余祖華，丁　軻，，侯　奎，李元曉，李　旺

(河南科技大學(xué)a.動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003)

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產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌B.LY02搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

余祖華a，丁軻a，b，侯奎b，李元曉b，李旺b

(河南科技大學(xué)a.動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471003)

摘要：為了提高產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis LY02，B.LY02)的產(chǎn)酶能力，采用單因素試驗(yàn)對(duì)該菌株產(chǎn)酶的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示：菌株B.LY02發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為麥芽糖，氮源為酵母膏，初始pH值為5.0，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為30 h，裝液量為60 mL(250 mL三角瓶)，接種量(體積分?jǐn)?shù))為2%，搖床轉(zhuǎn)速180～200 r/min 。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，菌株B.LY02的產(chǎn)酶活性達(dá)到了0.683 5 U/mL，比優(yōu)化前提高了約27.73%。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；地衣芽孢桿菌；發(fā)酵條件；酶活

0引言

纖維素是地球上最豐富的可再生資源之一[1]，但由于其較難降解，所以尚未得到充分利用。學(xué)者們一直在探尋降解纖維素的有效方法，比如酸、堿和蒸汽加熱等，但這些方法存在降解產(chǎn)物回收率低和二次污染等問(wèn)題，限制了其應(yīng)用[2]。目前，利用產(chǎn)纖維素酶的微生物來(lái)降解秸稈成為一種更接近自然的纖維素降解方法[3]。地衣芽孢桿菌是目前應(yīng)用較多的益生菌之一，它自身能合成蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和脂肪酶等消化性酶類(lèi)[4-7]。因此，利用產(chǎn)纖維素酶的地衣芽孢桿菌對(duì)秸稈進(jìn)行生物降解是處理和利用秸稈最具前景的方法。但自然存在的纖維素酶產(chǎn)率往往較低[8]，對(duì)纖維素的降解能力有限。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)：從自然界中篩選產(chǎn)纖維素酶的菌株后，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以及對(duì)菌株進(jìn)行誘變或改造，可提高菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。文獻(xiàn)[9]利用紫外線對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變后，獲得的綠色木霉菌(Trichodermavride)菌株K6產(chǎn)纖維素酶的酶活性是出發(fā)菌株的1.39倍。文獻(xiàn)[10]從書(shū)虱伴生菌中篩選得到5株產(chǎn)纖維素酶的菌株，分別使用單因素分析法和響應(yīng)面分析法，對(duì)纖維素酶活性最高的S2菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，S2菌株的纖維素酶活力比優(yōu)化前提高了45%。

文獻(xiàn)[11]從土壤中分離得到了一株產(chǎn)纖維素酶的地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisLY02，B.LY02)，但其在新鮮培養(yǎng)液中的產(chǎn)酶活性最高僅為0.535 1 U/mL。為了提高B.LY02的產(chǎn)酶活性，本文對(duì)菌株B.LY02進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，以摸索最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件，為其進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

地衣芽孢桿菌B.LY02由河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室分離保存。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，羧甲基纖維素鈉10.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，羧甲基纖維素鈉10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，pH值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑：稱(chēng)取200.0 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加3,5-二硝基水楊酸10.0 g，氫氧化鈉10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g，無(wú)水亞硫酸鈉0.5 g。全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中用不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖和淀粉)，質(zhì)量濃度為10 g/L，按2.0%(體積分?jǐn)?shù))接種種子液，37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心取上清液。采用3,5-二硝基水楊酸法[5,12]測(cè)定上清液中的纖維素酶酶活(下同)，確定培養(yǎng)基的最佳碳源。

1.2.2培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基中用不同的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和硝酸鉀)，質(zhì)量濃度均為10 g/L，按2.0%(體積分?jǐn)?shù))接種種子液，37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定培養(yǎng)基的最佳氮源。

1.2.3接種量的優(yōu)化

將種子液按體積分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%接種于100 mL優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定最佳接種量。

1.2.4搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

取10個(gè)250 mL三角瓶，各加入50 mL優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按1.2.3篩選的最佳接種量接種，分別于120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min和260 r/min的轉(zhuǎn)速下，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。

1.2.5培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化

取10個(gè)250 mL三角瓶，分別加入20 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL和100 mL優(yōu)化的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按1.2.3篩選的最佳接種量接種，于37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定最佳裝液量。

1.2.6培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

采用上述最佳條件，將菌液分別于25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃和46 ℃條件下培養(yǎng)24 h，每瓶取樣5 mL,離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定最適培養(yǎng)溫度。

1.2.7培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

采用上述最佳條件，將菌液分別培養(yǎng)12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h，每瓶取樣5 mL,離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定最適培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.8培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

取6個(gè)200 mL三角瓶，采用上述最佳條件進(jìn)行配制，將各瓶培養(yǎng)基 pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，按照上述最佳條件培養(yǎng)，離心取上清，測(cè)定纖維素酶酶活，確定最佳初始pH值。

1.2.9優(yōu)化前后酶活對(duì)比

采用最佳培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵條件對(duì)B.LY02菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定纖維素酶酶活，同時(shí)以?xún)?yōu)化前發(fā)酵條件為對(duì)照，對(duì)比優(yōu)化后和優(yōu)化前菌株纖維素酶酶活的變化。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基碳源對(duì)酶活的影響

在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究不同碳源對(duì)B.LY02菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出：當(dāng)以麥芽糖為碳源時(shí)酶活最高，而以葡萄糖為碳源時(shí)酶活最低。

表1　培養(yǎng)基碳源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.2培養(yǎng)基氮源對(duì)酶活的影響

在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究不同氮源對(duì)B.LY02菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出：該菌株對(duì)有機(jī)氮源的利用顯著優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，其中，以酵母膏為氮源時(shí)菌株的酶活最高，其次是蛋白胨和牛肉膏。

表2　培養(yǎng)基氮源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.3接種量對(duì)酶活的影響

不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出：在接種量為0.5%～2.0%時(shí)，菌株產(chǎn)酶活性基本與接種量呈正相關(guān)，隨著接種量的增加而增加；接種量為2.0%時(shí)酶活最高，然后隨著接種量的增加，酶活呈逐漸下降趨勢(shì)。

表3　接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.4搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶活的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)纖維素酶酶活的影響結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知：轉(zhuǎn)速在180～200 r/min時(shí)酶活最高；但當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)200 r/min時(shí)，酶活呈下降趨勢(shì)。

表4　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.5培養(yǎng)基裝液量對(duì)酶活的影響

培養(yǎng)基裝液量對(duì)產(chǎn)纖維素酶酶活的影響結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知：裝液量在20～60 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，菌株酶活也在增加；在裝液量為60 mL時(shí)，菌株酶活最大，但超過(guò)60 mL后，酶活呈下降趨勢(shì)。

表5　培養(yǎng)基裝液量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.6培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

使用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基，在最佳培養(yǎng)條件下，選擇不同溫度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，研究培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知：在37 ℃時(shí)酶活最高；當(dāng)溫度低于34 ℃或高于40 ℃時(shí)，酶活都會(huì)顯著下降。

表6　培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.7培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知：當(dāng)培養(yǎng)至30 h時(shí)，粗酶液的酶活最高，并且在24～36 h均可保持較高的酶活；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間低于18 h時(shí)，酶活呈直線下降趨勢(shì)，而高于42 h時(shí)酶活則緩慢下降。

表7　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.8培養(yǎng)基初始pH值對(duì)酶活的影響

分別配制不同初始pH值的培養(yǎng)基，其他條件按照上述最佳條件進(jìn)行，培養(yǎng)合適時(shí)間后，研究初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知：pH值在5.0時(shí)酶活最高；而pH值低于5.0或高于7.0時(shí)，纖維素酶酶活均快速下降。

表8　培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶酶活的影響

2.9優(yōu)化前后酶活對(duì)比

采用優(yōu)化前和優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，同時(shí)對(duì)B.LY02菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其產(chǎn)纖維素酶酶活，優(yōu)化結(jié)果顯示：優(yōu)化后所得的纖維素酶酶活可達(dá)0.683 5 U/mL，較優(yōu)化前的0.535 1 U/mL提高了約27.73%。

3討論

與其他微生物一樣，地衣芽孢桿菌所產(chǎn)酶的酶活受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響，如培養(yǎng)基的碳源、氮源、初始pH值、培養(yǎng)溫度、時(shí)間以及搖床轉(zhuǎn)速等[7，13]。因此，本文主要對(duì)這些產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。接種量會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)速度，從而影響其代謝產(chǎn)物的水平[14]。接種量的優(yōu)化結(jié)果表明：在接種量高于2.0%時(shí)，菌株產(chǎn)酶活性隨著接種量的增加呈逐漸下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著接種量的增加，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)消耗得太快，增殖的細(xì)菌量減少，菌株的產(chǎn)酶活性也隨之下降。本文研究結(jié)果顯示：隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，菌株產(chǎn)酶活性也在逐漸增加。這是因?yàn)锽.LY02菌株是一種完全需氧菌[5]，轉(zhuǎn)速提高，不僅會(huì)增加培養(yǎng)基的溶氧量，而且還有利于菌體與培養(yǎng)基的充分均質(zhì)，以利于菌株的生長(zhǎng)，菌株產(chǎn)酶活性自然就增加。但當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)200 r/min時(shí)，酶活呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)速過(guò)快會(huì)加速菌體的裂解，或加速菌株孢子體的形成，從而影響酶的產(chǎn)生。裝液量可影響培養(yǎng)液的溶氧量，因此也直接影響菌株的生長(zhǎng)速度。裝液量少會(huì)加速菌株的生長(zhǎng)，因此菌株產(chǎn)酶活性增加；裝液量過(guò)多，影響菌液的溶氧量和上下層培養(yǎng)液的均勻性，從而影響酶的快速產(chǎn)生。因此，在裝液量為60 mL時(shí)，菌株的產(chǎn)酶活性達(dá)到最大，隨后產(chǎn)酶活性下降。從研究結(jié)果看出：培養(yǎng)溫度和pH值對(duì)B.LY02菌株產(chǎn)纖維素酶的能力具有較大影響。在最佳pH值和最佳培養(yǎng)溫度前后，菌株的產(chǎn)酶活性下降都較快，這與文獻(xiàn)[15]試驗(yàn)結(jié)果相似。因此，在利用該菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶時(shí)要控制好培養(yǎng)溫度，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值，以最大限度地發(fā)揮菌株的產(chǎn)酶潛能。培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果表明：B.LY02菌株需要培養(yǎng)到一定時(shí)間后，才開(kāi)始快速分泌纖維素酶，培養(yǎng)36 h以后，菌株產(chǎn)酶活性緩慢下降。這是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)，產(chǎn)酶也隨之下降或停止，而已產(chǎn)生的酶可能會(huì)被多余的底物消耗或被離子螯合。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件對(duì)B.LY02菌株進(jìn)行培養(yǎng)后，其纖維素酶酶活達(dá)0.683 5 U/mL，雖然較出發(fā)菌株提高了約27.73%，但其產(chǎn)酶活性還不是很理想，期望通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行誘變選育可進(jìn)一步提高該菌株的產(chǎn)酶活性[16]。

本研究結(jié)果表明：按照2.0%的接種量將B. LY02菌株接種至60 mL(250 mL三角瓶)、碳源為麥芽糖、氮源為酵母膏、初始pH值為5.0的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在37 ℃、轉(zhuǎn)速為180～200 r/min條件下培養(yǎng)30 h，菌株所產(chǎn)纖維素酶酶活達(dá)0.683 5 U/mL，較優(yōu)化前提高了約27.73%。

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基金項(xiàng)目：河南省科技廳重大科技攻關(guān)基金項(xiàng)目(131100110300)；河南省教育廳重點(diǎn)基金項(xiàng)目(13B230987)

作者簡(jiǎn)介：余祖華(1977-)，女，河南商城人，講師，博士，主要從事動(dòng)物微生態(tài)學(xué)和動(dòng)物免疫學(xué)方面的研究.

收稿日期：2016-01-24

文章編號(hào)：1672-6871(2016)04-0076-05

DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.04.016

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A