張虹 崢嶸

（內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特 010022）

球根白絲膜菌γ-actin基因的克隆及表達分析

張虹 崢嶸

（內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特 010022）

根據(jù)真菌肌動蛋白（actin）基因保守區(qū)序列設計引物，用簡并PCR法和RACE技術分離得到球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）γ-肌動蛋白基因（Lb-act）的全長cDNA序列。該序列全長為1 357 bp，包含一個1 137 bp的開放閱讀框（ORF），編碼378個氨基酸，5'端非翻譯區(qū)（5' UTR）92 bp，3' UTR長度128 bp。Port Param軟件在線分析結果表明，該cDNA所編碼的蛋白質理論等電點為5.12，相對分子質量為95.022 kD，具有真菌γ-actin基因3個保守特征序列。Blast同源性檢索結果表明，Lb-act氨基酸序列與擔子菌肌動蛋白序列有較高的相似性，其與雙色蠟蘑的肌動蛋白氨基酸序列的親緣關系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培養(yǎng)條件下表達量基本一致，驗證了該基因作為分子內標的可靠性。

球根白絲膜菌；肌動蛋白；cDNA；克隆

肌動蛋白（Actin）是真核生物細胞中普遍存在的重要蛋白質，構成細胞骨架中的微絲（microfilament）系統(tǒng)。作為構成細胞骨架微絲系統(tǒng)的基本組分，肌動蛋白起著重要作用，如參與細胞分裂、細胞器運動、細胞形態(tài)維持、細胞極性的建成、細胞壁沉積以及細胞伸長等生命活動［1，2］。該蛋白主要包括α-actin、β-actin 和γ-actin 3種類型，其中，α-actin通常存在于平滑肌細胞中，而β-actin和γ-actin則幾乎在所有細胞中存在。目前在高等真核生物中已報道了多個不同的actin基因，在真菌中報道較多的是γ-actin基因［3］。actin基因在各組織和細胞中的表達相對恒定，是高度保守的管家基因，因此，通常在實時定量PCR中作為內參基因。此外，actin基因現(xiàn)已在植物界、動物界和真菌界作為分子系統(tǒng)學研究的重要基因之一［4］。

球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）隸屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina）、傘菌目（Agaricales）、絲膜菌科（Cortinariaceae）、白絲膜菌屬（Leucocortinarius），分布于黑龍江、甘肅、吉林、內蒙古等地［5］。球根白絲膜菌可以食用，具有廣闊的經濟用途，并且球根白絲膜菌侵染油松，能與油松形成典型的外生菌根［6］，對油松生長有顯著的促進作用，菌根形成后不僅可以有效提高寄主植物耐干旱性［7，8］、抗重金屬性［9］、促進植物在鹽漬環(huán)境下的生長［10］，而且能夠顯著提高油松的抗旱能力。前人研究僅揭示菌根真菌影響植物抗逆性的一些現(xiàn)象，但本質上菌根真菌對于植物抗逆性的調節(jié)是基于對相關基因表達的調控，即通過上調或下調某些基因的表達以及誘導新的逆境基因表達來增強植物抗逆性［11］，菌根同時能增強植物的防病、抗病能力［12］。球根白絲膜菌功能基因的研究需要一個表達量相對恒定的內參基因，actin基因被證明在逆境脅迫條件下表達量相對恒定［13］，也經常作為內參應用于植物抗旱基因。

由于受全球環(huán)境變化的影響，內蒙古大青山降水量逐年下降，干旱導致的大量菌根真菌喪失，在常規(guī)造林的過程中使其自然感染菌根真菌比較困難，人為菌根化苗木的培育顯得十分重要，因此，利用球根白絲膜菌侵染油松等植物提高寄主植物的抗干旱性，對于提高造林成活率、提高林地肥力利用率及促進貧瘠林地上的林木生長有著十分重要的意義，在我國廣大西部干旱區(qū)篩選不同樹種的優(yōu)良菌根真菌是實現(xiàn)菌根化苗木造林的重要技術基礎［14］。而有關球根白絲膜菌菌絲體方面研究報道較少，盧麗君［15］報道了其在不同培養(yǎng)基和pH值培養(yǎng)條件下生長特性的研究，邰圖雅［16］報道了其分離及培養(yǎng)特性的研究。迄今為止，關于球根白絲膜菌的actin基因研究還未見報道，因此，本研究以球根白絲膜菌菌絲體培養(yǎng)物為材料，用簡并PCR法和RACE技術克隆球根白絲膜菌γ-actin cDNA，分析其在不同培養(yǎng)條件下的表達，并驗證其作為內標基因的可靠性，旨在為探究球根白絲膜菌與油松菌根共生體的抗逆性相關基因表達和調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及試劑 球根白絲膜菌通過子實體組織分離獲得，現(xiàn)保存于內蒙古農業(yè)大學林學院微生物實驗室。EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；GoldScript cDNA合成試劑盒（Invitrogen）；MidiPurification Kit 離心柱型普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根公司）；5' RACE 試劑盒（Invitrogen）；SMAR TerTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒（Clontech）；Taq DNA 聚合酶（TaKaRa）；克隆載體pMD19-T（TaKaRa）；感受態(tài)大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α（TaKaRa）。

1.1.2 引物 根據(jù)已知真菌的肌動蛋白基因序列，在其保守區(qū)域設計簡并引物Lb-actF和Lb-actR，利用簡并PCR擴增球根白絲膜菌γ-actin cDNA核心片段；根據(jù)分離得到的核心片段序列，設計該基因的特異性引物GSP-1、GSP-2、GSP-3和GSP-4、GSP-5，用于5'和3'-RACE-PCR，引物由上海生工生物技術公司合成（表1）。

表1 球根白絲膜菌γ-actin基因cDNA克隆引物序列

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 采用RNA提取試劑盒提取球根白絲膜菌總RNA，利用紫外分光光度計測定其純度和濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳進行濃度和完整性檢測。利用GoldScript cDNA合成試劑盒合成第一鏈cDNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 球根白絲膜菌γ-actin cDNA全長擴增及產物克隆、測序 核心片段擴增，以cDNA 為模板進行RT-PCR擴增。反應體系（總體積50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL，2 mmol/L dNTPs 3 μL，10 μmol/L 的上游和下游引物各2 μL，cDNA（約30 ng）5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，去離子水32.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，將目的DNA片段用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化。

5'-RACE擴增基因末端，采用5'-RACE試劑盒克隆球根白絲膜菌總γ-actin基因的5'端序列。參照試劑盒說明，對總RNA進行目的基因第1鏈cDNA的合成，純化后，對cDNA末端加上多聚C。用引物GSP-2和試劑盒內的橋連鉚釘引物AAP對已經加dC尾的cDNA進行PCR第1輪擴增。PCR反應體系：加dC尾的cDNA 5.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L的引物GSP-2和橋連鉚釘引物AAP各2.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，無菌去離子水補至50 μL。PCR反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。用引物GSP-3和試劑盒內的橋連通用擴增引物AUAP進行第2輪巢式PCR擴增。PCR反應體系：第1輪PCR產物5.0 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，10 mmol/L dNTPs 1.0 μL，10 μmol/L的引物GSP-3和引物AUAP各1.0 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，無菌去離子水補至50 μL。反應程序同上。將第2 輪PCR產物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化。

3'-RACE 擴增基因末端，參照RACE 試劑盒說明書，使用逆轉錄酶SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3' CDS primer A對總RNA進行逆轉錄合成cDNA。以上述合成的cDNA為模板，用引物GSP-4和UPM進行第1輪PCR擴增。反應體系：cDNA 2.5 μL，引物各1 μL，Maser Mix 41.5 μL，無菌去離子水補至50 μL，降落PCR反應程序：94℃30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán)；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃3 min，27個循環(huán)。將第1輪PCR擴增產物稀釋50倍，用引物GSP-5和UPM進行第2 輪PCR擴增，反應體系同上。PCR反應程序：94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，20個循環(huán)。將第2輪PCR產物進行電泳，并對目的條帶進行切膠回收純化。將上述3個純化后的PCR產物分別與pMD19-T連接，轉化到感受態(tài)細胞大腸埃希菌DH5α，菌落PCR檢測陽性克隆后送至上海生工生物技術有限公司進行測序。

將上述3個純化后的PCR產物與pMD19-T連接，轉化到感受態(tài)細胞大腸埃希菌DH5α，菌落PCR檢測陽性克隆后送至上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 球根白絲膜菌γ-actin表達分析 分別在不同碳源、磷水平條件下培養(yǎng)球根白絲膜菌菌絲體，進行其γ-actin的表達特異性分析。PACH培養(yǎng)基中分別選用不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、D-山梨醇、可溶性淀粉）；用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mmol/L 6個水平磷（KH2PO4）濃度，28℃培養(yǎng)菌絲體20 d后提取菌絲體總RNA。以等量的RNA反轉錄cDNA，取等量cDNA進行RT-PCR反應，再取等量的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經過3次重復，通過比較目的條帶的灰度判定基因表達的強弱。

1.2.4 序列比較與系統(tǒng)進化樹構建 根據(jù)獲得的mRNA拼接序列，網上Blast搜索同源性高的序列，進行同源性分析。利用NCBI的OFR Finder（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf /gorf. Html）識別OFR（open reading frame）序列并推定其所對應的氨基酸序列。使用ExPASy數(shù)據(jù)庫的PortParam軟件在線（http:// www.expasy.org /tools /protparam.html）分析推定蛋白質基本性質。利用NCBI保守結構域搜索（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），分析蛋白質的保守結構域。在GenBank中，搜索不同真菌的肌動蛋白序列，與球根白絲膜菌肌動蛋白序列進行Clustal W多重序列比較，使用MEGA5軟件鄰接法（Neighbor-Joining，NJ法）運算1 000次構建系統(tǒng)進化樹，用自展法（Bootstraping）對進化樹進行評估。

2 結果

2.1 總RNA的檢測結果

取10 μL RNA樣液，稀釋100倍，在核酸蛋白測定儀（Eppendrof BioPhotometer）中進行檢測，OD260/OD280為 1.94-1.96，OD260/OD230為 2.45-2.60，說明RNA純度高，無蛋白質、酚污染，均一性很好。電泳結果（圖1）表明，28S rRNA、18S rRNA與5S rRNA帶形整齊，無拖尾，說明RNA完整性很好，點樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染，證明提取的RNA質量較高，可以用于后續(xù)的RT-PCR。

圖1 球根白絲膜菌RNA電泳結果

2.2 cDNA全長的分析

用簡并PCR法擴增出球根白絲膜菌肌動蛋白基因核心片段，結果（圖2-A）顯示，在標準分子質量1 kb處出現(xiàn)較亮的DNA條帶，大小基本接近目的條帶。圖2-B和2-C顯示，分別在250 bp處出現(xiàn)了較亮的條帶，表明5'和3'末端片段大小分別為200-250 bp和250-500 bp。將測序結果經過全長拼接，球根白絲膜菌肌動蛋白基因的cDNA全長序列除1 137 bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。還包含5'端92 bp的非編碼片段和3'端128 bp的非編碼片段，同時3'端有一個27個核苷酸的polyA尾，將其命名為Lb-act，cDNA全長序列提交GenBank，登錄號為KC995173。

圖2 簡并PCR及RACE-PCR產物凝膠電泳

2.3 氨基酸序列分析

Lb-act編碼378個氨基酸，理論分子質量大小為95.022 kD，理論等電點是5.12；根據(jù)Lb-act氨基酸序列，Blast搜索出12 種同源性高的序列，其中，Lb-act氨基酸序列與擔子菌肌動蛋白序列有較高的相似性。該序列與Punctularia strigosozonata、裂褶菌（Schizophyllum commune）、粗毛硬革菌（Stereum hirsutum）、雙色蠟蘑（Laccaria bicolor）4 種真菌的肌動蛋白氨基酸序列（EIN04355、XP003026150、EIM-85406和XP001884444）相似性最高，達99%，其次與嗜藍孢孔菌屬的Fomitiporia mediterranea、雙孢蘑菇（Agaricus bisporusva）、干朽菌（Serpula lacrymans）、毒蠅傘（Amanita muscaria）4 種真菌的肌動蛋白氨基酸序列（EKM82128、EJD00785、ABQ17974和EGO04181）相似性達98%，與原毛平革菌屬（Phanerochaete）的Phanerochaete carnosa、皺木耳（Auricularia delicate）、乳牛肝菌等真菌的肌動蛋白氨基酸序列（EKM59011、EJD35981和AF156258）相似性達97%。

圖3 不同碳源培養(yǎng)條件下Lb-act的表達

圖4 不同磷水平下Lb-act的表達

2.4 不同碳源和磷水平培養(yǎng)條件下表達特性及穩(wěn)定性分析

半定量PCR 分析結果（圖3，圖4）顯示，不論是單糖葡萄糖，還是雙糖麥芽糖和蔗糖，多糖可溶性淀粉以及醇類物質D-山梨醇，還是在不同磷水平條件下Lb-act基因均表達，且表達量基本一致，表明該基因的表達不受外界碳源和磷水平變化的影響。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

為進一步探討球根白絲膜菌肌動蛋白與其他擔子菌（包括腐生型和外生菌根真菌）、叢枝菌根真菌（AMF）和子囊菌肌動蛋白在分子系統(tǒng)學上親緣關系，根據(jù)Lb-act蛋白序列，在 GenBank中搜索并參考卓侃等［3］報道，獲得16種真菌的肌動蛋白序列。利用MEGA5.0軟件，通過N-J法運算1 000次，獲得了球根白絲膜菌與上述15種真菌的肌動蛋白系統(tǒng)進化樹（圖5）。

圖5 16種真菌的肌動蛋白系統(tǒng)進化樹

從系統(tǒng)進化樹可以看出，上述16種肌動蛋白序列聚類為擔子菌、AM真菌和子囊菌3個分化群。本研究的球根白絲膜菌肌動蛋白聚在擔子菌分化群，與雙色蠟蘑聚為一支，其親緣關系最近，接著與毒蠅傘、粘蓋牛肝菌的肌動蛋白親緣關系近，與灰擬鬼傘和黃孢原毛平革菌的肌動蛋白親緣關系較遠。這在一定程度上可以說明能夠形成外生菌根的真菌肌動蛋白相似性較高。本系統(tǒng)進化樹中的AM真菌肌動蛋白由2個次級分化群組成，光壁無梗囊霉與Funneliformis caledonium聚為一支，珍珠巨孢囊霉與雙紫盾巨孢囊霉聚為其姊妹支。子囊菌肌動蛋白由2個次級分化群組成。

3 討論

肌動蛋白是真核生物細胞中普遍存在的最保守的古老蛋白之一，在進化上具有高度的保守性［17］。本研究通過簡并PCR法和RACE技術首次克隆了球根白絲膜菌γ-肌動蛋白的cDNA 全長序列，其具有actin基因的保守特征序列，與前人報道的真菌γ-actin基因特征一致［18］。 許多研究結果表明不同的生物中肌動蛋白的數(shù)目變化很大［19］，除了大多數(shù)酵母菌和絲狀子囊菌只有1個單一的肌動蛋白基因外，其他真菌有少數(shù)肌動蛋白基因［20］。從外生菌根真菌乳牛肝菌克隆得到2個肌動蛋白基因，并通過實驗證實其肌動蛋白基因在營養(yǎng)菌絲及與宿主植物形成的菌根共生體中表達恒定［21］，一個理想的內參基因應該是穩(wěn)定的表達于不同類型的細胞和組織中，且表達量是無顯著差別的［22］，本實驗也得到相同結果，在不同碳源和磷水平培養(yǎng)條件下，Lb-act表達恒定。16種真菌actin基因氨基酸序列同源性比對分析表明，球根白絲膜菌與其它15種真菌的Actin的氨基酸序列僅在少數(shù)位點上有差異，由此說明Actin在氨基酸序列水平上具有高度的同源性［23］，進一步證明actin基因是高度保守的看家基因。因此，本實驗獲得的Lb-act可為將來球根白絲膜菌-油松菌根共生體功能基因的研究奠定基礎。

由于肌動蛋白基因在進化上的保守性，常被用于構建物種和基因系統(tǒng)進化樹，以衡量不同物種之間的親緣關系和分化時間［24］。本研究構建的肌動蛋白系統(tǒng)進化樹中16種不同真菌肌動蛋白聚為擔子菌、AM真菌和子囊菌3個分化群，這一聚類結果與傳統(tǒng)形態(tài)分類結果一致。另外，有學者認為擔子菌是由子囊菌進化而來［25］，但在該進化樹中，擔子菌與子囊菌親緣關系并不是最近，盡管不斷發(fā)現(xiàn)的分子特征給真菌系統(tǒng)學的研究提供了新的信息，但分子系統(tǒng)學并不能解決所有與生物系統(tǒng)發(fā)育有關的問題，因為分子本身也存在一定的局限性，某一特定的分子信息可能缺乏解決真菌某一類群系統(tǒng)發(fā)育歷史所必需的一些性狀［26］，因此γ-actin基因能否反映較低分類階元，如屬級階元物種的分類進化關系及子囊菌與擔子菌的系統(tǒng)進化關系有待更多物種γ-actin基因的獲得來進一步驗證。根據(jù)肌動蛋白基因序列構建的系統(tǒng)進化樹還只是基因的分子進化樹，雖然在區(qū)分親緣關系較遠的物種時具有一定的參考價值，但對具較近親緣關系的物種則無法做出精確衡量。完善的物種進化樹有待于今后更多肌動蛋白基因的發(fā)現(xiàn)和系統(tǒng)進化分析方法的改進。將球根白絲膜菌Lb-act蛋白序列與Blast搜索出的高同源性序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)，該序列與多種擔子菌肌動蛋白氨基酸序列高度相似，由聚類圖可知，球根白絲膜菌與雙色蠟蘑親緣關系最近，但這兩種菌形態(tài)及分類地位差異較大。在肌動蛋白序列分析中不同目真菌聚為一類，一方面可能表明其肌動蛋白在進化上具有高度保守性，另一方面可能與外生菌根真菌本身的進化有關，這些疑問是今后關注的熱點。本聚類結果在肌動蛋白序列上初步分析了球根白絲膜菌與其他15種真菌間的相互關系，但由于未搜索到更多真菌肌動蛋白基因方面的信息，不能在較低的分類階元更好地反映球根白絲膜菌的分類進化地位，因此球根白絲膜菌與其他真菌間的親緣關系有待于更進一步的研究。

4 結論

球根白絲膜菌肌動蛋白基因的cDNA全長序列除1 137 bp的開放閱讀框（ORF）外，還包含5'端 92 bp的非編碼片段和3'端128 bp的非編碼片段，同時3'端有一個27個核苷酸的polyA尾，將其命名為Lb-act，Lb-act氨基酸序列與擔子菌肌動蛋白序列有較高的相似性，該基因在不同碳源和磷水平條件下表達恒定，可作為內參基因，cDNA全長序列提交GenBank，登錄號為KC995173。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of γ-actin Gene from Leucocortinarius bulbiger

ZHANG Hong ZHENG Rong
（College of Life Sciences and Technology，Inner Mongolia Normal University，Hohhot 010022）

Designing the primers based on the conserved sequences of several fungal actin genes，the full-length cDNA sequence of γ-actin gene from Leucocortinarius bulbiger（Lb-act）was cloned using RT-PCR and RACE. The full-length of Lb-act cDNA sequence was 1 357 bp，consisting of a 1 137 bp open reading frame（ORF），encoding a protein of 378 amino acids，a 5'-UTR with 92 bp and a 3'-UTR with 128 bp. The online analysis by Port Param software revealed that the putative amino acids had an isoelectric point of 5.12，a molecular weight of 95.022 kD，and 3 highly conserved regions of fungal γ-actin gene. Blast homology search indicated that the sequences of Lb-act amino acid had a high similarity with the sequences of Basidiomycetes actin，and it had the closest relationship with the amino acid sequence of Laccaria bicolor actin. In culture conditions of different carbon and phosphorus levels，the expression levels of Lb-act were almost the same，thus this research confirmed the reliability that actin gene could be used as intermolecular standard.

Leucocortinarius bulbiger；actin gene；cDNA；clone

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.020

2015-12-25

國家自然科學基金項目（31060110，31360125），內蒙古自然科學基金項目（2012MS0526）

張虹，女，碩士研究生，研究方向：菌根生物技術；E-mail：944434952@qq.com

崢嶸，女，博士，研究方向：菌根生物技術；E-mail：zhengrong09@163.com