化的功能，在哺育動(dòng)物中被廣泛研究。本文克隆得到家蠶NHL蛋白家族成員BmBrat基因，通過(guò)RACE技術(shù)獲得該基因cDNA全長(zhǎng)序列為3 614 bp，其ORF為2 580 bp，編碼859個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白分子量為94.3 kDa，等電點(diǎn)為6.65。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在五齡3 d家蠶各組織表達(dá)情況，結(jié)果表明其在幼蟲各組織均有表達(dá)，包括絲腺、中腸、脂肪體、馬氏管等，且卵巢和頭部表達(dá)量最高；胚胎時(shí)期表達(dá)譜分析顯示其在胚胎發(fā)育第4天和第5天有高量表達(dá)。經(jīng)原核表達(dá)、蛋白純化及免疫小鼠后獲得家蠶BmBrat多克隆抗體，且Western blotting及免疫熒光檢測(cè)顯示該抗體可以特異檢測(cè)家蠶BmBrat蛋白；免疫熒光結(jié)果表明BmBrat蛋白定位于家蠶血細(xì)胞胞質(zhì)中，為進(jìn)一步研究BmBrat基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:家蠶，BmBrat基因，表達(dá)譜，抗體制備，亞細(xì)胞定位

Received: July 17, 2015; Accepted: November 14, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81201551), the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. 20130182110003), the Natural Science Foundation of Chongqing (No. CSTC2013jcyjys0007), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nos. XDJK2013B020, SWU111014).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81201551)，高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 (No. 20130182110003)，重慶市科委自然科學(xué)院士基金 (No. CSTC2013jcyjys0007)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (Nos. XDJK2013B020, SWU111014) 資助。

NHL家族的名字源于發(fā)現(xiàn)的3個(gè)成員：NCL-1、HT2A和LIN-41，這3個(gè)因子與RNA代謝有關(guān)系，可能參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控[1]。研究表明，NHL家族的成員均含有3個(gè)保守的基序：1個(gè)RING、1個(gè)或是2個(gè)B-box和1個(gè)coiled-coil[2]。在調(diào)節(jié)Brat (Brain tumor) 蛋白的活性中NHL結(jié)構(gòu)起了至關(guān)重要的作用[3]。Brat本身是一類腫瘤抑制基因，但同時(shí)也是一個(gè)控制細(xì)胞增殖的候選基因，屬于NHL蛋白家族的成員[4]。在果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中，Brat的表達(dá)在很大程度上限制了胚胎時(shí)期周圍神經(jīng)系統(tǒng)、腹神經(jīng)索和腦的發(fā)育[5]。在干細(xì)胞發(fā)生系統(tǒng)中，Brat 與Prospero、Numb等作為細(xì)胞命運(yùn)決定因子，促進(jìn)細(xì)胞命運(yùn)的變化[6]。Numb是一種膜結(jié)合蛋白，參與Notch 信號(hào)通路的調(diào)控[7]。在神經(jīng)前體細(xì)胞分裂期間，Numb聚集到細(xì)胞的一端，與細(xì)胞膜結(jié)合形成新月板，細(xì)胞分裂期間通過(guò)不對(duì)稱分裂進(jìn)入神經(jīng)節(jié)母細(xì)胞中，Numb蛋白結(jié)合α-泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)因子Sanpodo抑制Notch蛋白[8-9]。Notch 信號(hào)通路在神經(jīng)母細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。Notch信號(hào)通路受到抑制可以使細(xì)胞從自我更新逐漸開(kāi)始分化分裂[10]。而Prospero是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，在胚胎和幼蟲的神經(jīng)母細(xì)胞中均存在，最終在分化的膠質(zhì)細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)[11]，在決定細(xì)胞命運(yùn)和細(xì)胞增殖調(diào)控中Prospero作為Brat下游的一個(gè)調(diào)控因子起著關(guān)鍵的作用。研究Brat在細(xì)胞分化和增殖中的作用，能為干細(xì)胞的分化提供理論依據(jù)。在人與哺乳動(dòng)物中brat的同源蛋白是TRIM蛋白家族，它們?cè)诎l(fā)育、分化和宿主細(xì)胞的抗病毒防御以及癌癥中都起到作用。TRIM家族是NHL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)亞群，該亞群包含哺乳動(dòng)物的TRIM2、TRIM3、TRIM32和TRIM71等，包括果蠅中的Brat、Mei-p26、Abba 和Wech，以及秀麗隱桿線蟲中的Ncl-1、Nhl-1、Nhl-1、Nhl-3和Lin41[12]，其中TRIM3是一個(gè)腫瘤抑制因子，能結(jié)合到cdk抑制因子p21WAF1/CIP1，通過(guò)隔絕p21并阻止它積累Cyclin D1-CDK4抑制癌癥的發(fā)生[13-14]。在小鼠中降低TRIM3的表達(dá)將增加并加速血小板生長(zhǎng)因子(PDGF，platelet-derived growth factor) 引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生率[15]。

家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時(shí)也越來(lái)越多地作為無(wú)脊椎模式動(dòng)物進(jìn)行研究。目前家蠶BmBrat基因未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用RACE技術(shù)獲得BmBrat基因全長(zhǎng)，通過(guò)誘導(dǎo)大腸桿菌原核表達(dá)獲得重組蛋白進(jìn)而制備抗體，為更深入研究Brat基因在細(xì)胞增殖分化與個(gè)體發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用家蠶品種為大造，由西南大學(xué)家蠶基因庫(kù)提供。蠶卵在25 ℃相對(duì)濕度60%–80%下催青，孵化后幼蟲在25 ℃下桑葉飼育。感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。Trizol試劑和RACE試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。PMD19-T simple載體、限制性內(nèi)切酶、Taq酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司。反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自Promega公司。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。多聚甲醛為上海生工生物工程公司產(chǎn)品。DAPI和抗熒光猝滅劑為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成

取各發(fā)育時(shí)期的蠶卵和5齡3 d幼蟲的頭、體壁、血液、中腸、精巢、卵巢、馬氏管、脂肪體等組織器官，除血液直接加入Trizol外，其他組織經(jīng)液氮研磨后加入Trizol，按照Invitrogen公司Total RNA操作指南提取總RNA。利用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)RNA產(chǎn)物的完整性、純度和濃度。使用DNA酶在37 ℃消化30 min后，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.2RACE法擴(kuò)增全長(zhǎng)序列

設(shè)計(jì)基因特異RACE引物GSP1、NGSP1、 GSP2、NGSP2，引物序列見(jiàn)表1。隨后按照RACE試劑盒進(jìn)行5′RACE和3′RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，回收目的條帶，連接到PMD19-T simple載體上，轉(zhuǎn)化后提取陽(yáng)性克隆，測(cè)序后進(jìn)行拼接，獲得BmBrat基因全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.3蛋白序列分析

拼接得到的序列在ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 網(wǎng)站進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)以及氨基酸序列翻譯。使用Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org)，SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)，SignalP 4.1 Serve (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM-2.0/)，ExPasy (http://www.expasy.org/tools/)等在線軟件預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域、分子量和等電點(diǎn)等信息。

1.2.4表達(dá)譜分析

分別以家蠶5齡3 d各組織及胚胎各發(fā)育時(shí)期cDNA為模板對(duì)BmBrat進(jìn)行半定量PCR 檢測(cè)，檢測(cè)引物為BmBrat (引物序列見(jiàn)表1)，以肌動(dòng)蛋白3 (BmActin3) 為內(nèi)參[16]。PCR總反應(yīng)體系為25 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，HiFi-Taq酶0.2 μL，模板1 μL，加滅菌的雙蒸水至總體積為25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，共28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，EB 染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像進(jìn)行分析。

1.2.5原核表達(dá)、蛋白純化及抗體制備

用軟件預(yù)測(cè)BmBrat的抗原特異性，截取部分片段設(shè)計(jì)引物Bmbrat-P2 (引物序列見(jiàn)表1)，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pET-32a載體上，獲得pET32a-BmBrat重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET32a-BmBrat轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，獲得單菌落并擴(kuò)大培養(yǎng)，分別用0.6 mmol/L IPTG在15 ℃誘導(dǎo)12 h及37 ℃ 6 h后，收集菌液，超聲裂解離心分離上清和沉淀，然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白。考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況，最終選擇37 ℃大規(guī)模誘導(dǎo)。振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，用0.6 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，收集菌體，用PBS重懸，裂解后超聲破碎收集沉淀，尿素溶解后用0.45 μm濾膜抽濾進(jìn)行Ni離子親和柱純化，使用不同咪唑濃度的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液后用SDS-PAGE分析蛋白純化情況。注射重組蛋白前利用谷胱甘肽稀釋還原法對(duì)其進(jìn)行復(fù)性，加PBS將蛋白濃度稀釋至0.5 mg/mL，加入氧化型谷胱甘肽 (GSH) 至終濃度為2 mmol/L，同時(shí)加入還原性谷胱甘肽 (GSSG) 至終濃度為10 mmol/L，4 ℃復(fù)性過(guò)夜，PBS透析，PEG2000濃縮[17]。使用純化復(fù)性好的重組蛋白注射健康的成年雄性昆明小鼠3只，每只小鼠注射前剪尾尖取血，收集約50 μL正常血清，作為陰性對(duì)照，室溫靜置后離心收集上清，上清與甘油以1∶1的比例混合后于–80 ℃保存。小鼠進(jìn)行免疫時(shí)每只腹腔注射5次蛋白，第一次與弗式完全佐劑等體積混合，后4次均與弗式不完全佐劑等體積混合，所用蛋白量依次為50、70、90、110和120 μg，前3次間隔10 d進(jìn)行免疫，后2次間隔14 d免疫，最后1次免疫1周后，摘眼球取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min將血清取出，加入0.02%的NaN3后，–80 ℃中保存。

表1　引物列表Table 1 Primer list

1.2.6BmBrat抗體特異性檢測(cè)

將原核表達(dá)并純化得到的重組蛋白作為樣品，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)免疫血清的特異性。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜后，于5%的牛奶封閉液中，室溫緩慢搖蕩封閉2 h。分別將免疫血清和免疫前血清以1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過(guò)夜。之后將膜用TBST洗3次，每次15 min，用1×TBST 稀釋二抗 (1∶5 000)，將PVDF膜浸沒(méi)于二抗液中，室溫緩慢搖蕩2 h。再次用TBST洗3次，每次10 min，用ECL顯色液進(jìn)行顯色及用成像儀進(jìn)行曝光。家蠶胚胎細(xì)胞系BME-SWU3鋪到有爬片的24孔板中，爬片過(guò)夜。使用4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton-100打孔15 min。室溫條件下用10%山羊血清封閉2 h后分別用免疫前血清和抗BmBrat的免疫血清，4 ℃孵育過(guò)夜。孵育完二抗漂洗后DAPI染色，使用抗熒光猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)。

1.2.7血細(xì)胞定位BmBrat

將家蠶血細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，加入1% Triton-100靜置10 min后PBS漂洗。用10%山羊血清封閉液室溫封閉2 h，之后分別用免疫前血清和抗BmBrat的免疫血清4 ℃孵育過(guò)夜。孵育完二抗漂洗后DAPI染色，使用抗熒光猝滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1家蠶BmBrat基因全長(zhǎng)克隆與分析

從NCBI下載不同物種的Brat基因序列，并在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast分析以確定家蠶同源基因。以家蠶5齡3 d的頭部cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)RACE技術(shù)，得到了3′端的序列和5′端的序列，連接到pMD19T- simple載體測(cè)序，拼接后獲得了3 614 bp全長(zhǎng)序列，包括239 bp的5′UTR和795 bp的3′UTR，預(yù)測(cè)得到其ORF為2 580 bp，編碼859個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為94.3 kDa，等電點(diǎn)為6.65 (圖1A–1C)。通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，家蠶的Brat蛋白質(zhì)序列中存在1個(gè)保守的RING結(jié)構(gòu)域，2個(gè)B-BOX結(jié)構(gòu)域、1個(gè)保守的BBC結(jié)構(gòu)域和3個(gè)連續(xù)的NHL結(jié)構(gòu)域 (圖1C)。利用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在N端區(qū)域沒(méi)有信號(hào)肽 (圖1D)。

圖1　BmBrat全長(zhǎng)克隆及信息分析Fig. 1 Cloning and bioinformatic analysis of BmBrat. (A) Full-length cDNA was cloned by RACE method. (B) Diagram of BmGATA6 complete cDNA sequence was analyzed. (C) Analysis of BmGATA6 protein domain and amino acid sequence was presented. (D) BmBrat protein signal peptide was predicted.

2.2BmBrat基因在家蠶胚胎及幼蟲各組織表達(dá)譜

分別以等量的家蠶胚胎期1–9 d和幼蟲5齡3 d (L5D3) 各組織的cDNA為模板，以肌動(dòng)蛋白3 (Actin3) 為內(nèi)參進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)該BmBrat基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示BmBrat在胚胎4 d、5 d的時(shí)候高量表達(dá)，之后其表達(dá)量開(kāi)始逐步下降 (圖2B)；而在L5D3幼蟲各組織中均有表達(dá)，其中卵巢和頭表達(dá)量最高，其次是絲腺、中腸、精巢和脂肪體，馬氏管和表皮中BmBrat表達(dá)量相對(duì)較低 (圖2A)。

2.3BmBrat的原核誘導(dǎo)表達(dá)

PCR擴(kuò)增得到777 bp的片段用于構(gòu)建原核表達(dá)載體 (圖3A-a)，結(jié)構(gòu)如圖3B所示。將載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，有777 bp的片段出現(xiàn) (圖3A-b)，與預(yù)期結(jié)果相符，表明已成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-BmBrat。在37 ℃和15 ℃溫度下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BmBrat重組蛋白都屬于包涵體，且在37 ℃誘導(dǎo)條件下，重組蛋白的表達(dá)量要比15 ℃條件下產(chǎn)生的多 (圖3C)，于是后續(xù)采用37 ℃的條件下進(jìn)行BmBrat重組蛋白大量誘導(dǎo)。根據(jù)重組蛋白上的6×His標(biāo)簽進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，證明其確實(shí)為目的蛋白 (圖3D-a)。經(jīng)不同濃度的咪唑洗脫液進(jìn)行梯度洗脫后，對(duì)流出液進(jìn)行SDS-PAGE分析 (圖3D-b)，結(jié)果表明200 mmol/L與500 mmol/L咪唑洗脫液中只有目的蛋白大小的單一條帶，而沒(méi)有其他雜帶，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.4抗BmBrat血清檢測(cè)

在完成5次免疫后，通過(guò)摘除小鼠眼球的方法，獲取免疫血清。使用重組蛋白通過(guò)Western blotting分析免疫血清的特異性。結(jié)果顯示，BmBrat免疫血清能特異性地識(shí)別大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組BmBrat蛋白 (圖4B)。隨后又以小鼠免疫前的正常血清作為對(duì)照，利用免疫血清對(duì)家蠶細(xì)胞系BME-SWU3進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。對(duì)照組中無(wú)熒光信號(hào)，但是實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可以檢測(cè)到BmBrat蛋白的表達(dá) (圖4A)。以上結(jié)果說(shuō)明我們所制備的BmBrat抗體可以特異性識(shí)別BmBrat蛋白，可為后續(xù)研究BmBrat基因的功能提供抗體支持。

2.5Bmbrat蛋白在家蠶血細(xì)胞定位

前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BmBrat在家蠶細(xì)胞系中有表達(dá)，為了進(jìn)一步了解BmBrat的表達(dá)情況及其可能發(fā)揮的作用，我們對(duì)其在家蠶血細(xì)胞中的定位進(jìn)行了分析。免疫熒光結(jié)果顯示，與使用陰性血清的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中可以明顯檢測(cè)到熒光信號(hào)，即家蠶血細(xì)胞中有BmBrat蛋白的表達(dá)，并且該蛋白只表達(dá)于部分血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中 (圖5)。

圖3　重組蛋白pET32a-BmBrat的誘導(dǎo)表達(dá)與純化Fig. 3 Induction and purification of recombinant protein pET32a-Bmbrat. (A) Construction of the BmBrat prokaryotic expression vector. (a) M: DNA marker; 1: PCR products. (b) M: DNA marker; 1: pET32a-BmBrat plasmid digested with EcoRⅠand XhoⅠ. (B) Structure of BmBrat prokaryotic expression vector. (C) The recombinant Bmbrat protein was induced with IPTG at 15 ℃ or 37 ℃. M: protein marker; 1,5: the induction of BmBrat with 0 mmol/L IPTG at 15 ℃ in supernatant and cell pellet respectively; 2,6: the induction of BmBrat with 0.6 mmol/L IPTG at 15 ℃ in supernatant and cell pellet respectively; 3,7: the induction of BmBrat with 0 mmol/L IPTG at 37 ℃ in supernatant and cell pellet respectively; 4,8: the induction of BmBrat with 0.6 mmol/L IPTG at 37 ℃ in supernatant and cell pellet respectively. (D) a) Detection of recombinant BmBrat protein by His tag antibody. b) Purification of the BmBrat recombinant protein. M: protein marker; 1: 100 mmol/L imidazole; 2: 120 mmol/L imidazole; 3: 200 mmol/L imidazole; 4: 500 mmol/L imidazole.

圖4　抗BmBrat血清檢測(cè)Fig. 4 Detection of anti-BmBrat serum. (A) BmBrat protein in silkworm cell line BME-SWU3 was detected by Immunofluorescence with anti-BmBrat serum and negative control. (B) Recombinant BmBrat protein was detected by Western blotting with anti-BmBrat serum. M: protein marker; 1: the purified recombinant BmBrat protein.

圖5　Bmbrat蛋白在家蠶血細(xì)胞中定位分析Fig. 5 Subcellular localization of BmBrat protein was analyzed in hemocytes with immunofluorescence staining.

3　討論

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)在NCBI和家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得家蠶中Brat同源基因BmBrat。利用RACE技術(shù)得到該基因的全長(zhǎng)。通過(guò)信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白有4個(gè)相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域，從N端到C端分別是1個(gè)RING、2 個(gè)B-Box和1個(gè)BBC結(jié)構(gòu)域，具有典型的NHL結(jié)構(gòu)域，暗示其可能在細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮功能[2]。對(duì)BmBrat在家蠶胚胎時(shí)期的表達(dá)譜分析中發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)量在第4、5天達(dá)到高峰，之后逐天下降。蠶卵的催青期約需10 d，其間胚胎發(fā)育時(shí)期依次分為最長(zhǎng)期、肥厚期、突起發(fā)生期、突起發(fā)達(dá)前期、突起發(fā)達(dá)后期、縮短期、反轉(zhuǎn)期、反轉(zhuǎn)終了期、氣管顯現(xiàn)期、點(diǎn)青期、轉(zhuǎn)青期，之后便孵化收蟻[18]。其中前6天即到反轉(zhuǎn)期屬于胚胎的器官形成時(shí)期，而4、5 d時(shí)處于突起發(fā)達(dá)期和縮短期，是器官形成的高峰，這一時(shí)期該基因高表達(dá)，到了第6天后器官發(fā)育基本完成，這時(shí)該基因的表達(dá)也出現(xiàn)了顯著下降。這表明BmBrat與家蠶胚胎發(fā)育過(guò)程中器官形成有關(guān)。而5齡3 d幼蟲各組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，該基因在各組織中均有明顯表達(dá)，且在生殖腺和頭部表達(dá)量最高，這表示BmBrat在家蠶各組織的發(fā)育與生長(zhǎng)中具有一定的功能。研究表明，在果蠅中Brat在正在分化的生殖細(xì)胞中有多種功能。已知生殖干細(xì)胞的維持是受Dpp信號(hào)途徑[19]和翻譯抑制因子Nanos (Nos)/Pumilio (Pum) 所調(diào)控的[20]。在卵巢中，Pum-Nos調(diào)節(jié)Brat的mRNA水平，限制其在包囊干細(xì)胞中的表達(dá)[21]。增大Dpp信號(hào)，能夠促進(jìn)Pum-Nos對(duì)Brat mRNA生成的抑制作用[22]。在分裂過(guò)程中，Dpp信號(hào)途徑沉默，Dpp信號(hào)的減少使Nos下調(diào)，從而促進(jìn)Brat的表達(dá)，與Pum形成新的復(fù)合物抑制了Dpp信號(hào)途徑中的Mad和dMyc mRNAs，降低了包囊干細(xì)胞對(duì)Dpp信號(hào)的反應(yīng)能力，促進(jìn)細(xì)胞分化[23]，使這個(gè)子細(xì)胞變成分化的包囊干細(xì)胞，另一個(gè)子細(xì)胞繼續(xù)接受Dpp自我更新的信號(hào)[24]。家蠶BmBrat是否具有類似功能還有待進(jìn)一步研究。另外，利用我們自制的BmBrat抗體在家蠶血細(xì)胞中對(duì)BmBrat蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白只存在于部分血細(xì)胞中，且只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。家蠶血細(xì)胞有原血球細(xì)胞 (Prohemocyte)、小球細(xì)胞 (Spherule cell)、擬絳色細(xì)胞 (Oenocytoid)、顆粒細(xì)胞 (Granular cell) 和漿細(xì)胞 (Plasmatocyte) 5類[25]，BmBrat只在部分細(xì)胞中表達(dá)，其是否與血細(xì)胞的分化有關(guān)也值得進(jìn)一步研究。后續(xù)我們將利用不同種類血細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記，探索該蛋白具體存在于哪一類或幾類血細(xì)胞中，有助于更好地揭示其功能。綜上所述，BmBrat作為一個(gè)新基因至今鮮有報(bào)道，功能尚不清楚，猜測(cè)其與細(xì)胞增殖分化相關(guān)。本研究成功制備了BmBrat多克隆抗體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了抗體工具。

REFERENCES

[1] Loedige I, Filipowicz W. TRIM-NHL proteins take on miRNA regulation. Cell, 2009, 136(5): 818–820.

[2] Petrera F, Meroni G. TRIM proteins in development. Adv Exp Med Biol, 2012, 770: 131–141.

[3] Marchetti G, Reichardt I, Knoblich JA, et al. The TRIM-NHL protein Brat promotes axon maintenance by repressing src64B expression. J Neurosci, 2014, 34(41): 13855–13864.

[4] Loedige I, Stotz M, Qamar S, et al. The NHL domain of BRAT is an RNA-binding domain that directly contacts the hunchback mRNA for regulation. Genes Dev, 2014, 28(7): 749–764.

[5] Sonoda J, Wharton RP. Drosophila Brain Tumor is a translational repressor. Genes Dev, 2001, 15(6): 762–773.

[6] Lee CY, Wilkinson BD, Siegrist SE, et al. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell, 2006, 10(4): 441–449.

[7] Cotton M, Benhra N, Le Borgne R. Numb inhibits the recycling of Sanpodo in Drosophila sensory organ precursor. Curr Biol, 2013, 23(7): 581–587.

[8] Hutterer A, Knoblich JA. Numb and α-Adaptin regulate Sanpodo endocytosis to specify cell fate in Drosophila external sensory organs. EMBO Rep, 2005, 6(9): 836–842.

[9] Berdnik D, T?r?k T, González-Gaitán M, et al. The endocytic protein α-Adaptin is required for numb-mediated asymmetric cell division in Drosophila. Dev Cell, 2002, 3(2): 221–231.

[10] Wang W, Liu WK, Wang Y, et al. Notch signaling regulates neuroepithelial stem cell maintenance and neuroblast formation in Drosophila optic lobe development. Dev Biol, 2011, 350(2): 414–428.

2011年10月，我國(guó)教育部印發(fā)了《課程標(biāo)準(zhǔn)》?！墩n程標(biāo)準(zhǔn)》從基本理念、教師教育課程目標(biāo)與課程設(shè)置、實(shí)施建議三個(gè)方面對(duì)教師教育機(jī)構(gòu)設(shè)置和教師教育課程提出基本要求，為職業(yè)技術(shù)師范院校制定教師教育課程方案、開(kāi)發(fā)課程資源、實(shí)施教學(xué)與評(píng)價(jià)了提供重要依據(jù)。

[11] Reichert H. Drosophila neural stem cells: cell cycle control of self-renewal, differentiation, and termination in brain development. Results Probl Cell Differ, 2011, 53: 529–546.

[12] Sardiello M, Cairo S, Fontanella B, et al. Genomic analysis of the TRIM family reveals two groups of genes with distinct evolutionary properties. BMC Evol Biol, 2008, 8(1): 225.

[13] Liu Y, Raheja R, Yeh N, et al. TRIM3, a tumor suppressor linked to regulation of p21Waf1/Cip1. Oncogene, 2014, 33(3): 308–315.

[14] Boulay JL, Stiefel U, Taylor E, et al. Loss of heterozygosity of TRIM3 in malignant gliomas. BMC Cancer, 2009, 9(1): 71.

[15] Chen G, Kong J, Tucker-Burden C, et al. Human Brat ortholog TRIM3 is a tumor suppressor that regulates asymmetric cell division in glioblastoma. Cancer Res, 2014, 74(16): 4536–4548.

[16] Cheng DJ, Qian WL, Meng M, et al. Identification and expression profiling of the BTB domain-containing protein gene family in the silkworm, Bombyx mori. Int J Genomics, 2014, 2014: 865065.

羅惠霞, 李敏, 王玉炯. 包涵體蛋白復(fù)性的幾種方法. 生物技術(shù)通報(bào), 2007, (5): 96–98.

[18] Zhejiang Agricultural University. Sericultural Science. 2nd Ed. Beijing: China Agriculture Press, 1981: 55–60 (in Chinese).浙江農(nóng)業(yè)大學(xué). 養(yǎng)蠶學(xué). 2版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1981: 55–60.

[19] Xie T, Spradling AC. Decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell, 1998, 94(2): 251–260.

[20] Forbes A, Lehmann R. Nanos and Pumilio have critical roles in the development and function of Drosophila germline stem cells. Development, 1998, 125(4): 679–690.

[21] Muraro N I, Weston AJ, Gerber AP, et al. Pumilio binds para mRNA and requires Nanos and Brat to regulate sodium current in Drosophila motoneurons. J Neurosci, 2008, 28(9): 2099–2109.

[22] Li Y, Minor NT, Park JK, et al. Bam and Bgcn antagonize Nanos-dependent germ-line stem cell maintenance. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(23): 9304–9309.

[23] Harris E, Pargett M, Sutcliffe C, et al. Brat promotes stem cell differentiation via control of a bistable switch that restricts BMP signaling. Dev Cell, 2011, 20(1): 72–83.

[24] Ohlstein B, Mckearin D. Ectopic expression of the Drosophila Bam protein eliminates oogenic germline stem cells. Development, 1997, 124(18): 3651–3662.

[25] Beaulaton J. Hemocytes and hemocytopoiesis in silkworms. Biochimie, 1979, 61(2): 157–164.

(本文責(zé)編郝麗芳)

生物技術(shù)與方法

Cloning and characterization of BmBrat in silkworm, Bombyx mori

Hanghua Liang, Hongyan Gao, Man Xu, Peng Tan, and Hongjuan Cui
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Abstract:NHL proteins, which play important roles in regulation of cell proliferation and differentiation, have beenextensively studied on mammals. Here, we cloned a member of NHL protein family namely BmBrat in silkworm. The full-length cDNA sequence of BmBrat was obtained by means of the rapid amplification of cDNA ends (RACE), including 3 614 bp. The ORF is 2 580 bp long, encoding a protein with 859 amino acid residues. The molecular weight is 94.3 kDa and the isoelectric point (pI) is 6.65. The BmBrat expression profile was detected by RT-PCR at L5D3 larval stage, and it was expressed in all tissues, including silk gland, midgut, fat body and malpighian tubule. However, it was highly expressed in ovary and head. The expression profile was also detected at different stage of embryo development, and reached a peak at the 4th and 5th days of the embryonic period. Anti-BmBrat polyclonal antibody was generated following prokaryotic expression, protein purification and mice immunization, which is highly specific and effective for recognizing BmBrat protein through Western blotting and immunofluorescence staining. Subcellular localization of BmBrat in hemocytes revealed that it was specifically expressed in cytoplasm. This study provides a foundation for further research of the biological function of BmBrat gene.

Keywords:Bombyx mori, BmBrat gene, expression profile, antibody preparation, subcellular localization

Corresponding author:Hongjuan Cui. Tel: +86-23-68251713; Fax: +86-23-68251128; E-mail: Hongjuan.cui@gmail.com