吳瑞藍(lán)，林嘉怡，周燕芳，衷明華

（韓山師范學(xué)院，廣東潮州　521041）

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木瓜蛋白酶酶解豆渣制備鋅螯合鹽

吳瑞藍(lán)，林嘉怡，*周燕芳，*衷明華

（韓山師范學(xué)院，廣東潮州521041）

摘要：針對(duì)豆渣蛋白含量高、產(chǎn)量大而未被充分開發(fā)利用的特點(diǎn)，研究采用木瓜蛋白酶酶解豆渣以制備鋅螯合鹽，從而實(shí)現(xiàn)提高大豆加工副產(chǎn)物豆渣資源的附加值。以豆渣為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化木瓜蛋白酶的酶解工藝條件，并研究豆渣酶解物與鋅螯合制備多肽螯合鹽的工藝。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶最佳酶解條件為酶解溫度50℃，酶解時(shí)間6 h，酶添加量0.04 g，豆渣添加量5 g，并以硫酸鋅為鋅源，得到的螯合率和螯合物中的鋅含量分別為53.78%和40.00%。

關(guān)鍵詞：豆渣；木瓜蛋白酶；鋅螯合鹽

衷明華（1957—），男，碩士，教授，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。

0　引言

大豆在我國(guó)乃至世界都是最重要的植物之一，從大豆及其衍生產(chǎn)品中開發(fā)新一代補(bǔ)鋅產(chǎn)品，原料來源容易、成本低、消費(fèi)者易接受，可滿足大規(guī)模生產(chǎn)［1-2］。豆渣是生產(chǎn)豆奶或豆腐過程中的副產(chǎn)品，每年我國(guó)豆渣的產(chǎn)量都很大，因其具有較高蛋白質(zhì)含量的特點(diǎn)，被當(dāng)作飼料，用于制作糕點(diǎn)食品、健康食品以及化妝品和抗菌素原料。豆渣酶解液含有豐富的氨基酸、小肽、微量元素等多種小分子營(yíng)養(yǎng)成分，具有生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)［3-4］。其中，鋅是人體必需微量元素，參與體內(nèi)200多種金富酶的組成，是細(xì)胞內(nèi)最豐富的微量元素。因此，加強(qiáng)對(duì)豆渣的利用研究有著重要的意義。

越來越多的研究表明，多肽鋅螯合鹽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制能夠按照多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行，而非人體腸道中無機(jī)鋅鹽的吸收體制，因此氨基酸或肽的鋅螯合鹽具有更好的吸收率，生物利用率也較高。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆渣，市售；木瓜蛋白酶（10×104U/g，固體粉末）、考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白、無水硫酸鋅（ZnSO4）、95%乙醇、EDTA、檸檬酸鈉緩沖劑（pH值5）、NH3-NH4Cl緩沖液（pH值10）、絡(luò)黑T、三乙醇胺、無水乙醇、無水硫酸鎂（MgSO4），均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

2K072型電熱真空干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器公司產(chǎn)品；SDH-III型循環(huán)水式多用真空泵，上海丞明儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KA-1000型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；722SP型分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1豆渣粗蛋白含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法［5］。

1.3.2酶解液中多肽含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法［6］。

1.3.3檢測(cè)方法

（1）鋅含量的測(cè)定采用EDTA絡(luò)合滴定法［3］。按式（1）計(jì)算螯合物中鋅含量：

（2）螯合率的測(cè)定。移取10 mL待測(cè)液，加入95%乙醇沉淀（乙醇含量達(dá)到90%以上），靜置，過濾；將濾液再次濃縮后進(jìn)行乙醇沉淀（乙醇含量達(dá)到95%以上），靜置，過濾。取濾液測(cè)定游離鋅含量，按式（2）計(jì)算螯合率。

1.3.4豆渣酶解液的制備工藝流程

豆渣→加入適量木瓜蛋白酶→酶解→抽濾→離心→取上清液→測(cè)定多肽轉(zhuǎn)化率。

1.3.5單因素試驗(yàn)

木瓜蛋白酶酶解豆渣時(shí)，影響酶解反應(yīng)的主要因素有酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、豆渣添加量等。因此，試驗(yàn)以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、豆渣添加量為考察因素。

（1）最佳酶解溫度的確定。設(shè)定酶添加量0.03 g，酶解時(shí)間3 h，豆渣添加量2 g，選擇酶解溫度30，40，50，60，70℃，以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)確定最佳酶解溫度。

（2）最佳酶解時(shí)間的確定。設(shè)定酶添加量0.03 g，豆渣添加量2 g，酶解溫度60℃，選擇酶解時(shí)間為2，3，4，5，6 h，以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)確定最佳酶解時(shí)間。

（3）最佳酶添加量的確定。設(shè)定酶解時(shí)間為3 h，豆渣添加量為2 g，酶解溫度為60℃，選擇酶添加量為0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 g，以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)確定最佳酶添加量。

（4）最佳豆渣添加量的確定。設(shè)定酶添加量為0.03 g，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為60℃，選擇豆渣添加量為1，2，3，4，5 g，以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)確定最佳豆渣添加量。

1.3.6五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多肽轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，采用五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)采用L16（45）正交表。

試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1.3.7豆渣多肽鋅螯合鹽的合成工藝

表1　試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

酶解液→調(diào)整合適的螯合條件（pH值5.0、螯合溫度60℃、螯合時(shí)間40 min）→加入適量硫酸鋅（肽鋅質(zhì)量比2.25∶1）→乙醇沉淀（乙醇含量達(dá)到90%以上，靜置）→過濾→干燥。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

豆渣的粗蛋白含量為38.76%，按式（3）計(jì)算多肽轉(zhuǎn)化率：

2.1.1酶添加量對(duì)豆渣酶解液中多肽含量的影響酶添加量對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響見圖1。

圖1　酶添加量對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在豆渣添加量為2 g的條件下，加入不同量的木瓜蛋白酶，在60℃恒溫酶解3 h，測(cè)定多肽轉(zhuǎn)化率。由圖1可知，酶添加量為0.03 g的多肽含量最高。

2.1.2豆渣添加量對(duì)豆渣酶解液中多肽含量的影響

豆渣添加量對(duì)豆渣的多肽轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。

圖2　豆渣添加量對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在酶添加量為0.03 g的條件下，加入不同量的豆渣，在60℃恒溫酶解3 h，測(cè)定多肽轉(zhuǎn)化率。由圖2可知，豆渣添加量為5 g的多肽含量最高。

2.1.3酶解溫度對(duì)豆渣酶解液中多肽含量的影響

酶解溫度對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響見圖3。

圖3　酶解溫度對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響

木瓜蛋白酶的有效溫度范圍是20～80℃，由圖3可知，作用于豆渣蛋白的最佳酶解溫度是60℃。

2.1.4酶解時(shí)間對(duì)豆渣酶解液中多肽含量的影響

酶解時(shí)間對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響見圖4。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)豆渣多肽轉(zhuǎn)化率的影響

在酶添加量為0.03 g，豆渣為2 g的條件下，在60℃恒溫酶解，測(cè)定不同酶解時(shí)間的多肽轉(zhuǎn)化率。由圖4可知，酶解時(shí)間為3 h的多肽含量最高。

2.2五因素四水平正交試驗(yàn)的結(jié)果與分析

采用五因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)豆渣蛋白的酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)按L16（45）正交表填入?？刂泼附獾男Ч远嚯霓D(zhuǎn)化率為分析指標(biāo)。

2.2.1結(jié)果分析

試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

由表2可知，以試驗(yàn)為15的多肽轉(zhuǎn)化率最高，其水平組合為A4，B3，C2，D4，分別是各因素影響最大的水平。本試驗(yàn)各因素的最優(yōu)組合為A2，B4，C2，D4，對(duì)2個(gè)組合轉(zhuǎn)化率比較后得出最優(yōu)組合高于最大水平組合。而通過極差R值的大小可以看出本試驗(yàn)因素存在顯著性順序，其主次關(guān)系為C＞A＞D＞B，即影響豆渣酶解反應(yīng)的最主要因素是酶解溫度，其次是酶添加量、酶解時(shí)間、豆渣添加量。

2.2.2結(jié)果與討論

通過利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出用木瓜蛋白酶酶解豆渣時(shí)，對(duì)試驗(yàn)影響最大的因素是酶解溫度。豆渣蛋白的最佳酶解條件為酶解溫度50℃，酶添加量0.04 g，酶解時(shí)間6 h，豆渣添加量5 g。

2.3螯合率及螯合物中鋅含量的測(cè)定結(jié)果

在肽鋅質(zhì)量比為2.25∶1，pH值5.0的條件下，移取20 mL的酶解液，在60℃恒溫螯合40 min，得到的螯合率和螯合物中的鋅含量分別為53.78%和40.00%。

表2　試驗(yàn)結(jié)果與分析

3　結(jié)論

本試驗(yàn)選用豆渣進(jìn)行酶解得到多肽液，并與鋅進(jìn)行螯合，得到新一代的補(bǔ)鋅產(chǎn)品多肽鋅螯合鹽。通過單因素試驗(yàn)和五因素四水平正交優(yōu)化試驗(yàn)，得到木瓜蛋白酶酶解豆渣的最佳酶解條件為酶解溫度50℃，酶添加量0.04 g，酶解時(shí)間6 h，豆渣添加量5 g。在螯合溫度為60℃，pH值為5.0，螯合時(shí)間為40 min，肽鋅比為2.25∶1的條件下，測(cè)得的螯合率為53.78%，螯合物中鋅含量為40.00%。

參考文獻(xiàn)：

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Enzymatic Hydrolysis of Soybean Dregs by Papain to Prepare Zinc Chelate Salt

WU Ruilan，LIN Jiayi，*ZHOU Yanfang，*ZHONG Minghua
（Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong 521041，China）

Abstract：Bean dregs protein content is high，large output without being fully exploited the characteristics of study papain bean dregs to prepare a zinc chelate salt，in order to achieve increase the added value of soybean byproducts bean dregs resources.The bean dregs as the raw material，through a single factor test and orthogonal test conditions papain enzyme and research bean dregs hydrolysates and polypeptides chelated zinc chelate salt preparation of process.The results show that papain optimum conditions for hydrolysis temperature 50℃，time 6 h，enzyme dosage 0.04 g，bean dregs quality 5 g，zinc sulfate and zinc source，chelating rate and chelate zinc content are obtained 53.78%and 40.00%.

Key words：bean dregs；papain；zinc chelate salt

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.05.033

文章編號(hào)：1671-9646（2016）05b-0016-03

收稿日期：2016-03-31

作者簡(jiǎn)介：吳瑞藍(lán)（1994—），女，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與開發(fā)。

*通訊作者：周燕芳（1979—），女，本科，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與開發(fā)；