邢淑芳，王　琳

川芎嗪對(duì)大鼠腦損傷后保護(hù)作用的研究

邢淑芳1，王琳2

1.河北省武安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 武安 056300；2.河北省唐山市豐南區(qū)醫(yī)院，河北 唐山 063300

[摘要]目的探討川芎嗪對(duì)大鼠腦損傷后的保護(hù)作用。方法將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、損傷組及治療組，每組20只。損傷組、治療組以改良Feeney自由落體腦損傷模型方式對(duì)大鼠制作腦損傷動(dòng)物模型，治療組大鼠在腦損傷后接受川芎嗪治療。實(shí)驗(yàn)第14天應(yīng)用HE染色、電鏡觀察及水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)腦損傷對(duì)大鼠形態(tài)學(xué)和學(xué)習(xí)記憶的影響及川芎嗪的保護(hù)作用。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，應(yīng)用川芎嗪注射液治療后，治療組正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目多于損傷組；電鏡下可見治療組神經(jīng)細(xì)胞核固縮程度、染色質(zhì)濃染程度、胞漿空泡化較損傷組減輕。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組第1次穿過平臺(tái)時(shí)間較損傷組縮短[(7.68±1.09) s vs. (10.15±2.35) s]，在靶象限活動(dòng)時(shí)間較損傷組延長(zhǎng)[(86.14±16.68) s vs. (62.38±19.67) s]，穿過平臺(tái)次數(shù)多于損傷組(6.4±2.3 vs. 3.8±1.6)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論川芎嗪治療可能在腦組織損傷及大鼠學(xué)習(xí)記憶功能中發(fā)揮重要的治療效應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]腦損傷；川芎嗪；水迷宮

0引言

腦損傷是現(xiàn)代社會(huì)中的常見病和多發(fā)病，其致殘率和死亡率均居各種疾病首位，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。腦損傷可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段，腦損傷瞬間引起的組織損害稱為原發(fā)性損傷，由此激發(fā)的一系列病理因素參與的神經(jīng)破壞過程稱為繼發(fā)性損傷。腦損傷后神經(jīng)凋亡及由此引起的學(xué)習(xí)記憶障礙是腦損傷常見的繼發(fā)性損傷，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響有時(shí)甚至超過原發(fā)性損傷[3]。因此，尋找有關(guān)腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)措施非常重要，已成為全球共同關(guān)注的重大課題。川芎嗪是川芎的有效成分，具有典型的鈣離子拮抗劑特性，可擴(kuò)張微血管和改善微循環(huán)[4-5]。已有研究顯示，川芎嗪對(duì)大鼠急性脊髓損傷有一定的保護(hù)作用[6]，但關(guān)于該藥對(duì)大鼠腦損傷的保護(hù)作用研究較少。本研究將川芎嗪用于腦損傷大鼠，探討其對(duì)大鼠腦損傷是否有保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康Sprague-Dawley純種大鼠(購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心)60只，3～6個(gè)月，體重300～350 g，雌雄不限，由專一實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)員統(tǒng)一飼養(yǎng)，隔日換墊料，室溫保持20 ℃。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用單純隨機(jī)分組方法，隨機(jī)分為3組，每組20只。對(duì)照組，只行手術(shù)，不對(duì)腦組織打擊；損傷組，制作打擊模型，未應(yīng)用川芎嗪注射液；治療組，打擊模型后應(yīng)用川芎嗪注射液進(jìn)行治療。

1.3模型制備按照改良Feeney自由落體腦損傷模型對(duì)損傷組和治療組大鼠制作左頂葉腦挫裂傷模型[7]。損傷模型裝置由底板、固定支架、垂直導(dǎo)引桿、下落擊錘和撞擊圓錐組成。導(dǎo)桿重84.3 g，擊錘重23.1 g，撞擊圓錐頭端直徑4 mm、高2.5 mm。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(350 mg/kg)，麻醉成功后，將其頭部固定，剪去頂部皮毛，消毒皮膚后，沿中線左側(cè)矢狀切開頭皮，剝離骨膜顯露左頂顱骨，于中線左側(cè)旁開約2 mm，前囟后約2 mm處用牙科鉆開一直徑為5 mm圓形骨窗，保持硬膜完整。以40 g砝碼于25 cm高處通過金屬導(dǎo)桿落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐上致重型腦挫裂傷，用骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，置鼠籠喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中維持大鼠肛溫在36.5～37.5 ℃，直至蘇醒。治療組大鼠腦損傷后30 min內(nèi)腹腔注射川芎嗪(山東瑞陽(yáng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040367，規(guī)格：100 mg/支) 120 mg/kg，1次/d，連續(xù)14 d，損傷組大鼠相同時(shí)間內(nèi)給予等量生理鹽水注射。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)所有大鼠在開始實(shí)驗(yàn)前首先進(jìn)行4 d的水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練。訓(xùn)練時(shí)將大鼠分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)入水，引導(dǎo)其在180 s內(nèi)尋找并爬上安全平臺(tái)。經(jīng)過4 d訓(xùn)練后，大鼠都能在180 s內(nèi)順利找到平臺(tái)。訓(xùn)練完成后，將大鼠隨機(jī)分成3組，分別進(jìn)行相關(guān)處理。14 d后再次進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在180 s內(nèi)搜索平臺(tái)的次數(shù)、首次穿過平臺(tái)的時(shí)間及在靶象限內(nèi)的活動(dòng)時(shí)間。

1.5標(biāo)本采集及制備水迷宮實(shí)驗(yàn)后，大鼠在10%水合氯醛深度麻醉狀態(tài)下開胸，穿刺左心室，經(jīng)心依次用體積分?jǐn)?shù)為1%的肝素生理鹽水、體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液各200 mL灌注。斷頭并取腦組織標(biāo)本，一部分標(biāo)本用于HE染色，一部分標(biāo)本用于電鏡觀察。

1.6腦組織HE染色將用于HE染色的標(biāo)本置于10%中性甲醛后固定24 h。冠狀位切取視交叉與正中隆起處組織，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約5 μm，經(jīng)粘片劑處理過的載玻片撈片，晾干后置于60 ℃烤箱烘烤4 h后染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯常規(guī)脫蠟，100%、95%、80%、70%酒精梯度入水，用蒸餾水沖去殘存酒精成分。明礬蘇木精染色15 min，自來(lái)水漂洗，去浮色(約10 s)。1%鹽酸酒精分色30 s，自來(lái)水漂洗0.5 h。0.5%伊紅酒精溶液染色3 min。70%、80%、95%、100%酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.7電鏡觀察將另一部分腦組織洗凈，切成1.0 mm3組織塊，置入4 ℃新鮮戊二醛緩沖液中固定2 h后，用1%四氧化鋨在4 ℃固定30 min，之后用0.1 M、pH 7.4的PBS液漂洗3次。然后用30%、50%、70%、90%系列丙酮在室溫下逐級(jí)脫水，每次脫水15 min，最后用100%的丙酮脫水2次，30 min/次。純丙酮-環(huán)氧樹脂618包埋劑(1∶1體積比)浸透8 h后環(huán)氧樹脂618包埋，并修整包塊。采用超薄切片機(jī)對(duì)選擇好的半薄切片部位進(jìn)行切片，切取厚度約50 nm的超薄切片。采用醋酸雙氧鈾和鉛染液(含醋酸鉛、硝酸鉛和枸椽酸鉛)室溫下染色30 min，染色后置入40～50 ℃溫箱中烘干待用。將超薄切片置于小銅網(wǎng)上，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分析、記錄數(shù)據(jù)并照像。

2結(jié)果

2.1HE 染色觀測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目多，排列整齊，形態(tài)正常，核仁清晰，神經(jīng)細(xì)胞周圍無(wú)散在的空泡形成。胞核為藍(lán)色，胞漿淡紅色，各組神經(jīng)細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、大小和排列上未見明顯差別，未見明顯病理改變。損傷組：大鼠海馬CA1區(qū)前角正常的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核固縮，部分發(fā)生核裂解，神經(jīng)細(xì)胞周圍可見較多空泡形成。治療組：大鼠海馬CA1區(qū)前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目較多，且多于損傷組，部分形態(tài)基本正常，核仁清晰，神經(jīng)細(xì)胞周圍可見散在的空泡形成，較損傷組減少。

2.2電鏡觀測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變對(duì)照組大鼠腦組織電鏡超微結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常：可見神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常，神經(jīng)元的細(xì)胞核大而圓，核仁、細(xì)胞膜清楚，染色質(zhì)密度均一。細(xì)胞器可見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，血腦屏障的微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜結(jié)構(gòu)大致正常。損傷組可見神經(jīng)元核固縮，異染色質(zhì)濃染凝集成塊，呈環(huán)狀或新月狀，附在核膜周邊，核仁裂解，胞質(zhì)濃縮，胞體皺縮，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞膜內(nèi)陷呈泡狀改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體腫脹，空泡樣變，線粒體嵴碎裂，胞漿中特征性尼氏體溶解消失；膠質(zhì)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃染聚集，胞漿中有大量空泡形成。見圖1。治療組的神經(jīng)細(xì)胞核輕度固縮，染色質(zhì)濃染較常溫?fù)p傷組減輕，胞漿空泡化較常溫?fù)p傷組減輕。見圖2。

圖1　損傷組電鏡觀測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變(×14 000)

圖2　治療組電鏡觀測(cè)病理形態(tài)學(xué)改變(×22 000)

2.3水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察實(shí)驗(yàn)第14天，各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可見，損傷組、治療組大鼠第1次穿過平臺(tái)時(shí)間均高于對(duì)照組，在靶象限活動(dòng)時(shí)間和穿過平臺(tái)次數(shù)均低于對(duì)照組。治療組大鼠第1次穿過平臺(tái)時(shí)間短于損傷組，在靶象限活動(dòng)時(shí)間較損傷組延長(zhǎng)，穿過平臺(tái)次數(shù)較多。

3討論

《本草綱目》中認(rèn)為，川芎為血中氣藥，味辛性溫，主要功能為活血化瘀。川芎嗪是川芎的有效成分，有較強(qiáng)的改善微循環(huán)、降低毛細(xì)血管通透性等功能，臨床上主要用于腦供血不足、腦血栓形成等缺血性血管疾病的治療[8-10]。近年研究顯示，川芎嗪可通過抑制脊髓組織中內(nèi)皮素mRNA的表達(dá)，使受損的神經(jīng)細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常，減輕大鼠急性脊髓損傷后繼發(fā)性損害的加重[11-12]。但關(guān)于川芎嗪對(duì)大鼠腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用研究尚較少。

表1　各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與對(duì)照組、損傷組比較，P<0.05

本研究采用川芎嗪注射液治療大鼠腦損傷14 d后，HE 染色及電鏡形態(tài)學(xué)方面顯示，正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目多于損傷組，部分形態(tài)基本正常，核仁清晰，神經(jīng)細(xì)胞周圍可見散在的空泡形成，且較損傷組明顯減少。此外，電鏡上可觀察到損傷組神經(jīng)元核固縮，異染色質(zhì)濃染凝集成塊，呈環(huán)狀或新月狀，附在核膜周邊，核仁裂解，胞質(zhì)濃縮，胞體皺縮，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞膜內(nèi)陷呈泡狀改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體腫脹，空泡樣變，線粒體嵴碎裂，胞漿中特征性尼氏體溶解消失；膠質(zhì)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃染聚集，胞漿中有大量空泡形成。而川芎嗪治療組電鏡下可見神經(jīng)細(xì)胞的核輕度固縮，染色質(zhì)濃染較損傷組減輕，胞漿空泡化也較損傷組減輕，提示川芎嗪治療可減輕腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞損害，對(duì)腦損傷的修復(fù)有一定促進(jìn)作用，與相關(guān)研究結(jié)果類似[13-15]。

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，損傷組、治療組大鼠14 d后，第1次穿過平臺(tái)時(shí)間均較對(duì)照組延長(zhǎng)，在靶象限活動(dòng)時(shí)間較對(duì)照組縮短，穿過平臺(tái)次數(shù)較少，證實(shí)腦損傷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能可產(chǎn)生嚴(yán)重影響。而第14天時(shí)，治療組第1次穿過平臺(tái)時(shí)間短于損傷組，在靶象限活動(dòng)時(shí)間較損傷組延長(zhǎng)，穿過平臺(tái)次數(shù)較多，提示川芎嗪注射液治療可顯著改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高。

綜上所述，應(yīng)用川芎嗪注射液治療，可以降低腦損傷后腦組織的損傷，改善學(xué)習(xí)記憶，從而對(duì)腦損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹健鋒,晉鑫,史載祥,等.亞低溫治療創(chuàng)傷性腦損傷的研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2015,14(4):444-448.

[2]Cai P,Luo H,Xu H,et al.Recombinant ADAMTS 13 attenuates brain injury after intracerebral hemorrhage[J].Stroke,2015,46(9):2647-2653.

[3]Tataranno ML,Perrone S,Buonocore G.Plasma biomarkers of oxidative stress in neonatal brain injury[J].Clin Perinatol,2015,42(3):529-539.

[4]蔡莉莉,李敬會(huì),徐劍剛,等.丹參川芎嗪注射液對(duì)老年UAP患者血流變學(xué)、hs-CRP及脂代謝的影響[J].實(shí)用藥物與臨床,2014,17(3):267-270.

[5]Zhang WJ,Wang JY,Li H,et al.Novel application of natural anisole compounds as enhancers for transdermal delivery of ligustrazine[J].Am J Chin Med,2015,43(6):1231-1246.

[6]王世龍,林原,唐澤耀,等.川芎嗪在各類神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2010,26(4):438-442.

[7]別黎,劉興吉.創(chuàng)傷性顱腦損傷主要損傷標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].中華創(chuàng)傷雜志,2015,31(4):380-382.

[8]張偉民,李瑞芳,付銀峰,等.川芎嗪對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的急性心衰小鼠心肌損傷和凋亡的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2014,(8):708-711.

[9]Cai J,Pan R,Jia X,et al.The combination of astragalus membranaceus and ligustrazine ameliorates micro-haemorrhage by maintaining blood-brain barrier integrity in cerebrally ischaemic rats[J].J Ethnopharmacol,2014,158(Pt A):301-309.

[10]Ni X,Ni X,Liu S,et al.Medium- and long-term efficacy of ligustrazine plus conventional medication on ischemic stroke:a systematic review and meta-analysis[J].J Tradit Chin Med,2013,33(6):715-720.

[11]唐澤耀,王世龍,林原,等.川芎嗪在神經(jīng)系統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)及臨床藥效學(xué)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2010,26(7):535-539.

[12]Lv L,Meng Q,Xu J,et al.Ligustrazine attenuates myocardial ischemia reperfusion injury in rats by activating the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway[J].Ann Clin Lab Sci,2012,42(2):198-202.

[13]王霞,張靜.丹參川芎嗪注射液治療急性腦梗死療效觀察[J].臨床合理用藥雜志,2011,4(29):70-71.

[14]Liu X,Liu H,Zeng Z,et al.Pharmacokinetics of ligustrazine ethosome patch in rats and anti-myocardial ischemia and anti-ischemic reperfusion injury effect[J].Int J Nanomed,2011,34(6):1391-1398.

[15]陳英.川芎嗪治療外傷性腦損傷的時(shí)間窗及療效觀察[J].山東醫(yī)藥,2012,52(21):95-96.

Study on the protection effect of ligustrazine on brain injury in rats

XING Shu-fang1,WANG Lin2

(1.Department of Neurosurgery,First People′s Hospital of Wu′an City,Wu′an 056300,China;2.Fengnan District Hospital of Tangshan,Tangshan 063300,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effect of ligustrazine on brain injury in rats.MethodsSixty rats were selected and randomly divided into control group (n=20),injury group (n=20) and treatment group (n=20).Feeney brain injury model was made in injury group and treatment group.Rats in treatment group were given ligustrazine after injury.The effect of brain injury on morphology and learning function of rats and the protection effect of ligustrazine were evaluated by HE staining,electron microscope and morris water maze.ResultsHE staining results showed that the number of normal motor neuron in treatment group was more than that of injury group.The electron microscope results showed that the pycnosis of nerve cells,the staining of chromatin and the vacuolization of hyalomitome were lighter in treatment group than those in injury group.The results of morris water maze showed that the time of first arriving safe plat (s) in treatment group was less than that of injury group (7.68±1.09 vs.10.15±2.35),the time of swimming in target quadrant (s) (86.14±16.68 vs.62.38±19.67) and the number of arriving safe plat (6.4±2.3 vs.3.8±1.6) in treatment group were greater than those of injury group,there being significant differences (P<0.05).ConclusionLigustrazine may play an important role in the brain injury and learning function in rats.

Key words：Brain injury;Ligustrazine;Morris water maze

收稿日期：2015-09-24

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605005