金日生， 徐冰彥，袁傳勛*

(1.合肥工業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009;2.中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，江蘇南京 210042)

響應面法優(yōu)化酶法提取油茶籽餅粕多糖工藝

金日生1,2， 徐冰彥1，袁傳勛1*

(1.合肥工業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230009;2.中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，江蘇南京 210042)

摘要[目的]提高油茶籽餅粕多糖的提取率。[方法]以榨油后的油茶籽餅粕為原料，利用酶水解與傳統(tǒng)熱水浸提相結合的方法提取油茶籽餅粕多糖?？疾炝酥行缘鞍酌?、纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶對油茶籽餅粕多糖提取率的影響，對提取工藝中酶解溫度、酶解時間、酶添加量分別進行單因素試驗，在此基礎上利用3因素3水平的響應面法優(yōu)化工藝參數(shù)。[結果]中性蛋白酶法提取油茶籽餅粕多糖的酶解最佳工藝條件為酶解溫度40 ℃、酶解時間120 min、加酶量2.0%，此工藝條件下粗多糖得率為15.66%，是優(yōu)化前得率7.65%的2.05倍。[結論]該方法提取率高，是一種有效的油茶籽餅粕多糖提取方法。

關鍵詞油茶籽餅粕；多糖；酶法；單因素試驗；響應面分析

油茶是山茶科山茶屬多年生喬木，是我國特有的木本油料作物[1]。油茶籽餅粕是油茶籽榨油后的殘余物，年平均產(chǎn)量約為39.71萬t[2]。油茶籽餅粕中除含有油脂外，還有蛋白質、糖類等營養(yǎng)物質[3]。研究表明，油茶籽餅粕主要含有多糖15%～30%，茶皂素10%～15%，粗蛋白10%～15%[4]。據(jù)報道，油茶籽多糖具有抗血栓[5]、降血糖血脂、抗動脈粥樣硬化、降血壓、防治心血管疾病等作用[6]；此外，其對增加血清凝集素抗體、增強機體免疫力以及修復代謝紊亂也有明顯效果[7]。而目前油茶籽粕大部分被用作清塘劑、肥料和燃料，甚至被廢棄，少量用于茶皂素的提取，極少部分用作飼料，造成了很大的浪費。因此，加大對油茶籽副產(chǎn)物尤其是油茶籽粕資源的綜合利用，開發(fā)油茶籽粕多糖，對提高油茶資源綜合利用率、延長產(chǎn)業(yè)鏈均具有重要意義。

目前，油茶籽餅粕多糖提取方法有熱水浸提法、醇提法、發(fā)酵法、微波輔助提取、超聲波輔助提取等[7-10]。由于酶法作用條件溫和、操作相對簡單且具有較高的提取率，也常用于多糖的提取[11]。王維香等采用復合酶解法提取裙帶菜硫酸多糖，與單純熱水浸提相比，該法可提高硫酸多糖提取率，多糖得率達7.76%[12]。王元鳳等比較了熱水提取、果膠酶提取、復合酶提取3種方法對茶多糖提取效果的影響，結果表明，熱水提取后的茶渣采用復合酶在最佳條件下(pH 5.5、加酶量0.5%、溫度40 ℃、時間3 h)提取，茶多糖的提取率為3.29%，是水提的2.70倍[13]。目前少見酶法輔助提取油茶籽餅粕多糖的報道，因此，筆者進行了酶法提取油茶籽餅粕多糖的研究工作。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。油茶籽餅粕，安徽大別山科技開發(fā)有限公司。中性蛋白酶(活性:100 U/mg)、果膠酶(活性:100 U/mg)、纖維素酶(活性:30 U/mg)、半纖維素酶(活性:30 U/mg)，合肥博美生物科技有限公司。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、98%濃硫酸、苯酚、無水乙醇等，均購自于國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.1.2主要儀器設備。752N紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海申勝生物技術有限公司； LG10-2.4A離心機，北京醫(yī)用離心機廠；RE52CS-1旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；FD-1冷凍干燥機，北京博醫(yī)康技術公司。

1.2方法

1.2.1油茶籽餅粕多糖的提取工藝流程。油茶籽餅粕原料→酶解→提取→抽濾→醇沉→抽濾→干燥→粗多糖制品。精確稱取油茶籽餅粕原料1.0 g，加入10倍量磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)、一定量的酶，在一定溫度下，酶解一定時間。移入95 ℃水浴鍋，滅酶。然后再加入10倍量去離子水，調整料液比至1∶20 g/mL， 90 ℃水浴提取30 min，離心，收集上層清液，加入5倍體積無水乙醇，攪拌，多糖沉淀析出，靜置過夜，收集沉淀，真空冷凍干燥得油茶籽餅粕粗多糖。

1.2.2油茶籽餅粕多糖得率的測定。具體公式如下：

式中，粗多糖質量即多糖粗品質量(g)；多糖含量即粗多糖中多糖所占百分比(%)；樣品質量即油茶籽餅粕質量(g)。

1.2.3酶的種類對油茶籽餅粕多糖得率的影響。分別加入中性蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶及果膠酶，固定酶解溫度50 ℃，酶解時間60 min，酶添加量1.0%，考察酶的種類對油茶籽餅粕多糖得率的影響。

1.2.4單因素試驗。固定酶解時間60 min，酶添加量1.0%，考察酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)對多糖提取率的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶添加量1.0%，考察酶解時間(30、60、90、120、150 min)對多糖提取率的影響；固定酶解溫度50 ℃，酶解時間90 min，考察酶添加量(0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)對多糖提取率的影響。

1.2.5響應面試驗設計。根據(jù)酶解單因素試驗結果，以酶解溫度、酶解時間、酶添加量作自變量，以多糖提取率為響應值，采用軟件Design-Expert 8.05的Box-Behnken試驗設計響應面法優(yōu)化中性蛋白酶酶解提取工藝，試驗因素水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗設計因素水平

2結果與分析

2.1酶的種類對油茶籽餅粕多糖得率的影響由圖1可知，以縱坐標粗多糖得率為考察指標，進行酶的篩選。結果顯示，加入中性蛋白酶，粗多糖得率最高。可能是因為中性蛋白酶能有效降解與多糖結合在一起的蛋白質，從而釋放出更多的多糖，且經(jīng)粗多糖脫蛋白的過程，也能更多去除粗多糖中的蛋白質，進一步提高多糖的純度。

圖1　酶的種類對油茶籽餅粕多糖得率的影響Fig.1　Effects of enzyme type on the extraction rate of polysaccharides from camellia seed cake

2.2單因素試驗結果分析

2.2.1酶解溫度對多糖提取率的影響。由圖2可知，酶解溫度對油茶籽餅粕粗多糖提取率影響顯著，酶解溫度對粗多糖得率的影響呈現(xiàn)先上升后下降的變化。當酶解溫度為50 ℃時，酶解效果最好，粗多糖得率最高。當溫度超過50 ℃，部分酶開始失活，粗多糖得率開始下降。由此可知，中性蛋白酶最適溫度為50 ℃，故選擇40、50、60 ℃作為響應面試驗中酶解溫度的3個考察水平。

圖2　酶解溫度對多糖得率的影響Fig.2　Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.2.2酶解時間對多糖得率的影響。由圖3可知，酶解時間對油茶籽餅粕粗多糖得率影響較小，隨著酶解時間的增加，多糖溶液的吸光值一直處于上升趨勢，粗多糖得率逐漸增加。在酶解時間30～90 min，多糖得率的增加趨勢明顯，而在酶解時間90～150 min，多糖得率的增加趨勢趨于平緩。故從工藝和經(jīng)濟成本2個方面考慮，選取60、90、120 min作為響應面試驗中酶解時間的3個考察水平。

圖3　酶解時間對多糖得率的影響Fig. 3　Effects of enzymolysis time on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3酶添加量對多糖得率的影響。由圖4可知，酶添加量對油茶籽餅粕粗多糖提取率影響較大，在酶添加量0%～1.5%，粗多糖得率逐漸增加，而在1.5%～2.0%增加幅度平緩。因此，從提取率和經(jīng)濟成本2個方面考慮，選取1.0%、1.5%、2.0%作為響應面試驗中酶添加量的3個考察水平。

圖4　酶添加量對多糖得率的影響Fig. 4　Effects of enzymolysis dosage on the extraction rate of polysaccharides

2.3響應面試驗方案及結果分析

2.3.1響應面試驗優(yōu)化結果。通過單因素試驗，選擇合適的水平組合進行響應面試驗，以確定最佳的粗多糖提取工藝。油茶籽餅粕多糖提取的Box-Behnken試驗方案及結果見表2。

表2　Box-Behnken試驗方案及結果

Design-Expert軟件對所得試驗結果進行擬合二次多項式模型的方差分析，獲得酶解溫度(A)、酶解時間(B)、酶添加量(C)的二次多項回歸方程為：Y=0.23-0.034A+0.013B+0.03C-0.011AB-0.024AC+0.008BC+0.027A2+0.003 375B2+0.007 625C2。由方差分析可知，模型P<0.000 1，模型顯著，失擬項P=0.193 1，失擬項不顯著。由F值可以看出，影響多糖得率的因素按主次順序排列依次為A(酶解溫度)、C(酶添加量)、B(酶解時間)。其中A(酶解溫度)和C(酶添加量)達到極顯著水平，A(酶解溫度)與C(酶添加量)、A(酶解溫度)與B(酶解時間)交互作用較明顯，達到顯著水平。綜上所述，該模型擬合程度較好，模型成立。

2.4驗證試驗通過求解回歸模型方程，得油茶籽餅粕多糖酶解的最佳工藝為酶解溫度42.285 7 ℃，酶解時間118.851 2 min，酶添加量2.074 7%?？紤]到實際操作的可行性，將各因素水平歸整并進行驗證試驗，酶解溫度40 ℃，酶解時間120 min，酶添加量2.0%，在此工藝條件下，油茶籽餅粕多糖得率為15.66%，是優(yōu)化前得率7.65%的2.05倍，顯著提高了多糖得率。因此，該優(yōu)化工藝合理，具有可操作性，適宜用于油茶籽餅粕粗多糖的提取。

3結論與討論

該試驗通過酶法輔助熱水浸提油茶籽餅粕多糖，發(fā)現(xiàn)采用中性蛋白酶提取效果最佳，可能是因為多糖易與餅粕中蛋白結合形成糖蛋白，中性蛋白酶能有效降解與多糖結合在一起的蛋白質，從而釋放出更多的多糖，提高了多糖的得率，且更有助于粗多糖脫蛋白，進一步提高了多糖的純度。針對此，通過驗證試驗表明，優(yōu)選的酶法與傳統(tǒng)熱水浸提相結合工藝合理、提取率高、安全可靠，重復性好，適宜用于油茶籽餅粕粗多糖的提取。

該試驗在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗設計，以多糖得率為考察指標，對油茶籽餅粕多糖的提取工藝進行了優(yōu)化。影響多糖得率的因素按主次順序排列依次為A(酶解溫度)、C(酶添加量)、B(酶解時間)。確定油茶籽餅粕多糖提取最佳工藝為酶解溫度40 ℃，酶解時間120 min，酶添加量2.0%，此條件下多糖得率為15.66%，是優(yōu)化前得率的2.05倍，顯著提高了多糖得率。因此，該優(yōu)化工藝合理，具有可操作性。

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Optimization of Extraction of Polysaccharides from Camellia Seed Cake by Neutral Protease Using Response Surface Methodology

JIN Ri-sheng1,2, XU Bing-yan1, YUAN Chuan-xun1*

(1. Engineering Research Center of Bioprocess ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui 230009; 2. Institute of Chemical Industry of Forest Products, Chinese Academy of Forestry Sciences, Nanjing, Jiangsu 210042)

Abstract[Objective] To improve the extraction rate of the polysaccharides from camellia seed cake. [Method] With camellia seed cake after oil manufacture as the research material, polysaccharides were extracted by pectinase hydrolysis combined with traditional hot water extraction. Effects of neutral protease, cellulase, hemicellulase and pectinas on the polysaccharide extraction rate were researched. Single factor test was carried out to research the effects of three factors (enzymolysis temperature, enzymolysis time and enzyme dosage) on the polysaccharides extraction rate. Response surface methodology was applied to optimize the optimal conditions. [Result] The optimal extraction technology was as follows:40 ℃ enzymolysis temperature, 120 min enzymolysis time and 2.0% enzyme dosage. Under these conditions, the average extraction rate of polysaccharides was 15.66%, which was 2.05 times before optimization (7.65%). [Conclusion] This method has high extraction rate of polysaccaride, and is a kind of effective method for polysaccharide extraction.

Key wordsCamellia seed cake; Polysaccharides; Enzyme method; Single factor test; Response surface methodology

作者簡介金日生(1982- )，男，安徽桐城人，助理研究員，博士，從事天然活性物質研究與開發(fā)工作。

收稿日期2016-03-28

中圖分類號S 789.7

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-107-03