胡　曉，趙宏宇，沈海濤，王　煜，郭　峰，趙　敏

肝X受體在百草枯致急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)及作用

胡曉，趙宏宇，沈海濤，王煜，郭峰，趙敏*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004

[摘要]目的研究肝X受體(Liver X receptors,LXRs)在百草枯(Paraquat,PQ)致急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)情況及保護(hù)作用。方法48只雄性c57小鼠隨機(jī)分為6組,對照組：0.1 mL生理鹽水腹腔注射；A組(TO901317低劑量對照組)：5 mg/kg TO901317腹腔注射；B組(TO901317高劑量對照組)：20 mg/kg TO901317腹腔注射；C組(百草枯染毒組)：百草枯28 mg/kg腹腔注射；D組(TO901317低劑量預(yù)處理組)：百草枯染毒前0.5 h 給予TO901317 5 mg/kg腹腔注射；E組(TO901317高劑量預(yù)處理組)：百草枯染毒前0.5 h給予TO901317 20 mg/kg腹腔注射。在百草枯染毒后72 h處死小鼠，收集肺組織及肺泡灌洗液標(biāo)本。肺組織取出后測定肺濕重/干重比，肺組織切片后HE 染色進(jìn)行肺損傷評分，采用ELISA方法檢測肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量，Western blot 方法檢測肺組織中LXRs(LXRα和 LXRβ)及Toll樣受體4(TLR-4)的表達(dá)。結(jié)果對照組小鼠肺組織中可檢測到較高水平的LXRα和 LXRβ表達(dá)，與對照組相比，百草枯中毒組小鼠LXRα和 LXRβ表達(dá)明顯減少，肺濕重/干重比及肺損傷評分顯著增加，肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量明顯增高，TLR-4表達(dá)明顯增加。上述改變在TO901317預(yù)處理組明顯減輕，減輕程度與TO901317劑量有關(guān)。結(jié)論肝X受體可以在正常小鼠肺組織的中表達(dá)，百草枯中毒可顯著抑制肝X受體在小鼠肺組織中表達(dá)，應(yīng)用LXRs激動劑TO901317能明顯減輕百草枯導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷程度，這一作用可能與LXRs抑制TLR-4在肺組織中的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]百草枯；急性肺損傷；肝X受體；Toll樣受體4

0引言

百草枯(Paraquat，PQ)又名克蕪蹤，是一種廣譜、觸殺型有機(jī)雜環(huán)類除草劑。因無特效解毒藥和有效的治療手段，是目前國內(nèi)中毒病死率最高的農(nóng)藥[1]。百草枯主要蓄積于肺組織并可在中毒早期引起急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征[2-4]。肝X受體(Liver X receptors,LXRs)是孤核受體家族的重要成員,調(diào)節(jié)膽固醇的輸出、膽汁酸的生成及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成,從而調(diào)控脂質(zhì)的動態(tài)平衡[5]。研究表明,LXRs在肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及肺組織中有一定的表達(dá),在肺組織的LXRs能通過各種途徑減輕急性肺損傷[6]。本研究采用LXRs激動劑TO901317對小鼠進(jìn)行預(yù)處理，觀察百草枯中毒后急性肺損傷的改善情況，并進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑、儀器和動物百草枯(Sigma，美國)；TO901317(Abcam，英國)。IL-1β和TNF-α ELISA 試劑盒(南京建成，中國)；LXRα和LXRβ抗體(Abcam，英國)；TLR-4抗體(CST，美國)；石蠟切片機(jī)和包埋機(jī)(Leitz，德國);電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀(DYY-7C，北京六一);凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B型，北京六一)；顯微鏡(DP73，OLYMPUS)。雄性c57小鼠，體重18～22 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2動物分組48只雄性c57小鼠隨機(jī)分為6組,每組8只。具體如下：control組(對照組)：0.1 mL生理鹽水腹腔注射；A組(TO901317低劑量對照組)：5 mg/kg TO901317腹腔注射；B組(TO901317高劑量對照組)：20 mg/kg TO901317腹腔注射；C組(百草枯染毒組)：百草枯28 mg/kg腹腔注射；D組(TO901317低劑量預(yù)處理組)：百草枯染毒前0.5 h，給予TO901317 5 mg/kg腹腔注射；E組(TO901317高劑量預(yù)處理組)：百草枯染毒前0.5 h，給予TO901317 20 mg/kg腹腔注射。

1.3肺組織標(biāo)本采集及肺濕重/干重比測定腹腔注射百草枯或生理鹽水后72 h處死小鼠，分離肺組織。取右肺中葉，稱濕重，置入80 ℃烘箱內(nèi)烘48 h后稱量肺的干重，計算肺組織濕/干重比值。生理鹽水清洗后，將右肺其余肺葉液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存用以備檢測。

1.4肺泡灌洗液采集及IL-1β和TNF-α測定腹腔注射百草枯或生理鹽水后72 h處死小鼠，開胸后結(jié)扎氣管遠(yuǎn)端及右側(cè)主支氣管近端，在氣管結(jié)扎下端處用1 mL注射器對左肺肺泡進(jìn)行灌洗，取0.8 mL PBS沖洗左肺3次，每次重復(fù)3遍，回收的支氣管肺泡灌洗液，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。之后?yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α的含量。

1.5肺組織病理形態(tài)觀察取小鼠右肺上葉后，于4%多聚甲醛中固定72 h，給予脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋并制備石蠟切片，HE染色后，在光鏡下(200倍)觀察肺組織病理學(xué)改變，并按Mikawa等[8]方法進(jìn)行肺損傷評分。評分標(biāo)準(zhǔn):①肺泡充血，②出血，③肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集，④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4項(xiàng)指標(biāo)分別依病變輕重評0～4分。無病變或非常輕微為0分，輕度病變?yōu)?分，中度病變?yōu)?分，重度病變?yōu)?分，極重度病變?yōu)?分。各項(xiàng)評定分?jǐn)?shù)相加為肺損傷總評分。

1.6Western blot法檢測肺組織LXRα、LXRβ、TLR-4表達(dá)水平根據(jù)每個樣本的質(zhì)量及體積，加入相應(yīng)體積的RIPA裂解樣本，然后繼續(xù)置于冰上靜置5 min。開啟低溫冷凍離心機(jī)，12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物。進(jìn)行蛋白定量后，加樣品緩沖液煮沸5 min，各取20 μL 加樣;使用10%聚丙烯酰胺凝膠在150 V、30 mA 條件下電泳1.5 h;50 V條件下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜2 h;5%脫脂牛奶封閉，滴加LXRα(1∶1 000)、LXRβ(1∶1 000)、TLR-4 (1∶500)一抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗) 37 ℃孵育45 min。用0.1%TBST 沖洗3 次，ECL 發(fā)光檢測，X 線片顯影，掃描圖像，測得各條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)后，比較其表達(dá)量的變化。

2結(jié)果

2.1LXRs在小鼠肺組織的表達(dá)在對照組小鼠肺組織中可檢測到較高水平LXRα和LXRβ的表達(dá)。與對照組比較，百草枯染毒組小鼠肺組織內(nèi)LXRα和LXRβ的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。TO901317預(yù)處理可顯著削弱百草枯染毒對LXRα和LXRβ表達(dá)的影響，使LXRα和LXRβ表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見圖1。

2.2肺濕重/干重比與對照組相比，百草枯染毒組肺濕重/干重比顯著增加(P<0.05)。與百草枯染毒組相比，TO901317預(yù)處理組肺濕重/干重比顯著下降，高劑量組下降較明顯(P<0.05)。見圖2。

圖1　小鼠肺組織LXRα和LXRβ的表達(dá)

圖2　小鼠肺濕重/干重比

2.3肺組織病理學(xué)觀察百草枯染毒后72 h，肺組織可見肺泡腔內(nèi)充血，大量的中性粒細(xì)胞浸潤或聚集并伴有透明膜形成，肺泡壁顯著增厚及結(jié)構(gòu)破壞。與百草枯染毒組相比，TO901317預(yù)處理組肺組織破壞程度明顯減輕，肺損傷評分明顯下降，高劑量組肺組織損傷減輕更明顯(P<0.05)。見圖3。

圖3　小鼠肺損傷評分

2.4肺泡灌洗液IL-1β和TNF-α測定與對照組相比，百草枯染毒組肺泡灌洗液內(nèi)IL-1β和TNF-α含量明顯增加(P<0.05)。與百草枯染毒組比較，TO901317預(yù)處理組肺泡灌洗液內(nèi)IL-1β和TNF-α含量顯著下降，高劑量組下降更明顯(P<0.05)。見圖4。

圖4　肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α測定

2.5TLR-4在肺組織的表達(dá)與對照組相比，百草枯染毒組TLR-4表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與百草枯染毒組比較，TO901317預(yù)處理組TLR-4表達(dá)明顯下降，高劑量組下降更明顯(P<0.05)。見圖5。

3討論

PQ的肺毒性可能是由于其選擇性在肺內(nèi)大量聚積造成的,早期表現(xiàn)為急性肺泡炎,以后表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肺間質(zhì)纖維化，但PQ引起肺損傷及后期肺纖維化的病理生理機(jī)制仍未完全明確[7]。PQ中毒早期主要表現(xiàn)為急性肺泡炎性改變,有多種促炎基因及細(xì)胞因子參與其中，包括TNF-α、IL-1β及 γ干擾素(IFN-γ)、磷脂酶A2(PLA2)、血小板活化因子(PAF)等，這些細(xì)胞因子對微血管內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的上調(diào)作用啟動炎癥反應(yīng)及中性粒細(xì)胞在肺間質(zhì)的募集和浸潤，增加血管漏出，引起肺損傷；同時這些細(xì)胞因子又可刺激內(nèi)皮素的合成與釋放，以上環(huán)節(jié)相互誘導(dǎo)，形成惡性循環(huán)，加重肺損傷。因此，削弱炎癥反應(yīng)是減輕PQ致急性肺損傷的有效途徑之一。

圖5　小鼠肺組織TLR-4表達(dá)

LXRs屬核受體超家族的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其成員有LXRα和LXRβ。LXRα主要在肝、腎、脾、腸等組織以及巨噬細(xì)胞上表達(dá)，而LXRβ在幾乎所有組織細(xì)胞中表達(dá)。LXRs與視黃醛核受體以雜聚二聚體形式存在，膽固醇的一些代謝產(chǎn)物是其內(nèi)源的激活配體，如羥基固醇24(S)，25-環(huán)氧膽固醇、24(S)-羥基膽固醇和22(R)-羥基膽固醇，人工合成的GW3965、TO901317 是其特異的激活劑[8-9]。LXRα和LXRβ在肺組織、肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡表面細(xì)胞都有一定的表達(dá)[10]，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LXRs的激活能有效保護(hù)肺組織，削弱由脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)，從而減輕急性肺損傷[10-11]。這一作用可能與LXRs能有效地減弱TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘發(fā)炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)[12]。

TLR-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一,多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TLR-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與PQ引起的組織損傷[13-14]。當(dāng)TLR-4 與相應(yīng)配體結(jié)合后,進(jìn)一步激活核因子κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路,從而促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的激活。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LXRα和LXRβ在小鼠肺組織中均可表達(dá)，小鼠百草枯染毒后，LXRα和LXRβ表達(dá)明顯下降，肺組織TLR-4表達(dá)明顯增加，BALF中促炎因子TNF-α及IL-1β含量顯著增加，肺組織損傷明顯。與百草枯染毒組比較，小鼠預(yù)防性使用LXR激動劑TO901317后，肺組織TLR-4表達(dá)顯著下降，BALF中促炎因子TNF-α及IL-1β含量明顯減少，肺組織損傷減輕，且這一效應(yīng)與TO901317使用劑量相關(guān)。

綜上所述，LXRs激活對百草枯致小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與LXRs激活后抑制TLR-4表達(dá)，從而抑制肺部炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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Expression and role of LXRs in the lung tissues of mice with paraquat-induced acute lung injury

HU Xiao，ZHAO Hong-yu，SHEN Hai-tao，WANG Yu，GUO Feng，ZHAO Min*

(Emergency Department,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression and role of LXRs in the lung tissues of mice with paraquat-induced acute lung injury.MethodsTotally 48 male c57 mice were randomly divided into six groups.Control group：0.1 mL normal saline solution was administered intraperitoneally.Group A(low dose TO901317 group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg/kg.Group B(high dose TO901317 group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 20 mg/kg.Group C(paraquat poisoning):paraquat was administered intraperitoneally at a dose of 28 mg/kg.Group D(low dose TO901317 pretreatment group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg/kg at 30 min before PQ administration.Group E(high dose TO901317 pretreatment group):TO901317 was administered intraperitoneally at a dose of 20 mg/kg at 30 min before PQ administration.The mice were sacrificed at 72 h after PQ administration and lung tissues and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected. The lung W/D ratios were evaluated at 72 h after PQ administration,histopathological changes in the lung tissues were determined by HE staining and lung injury scores,IL-1β and TNF-α levels in BALF were measured via ELISA assay kits;the expressions of LXRs and TLR-4 were measured by Western blot.ResultsHigh levels of expression of LXRα and LXRβ were detected in the lung tissues of control group. Compared with control group,the expression of LXRα and LXRβ was significantly reduced,the lung W/D ratios,lung injury scores,IL-1β and TNF-α levels in BALF,and the expression of TLR-4 were significantly increased in PQ poisoning group.All these changes were attenuated dose-dependently in TO901317 pretreatment group.ConclusionLXRs can be expressed in the lung tissues of normal mice and PQ administration significantly reduces the expression of LXRs.TO901317( LXRs agonist) pretreatment markedly attenuates PQ-induced acute lung injury of mice.This effect may be associated with the inhibition of TLR-4 expression in the lung tissues by LXRs.

Key words：Paraquat;Acute lung injury;Liver X receptors;TLR-4

收稿日期：2016-02-16

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605003