彭 梅，李貴森

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科暨腎臟病研究所，四川 成都 610072)

TRPC6基因突變致局灶節(jié)段性腎小球硬化的研究進(jìn)展

彭 梅1，2，李貴森2△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科暨腎臟病研究所，四川 成都 610072)

局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是激素耐藥型腎病綜合征的主要病因，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。關(guān)鍵的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白基因突變常常導(dǎo)致遺傳性FSGS，如裂孔隔膜(SD)的瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(TRPC6)即為其中之一。TRPC6基因突變可以導(dǎo)致細(xì)胞鈣內(nèi)流增加促使FSGS 的發(fā)生?，F(xiàn)就TRPC6基因突變致FSGS發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

局灶節(jié)段性腎小球硬化；TRPC6；突變；發(fā)病機(jī)制

局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)是腎病綜合征常見的原因之一，也是導(dǎo)致激素抵抗型腎病綜合征主要病因之一，預(yù)后較差，可迅速進(jìn)展為終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)[1～3]。近年來FSGS發(fā)病呈上升趨勢，占我國腎活檢中原發(fā)性腎小球疾病的比例為6%～12%，是兒童及中青年ESRD的主要原因之一[2，4，5]。FSGS是以局灶節(jié)段分布的腎小球硬化為基本病理改變的一組腎小球病變[6，7]，病因包括原發(fā)性、繼發(fā)性和遺傳性。遺傳性FSGS也叫家族性FSGS。目前認(rèn)為，不論是家族性FSGS，還是散發(fā)性FSGS，遺傳因素在其發(fā)病中可能都起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)FSGS可以表現(xiàn)為明顯的家族聚集性和種族差異，例如非洲裔美國人的發(fā)病率明顯高于高加索人[8～10]。1992年Mathis等[11]首先報道FSGS可以表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳模式。Brown等[12]在此基礎(chǔ)上克隆出第一個FSGS的致病基因ACTN4，其編碼的蛋白為α輔肌動蛋白4(α-actinin 4)。此后越來越多的FSGS 致病基因被克隆，迄今已發(fā)現(xiàn)數(shù)十余種基因突變參與FSGS的發(fā)病，包括TRPC6，INF2等[8，10，13～16]。這些基因突變的深入研究，對進(jìn)一步闡明FSGS的發(fā)病機(jī)制具有重要作用。Winn等[17]首先從家族性FSGS患者中克隆出了一個導(dǎo)致家族性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)的新基因--TRPC6，其編碼蛋白瞬時受體電位陽離子通道蛋白(transient receptor potential cation channel 6，TRPC6)是一個非選擇性陽離子通道，在足細(xì)胞表達(dá)，與裂孔隔膜分子Nephrin以及Podocin間存在相互作用，共同參與足細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞極化和穩(wěn)定骨架結(jié)構(gòu)等生理功能[18]。因此，認(rèn)識該基因、篩查可能存在的突變以及進(jìn)一步研究該基因的功能將對探討FSGS的發(fā)病機(jī)制以及防治具有重要意義。本文著重介紹TRPC6致FSGS基因突變種類研究，為進(jìn)一步探究其致FSGS的發(fā)病機(jī)制及防治提供理論基礎(chǔ)。

1 TRPC6相關(guān)基因突變研究

1.1 基本概述 瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜上的鈣通道，在各種生物細(xì)胞中有著廣泛的表達(dá)。哺乳動物TRP通道蛋白包括6個關(guān)聯(lián)的蛋白家族:TRPC、TRPV、TRPM、TRPP、TRPN以及TRPML，其中每個家族又有許多亞型。TRPC是TRP家族的主要成員之一，它的激活機(jī)制依賴于磷脂酶C(phospholipase C，PLC)信號通路，被認(rèn)為是最可能的鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。鈣離子是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，廣泛存在于從細(xì)菌到特殊神經(jīng)元等各類細(xì)胞中，在哺乳動物機(jī)體內(nèi)有廣泛表達(dá)[19]。TRPC包括7個亞家族，即TRPC1～7，其中TRPC3和TRPC6在TRPC亞家族中比較有代表性[20～22]，也是目前國際研究中較受關(guān)注的2個亞型。人TRPC6 定位于染色體11q21～q22，共132365個堿基(GeneBank:NG_011476)，含13個外顯子[23]。TRPC6的編碼蛋白是一個含有931個氨基酸的通道蛋白，為6次跨膜蛋白，其N端和C端均在胞內(nèi)，由第5和第6跨膜結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成非選擇性陽離子通道[24]。

1.2 突變種類 近年的研究陸續(xù)報道一些新的TRPC6突變與FSGS發(fā)病相關(guān)以來，迄今為止，已經(jīng)證實15種TRPC6 基因突變參與FSGS發(fā)病(圖1)。其中，3個突變(G109S、P112Q、N125S)位于第1個錨蛋白重復(fù)區(qū)域(ankyrin repeat，ANK)區(qū)域，2個突變(M132T、N143S)位于ANK2區(qū)域，1個突變(R175Q)在ANK3區(qū)域，1個突變(H218L)位于ANK4區(qū)域，另外2個突變(S270T、L395A)位于細(xì)胞質(zhì)N-末端[17，25～29]；余下6個突變(L780P、K874X、Q889K、R895C、R895L、E897K)位于細(xì)胞質(zhì)C-末端[17，26，27，30]。

圖1 FSGS相關(guān)的TRPC6基因突變

2 TRPC6突變致FSGS發(fā)病的機(jī)制

2.1 TRPC6突變影響鈣離子信號通路傳導(dǎo) 2005年Winn等[17]首先發(fā)現(xiàn)P112Q突變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、鈣離子峰濃度、細(xì)胞電流及TRPC6蛋白表達(dá)較突變型較野生型明顯升高。目前，通過電生理現(xiàn)象和/或細(xì)胞內(nèi)Ca2+測量，上述15種TRPC6基因突變中的10個突變(P112Q、N143S、R895C、E897K、Q889K、M132T、N125S、H218L、R895L、R175Q突變)均可以導(dǎo)致鈣通道活性增加。因此，TRPC6通道是最可能的鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道。TRPC6基因突變可以影響TRPC6的Ca2+通道活性，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，從而激活Ca2+依賴信號通路，最終導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。

TRP通道與多種生物功能有關(guān)，如細(xì)胞生長、離子平衡、機(jī)械感受和依賴PLC的鈣內(nèi)流等[17]；鈣作為第二信使可以影響細(xì)胞內(nèi)上述的大多數(shù)功能[17，31]。血管緊張素II通過AT1受體，在包括FSGS在內(nèi)的一些腎臟疾病的損傷過程中(如蛋白尿的產(chǎn)生及腎臟損傷的進(jìn)展)起著關(guān)鍵作用[17，32]。AT1受體與異源三聚體鳥嘌呤核苷酸-G蛋白結(jié)合，激活磷脂酶C-β(PLC-β)，水解磷脂酰肌醇異構(gòu)體4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，產(chǎn)生三磷酸肌醇(InsP3)和二酰甘油(DAG)。InsP3可迅速地從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)向胞質(zhì)溶膠中擴(kuò)散，一方面打開細(xì)胞膜上的鈣通道使Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，另一方面開啟細(xì)胞內(nèi)鈣池(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))增加Ca2+的釋放；同時DAG也促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，即InsP3和DAG兩者協(xié)同提高胞內(nèi)游離鈣的濃度。胞質(zhì)Ca2+含量的上升，激活一種稱為鈣調(diào)蛋白的Ca2+結(jié)合蛋白，后者可調(diào)節(jié)其他酶類的活性，并最終導(dǎo)致鈣調(diào)磷酸酶(CaN)的激活[17，33]。Santin等[26]在兒童和成人的非家族性FSGS中究發(fā)現(xiàn)的G109S、N125S、L780P突變均為錯義突變。，研究發(fā)現(xiàn)有此3種基因突變的患者對鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(CNI)有較好的療效也進(jìn)一步證明TRPC6突變可能使鈣信號增加，激活CaN，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，破壞了足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架[34]，同時阻斷CaN活性可能改善蛋白尿，這與臨床上使用環(huán)孢素、他克莫司等鈣調(diào)磷酸酶抑制劑后部分TRPC6基因突變的FSGS患者蛋白尿獲得明顯緩解的一致性進(jìn)一步證實上述可能。由此可見，TRPC6突變在鈣信號通路傳導(dǎo)中發(fā)揮非常重要的作用。

2.2 突變影響CaN-NFAT信號通路 活化細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于機(jī)體的免疫及非免疫細(xì)胞，其活性受鈣離子依賴性的CaN的調(diào)節(jié)，主要通過受體-Ca-CaN信號途徑被激活，從而發(fā)生其基因調(diào)控功能。Koitabashi等[35]研究發(fā)現(xiàn)二脂酰甘油(DAG)激活TRPC6通道上的Gq蛋白偶聯(lián)受體，導(dǎo)致Ca2+進(jìn)入鈣池，鈣離子內(nèi)流可激活絲氨酸-蘇氨酸-CaN，這可以使NFAT家族的轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化，去磷酸化NFAT入核，進(jìn)一步激活某一基因程序，提供正反饋回路，進(jìn)一步刺激TRPC6電流和相關(guān)的信號。另外，Schl?ndorff等[36]提出TRPC6突變相關(guān)的FSGS是由于CaN-NFAT信號途徑的激活并證實了以往報道的P112Q、R895C和E897K突變能夠顯著地刺激NFAT活化，說明FSGS TRPC6突變的確增強(qiáng)NFAT活化；該研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)孢霉素A及FK506抑制TRPC6介導(dǎo)的NFAT活化，這與Gigante等[27]報道的臨床表現(xiàn)為SRNS的H218L突變患兒，對鈣調(diào)磷酸酶抑制劑治療敏感表現(xiàn)一致。以上信息說明CaN-NFAT信號通路在調(diào)節(jié)腎小球功能方面具有非常重要的作用。也為這些FSGS患者發(fā)病機(jī)理及未來的治療提供重要的線索。

2.3 突變致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能改變 已經(jīng)報道TRPC6 mRNA在多種組織中表達(dá)，包括腎臟、腦、肺、卵巢等[17，37～39]。Winn等用針對人TRPC6的抗體證實TRPC6在腎小球和腎小管均有表達(dá)，進(jìn)一步的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)實驗表明TRPC6 mRNA在腎小球和腎小管彌漫性表達(dá)，與免疫熒光染色幾乎相同。Reiser等[25]應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記顯示在足細(xì)胞TRPC6與Nephrin、Podocin和CD2AP存在共定位分布，免疫沉淀結(jié)果還提示TRPC6與Nephrin、Podocin有相互作用，而與CD2AP間無相互作用。此外，他們還發(fā)現(xiàn)Nephrin敲除小鼠足細(xì)胞內(nèi)TRPC6表達(dá)增加而且分布也發(fā)生了改變，呈顆粒聚集樣表現(xiàn)，這提示Nephrin缺失誘發(fā)了TRPC6表達(dá)的增加和分布的改變。另有研究[27]發(fā)現(xiàn)H218L、R895L突變型患者腎小球的TRPC6表達(dá)明顯上調(diào)，nephrin表達(dá)卻明顯下調(diào)，同時觀察到nephrin的蛋白質(zhì)沿毛細(xì)血管袢不規(guī)則分布；其中表現(xiàn)為R895L突變的塌陷型患兒的TRPC6在新月形上皮細(xì)胞明顯上調(diào)。以上事實表明TRPC6屬于裂孔隔膜蛋白，它與Nephrin、Podocin等重要的裂孔隔膜分子共同組成一個信號傳導(dǎo)復(fù)合物以維持足突和裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。TRPC6突變導(dǎo)致足細(xì)胞鈣內(nèi)流而引起細(xì)胞骨架過度收縮，使得細(xì)胞骨架對腎小球濾過靜水壓作出失適應(yīng)性反應(yīng)，最終引起足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損；TRPC6突變蛋白與Nephrin、Podocin等裂孔隔膜分子相互作用發(fā)生紊亂，從而干擾了由它們所組成的裂孔隔膜信號復(fù)合體的功能，最終導(dǎo)致足細(xì)胞不能維持正常的生物學(xué)功能。

3 TRPC6突變所致FSGS臨床特征分析

TRPC6基因突變在FSGS患者中的發(fā)生情況還不太清楚，不同研究報道的差異較明顯。我們總結(jié)了目前所報道的家族性FSGS和散發(fā)性FSGS患者中TRPC6突變的情況，見表1。根據(jù)家族史分析，所有家系的遺傳方式均為常染色體顯性遺傳，每個氨基酸的取代均為進(jìn)化上的高度保守的殘基。存在攜帶有TRPC6突變但無臨床表現(xiàn)的個體。中國TRPC6突變占家族性FSGS的比例約3.2%，其他種族約為7%。這些家族患病個體在30～40歲開始出現(xiàn)大量蛋白尿，其中大約60%進(jìn)展為ESRD，從開始出現(xiàn)臨床表現(xiàn)至進(jìn)展為ESRD時間約為10年?；颊吣I臟病理表現(xiàn)多為FSGS。散發(fā)性FSGS患者無特異性表現(xiàn)。M132T突變是首次報道的可以導(dǎo)致早發(fā)型的FSGS，早發(fā)型FSGS多表現(xiàn)為早發(fā)(最小發(fā)病年齡為1歲)和SRNS，但對鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(如環(huán)孢素A、FK506)治療敏感；其中早發(fā)型FSGS腎臟活檢為塌陷型的腎小球硬化患者可迅速進(jìn)展為ESRD。

表1 TRPC6基因突變致FSGS臨床總結(jié)

注:家系研究的例數(shù)是指研究所納入的家系數(shù)；家系中的突變陽性率指所有家系中發(fā)生突變的家系數(shù)。

目前有關(guān)TRPC6基因突變的研究取得較大進(jìn)展，但是TRPC6基因突變與FSGS的確切發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚，需要更多的體外功能試驗甚至建立動物模型試驗來明確，同時FSGS的進(jìn)一步防治也需要進(jìn)一步探索。

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Mutations of TRPC6 and pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis

PENG Mei1，2，LI Gui-sen2

四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊基金資助項目(編號:2015TD0013)

R692.6

B

1672-6170(2016)03-0170-04

2015-09-28；

2015-11-30)

△通訊作者