包文霞，李 嶺 ，陶麗華，張海玲，龐 智

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，江蘇 蘇州 215006； 2.蘇州市立醫(yī)院北區(qū)消化科

中國(guó)漢族人群PRKCDBP基因多態(tài)性與炎癥性腸病的相關(guān)性研究

包文霞1，李 嶺1，陶麗華1，張海玲1，龐 智2

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，江蘇 蘇州 215006； 2.蘇州市立醫(yī)院北區(qū)消化科

目的 初步探討蛋白激酶C delta結(jié)合蛋白(protein kinase C, delta-binding protein, PRKCDBP)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs1051992)的遺傳多態(tài)性與中國(guó)漢族人群炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的發(fā)病易感性之間的關(guān)系。方法 選取81例IBD患者及50名健康體檢者作為研究對(duì)象，抽提基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction, RFLP-PCR)聯(lián)合基因測(cè)序驗(yàn)證檢測(cè)PRKCDBP基因rs1051992位點(diǎn)基因型，計(jì)算基因型及等位基因頻率。結(jié)果 克羅恩病(Crohn’s disease, CD)組、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)組及正常對(duì)照組PRKCDBP基因rs1051992位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，CD組與正常對(duì)照組、UC組與正常對(duì)照組rs1051992(T507C)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；蛐?臨床資料分析發(fā)現(xiàn)CD患者基因型分布與性別相關(guān)，CT基因型為男性CD患者發(fā)病的危險(xiǎn)因素(OR=12.8，95%CI: 2.095～78.597，P<0.05)，而與發(fā)病部位、疾病行為、有無(wú)肛周病變無(wú)關(guān)。UC患者基因型分布與性別、發(fā)病部位無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 PRKCDBP基因多態(tài)性可能與中國(guó)男性CD 患者發(fā)病相關(guān)。

炎癥性腸?。籔RKCDBP基因；單核苷酸多態(tài)性；漢族

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是慢性非特異性胃腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)。IBD發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究均提示IBD具有遺傳易感性，主要表現(xiàn)為同卵雙生子共患率高、家族聚集現(xiàn)象和不同人種IBD發(fā)病的種族差異性。目前為止，全基因組關(guān)聯(lián)研究和IBD的相關(guān)Meta分析已經(jīng)鑒定140種CD易感基因及47種UC易感基因，其中有28種兩者均易感。PRKCDBP是一種IBD新的候選基因,是一種腫瘤抑制蛋白，位于染色體11p15.5-15.4。最近，Kim等[1]發(fā)現(xiàn)PRKCDBP基因是韓國(guó)人口IBD的易感基因，本研究旨在研究PRKCDBP基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與中國(guó)漢族人群IBD的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年5月-2015年10月在蘇州市立醫(yī)院及蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院的臨床資料完整、彼此無(wú)血緣關(guān)系的IBD患者81例，男52例，女29例，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組制定的《中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見》[2]。其中CD患者49例，年齡19～60歲，平均年齡(37.8±11.0)歲；UC患者32例，年齡18～80歲，平均年齡(44.6±15.3)歲。納入同期健康體檢者50名作為正常對(duì)照，男27名，女23名，年齡24～74歲，平均年齡(42.0±12.9)歲，三組間年齡和性別相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他自身免疫性疾病，近1個(gè)月未使用糖皮質(zhì)激素治療，近3個(gè)月未使用免疫抑制劑，無(wú)近期明確感染病史，無(wú)嚴(yán)重心、肺和神經(jīng)、精神疾病，并除外糖尿病及其他內(nèi)分泌疾病患者、肝腎功能損傷者、服用避孕藥的女性育齡患者及創(chuàng)傷者等。

表1 IBD患者及健康對(duì)照者基本資料

Tab 1 Demographic characteristics of IBD patients and controls

CD組UC組正常對(duì)照組例數(shù)493250性別(男/女)33/1619/1327/23年齡(x±s,歲)37.8±11.044.6±15.342.0±12.9病史(x±s,年)6.3±2.65.6±3.2—年齡(A1/A2)33/1613/19—病變部位 L1/L2/L3/L4(CD)22/10/14/3—— E1/E2/E3(UC)—2/14/16—疾病行為 B1/B2/B319/20/10——肛周病變24/25——

注：A1:年齡<40歲，A2：年齡≥40歲。L1：末端回腸型，L2：結(jié)腸型，L3：回結(jié)腸型，L4：?jiǎn)渭兝奂吧舷佬?。E1：直腸炎，E2：左半結(jié)腸炎，E3：全結(jié)腸炎。B1：非狹窄非穿透型，B2：狹窄型，B3：穿透型。

1.2 試劑和儀器 dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、PvuⅡ限制性內(nèi)切酶、100 bp DNA Ladder(Thermo Scientific，美國(guó))，GelRed(Biotium，美國(guó))，基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司DP348)，引物(上海生工合成)，離心器，PCR儀(Biometra，德國(guó))，電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提?。核惺茉囌卟杉疎DTA抗凝靜脈血2 ml，DNA抽提采用血液基因組DNA提取試劑盒，按說(shuō)明書操作，DNA樣本置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)PRKCDBP基因的SNP位點(diǎn)(rs1051992)，設(shè)計(jì)相關(guān)的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，其上游序列為5′-GGCACTATCCTCTTCTCGCC-3′，下游序列為5′-TACCTTCTGCAATCCGGTGC-3′。

1.3.3 PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系內(nèi)含10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μl、25 mmol/L MgCl20.8 μl、dNTP Mix (0.4 μl)、上下游引物各0.8 μl、Taq DNA聚合酶0.2 μl、模板DNA 200 ng(1 μl)，以滅菌三蒸水補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸7 min。

1.3.4 基因型的判斷: 取8 μl PCR產(chǎn)物、1 μl的PvuⅡ限制性內(nèi)切酶及1 μl 10×Fast Digest Green Buffer混合，在37 ℃恒溫水浴箱中放置25 min，在2%瓊脂糖凝膠中電泳，于凝膠成像儀中拍照觀察結(jié)果。

1.3.5 PCR產(chǎn)物核苷酸序列測(cè)定： 隨機(jī)選取野生型、雜合子、突變純合子PCR產(chǎn)物各4例，由蘇州金唯智有限公司進(jìn)行序列測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算OR值和95%CI，并行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) CD組與正常對(duì)照組、UC組與正常對(duì)照組rs1051992 SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。

2.2 PRKCDBP基因rs1051992 SNP位點(diǎn)在CD及UC患者與正常對(duì)照組基因型和等位基因頻率分布 PRKCDBP基因rs1051992位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于391 bp(見圖1)，酶切后電泳拍照CC純合子表現(xiàn)為391 bp一條帶，TT純合子表現(xiàn)為304 bp、87 bp兩條帶，CT純合子表現(xiàn)為391 bp、304 bp、87 bp 3條帶(見圖2)?；驕y(cè)序結(jié)果示野生型為T，突變型為C，CC為藍(lán)色單峰，CT為紅色和藍(lán)色重疊的套峰，TT為紅色單峰(見圖3～5)。CD組與正常對(duì)照組、UC組與正常對(duì)照組該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因片段; 圖2 PRKCDBP基因T507C PCR-RFLP電泳結(jié)果 Fig 1 PCR amplification of the target genesegment; Fig 2 Result of electrophoresis of PRKCDBP gene T507C with PCR-RFLP

圖3 純合未突變(TT)；圖4 純合突變(CC)；圖5 雜合突變(CT)Fig 3 No homozygous mutation (TT); Fig 4 Homozygous mutation (CC); Fig 5 Heterozygous mutation (CT)

表2 rs1051992位點(diǎn)在IBD患者及健康對(duì)照者中的基因型及等位基因頻率分布

Tab 2 Genotypic and allelic frequencies of the rs1051992 polymorphism in IBD patients and controls

對(duì)照組[n(%)]CD組[n(%)]UC組[n(%)]對(duì)照vsCD組P值OR(95%CI)對(duì)照vsUC組P值OR(95%CI)TT8(16.0)4(8.2)4(12.5)0.0951.000.561.00CT19(38.0)29(59.2)16(50.0)3.050(0.805～11.569)1.684(0.427～6.642)CC23(46.0)16(32.6)12(37.5)1.391(0.357～5.417)1.043(0.260～4.183)T35(35.0)37(37.8)24(37.5)0.6870.888(0.497～1.585)0.7450.897(0.468～1.722)C65(65.0)61(62.2)40(62.5)

2.3 PRKCDBP基因rs1051992 SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與IBD患者臨床資料的關(guān)系 rs1051992位點(diǎn)在男性CD患者基因型分布與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CT基因型為男性CD患者發(fā)病的危險(xiǎn)因素(OR=12.8，95%CI：2.095～78.597，P<0.05)；而男性UC患者未見差異；女性IBD患者基因型及等位基因分布與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3～4)。rs1051992位點(diǎn)的基因型與CD及UC患者發(fā)病部位、疾病行為、有無(wú)肛周病變均無(wú)關(guān)(P>0.05)(見表5)。

表3 rs1051992位點(diǎn)在男性病例組及正常對(duì)照組中的基因型及等位基因頻率分布

Tab 3 Genotypic and allelic frequencies of the rs1051992 polymorphism in male patients with IBD and controls

對(duì)照組[n(%)]CD組[n(%)]UC組[n(%)]對(duì)照vsCD組P值OR(95%CI)對(duì)照vsUC組P值OR(95%CI)TT7(25.9)2(6.1)1(5.3)0.0021.000.0531.00CT6(22.2)22(66.7)10(52.6)12.800(2.095～78.597)11.670(1.139～119.542)CC14(51.9)9(27.3)8(42.1)2.200(0.379～13.351)4.000(0.414～38.649)T20(37.0)26(39.4)12(31.6)0.7920.900(0.431～1.898)0.5881.275(0.529～3.070)C34(63.0)40(60.6)26(68.4)

表4 rs1051992位點(diǎn)在女性病例組及正常對(duì)照組中的基因型及等位基因頻率分布

Tab 4 Genotypic and allelic frequencies of the rs1051992 polymorphism in female patients with IBD and controls

對(duì)照組[n(%)]CD組[n(%)]UC組[n(%)]對(duì)照vsCD組P值OR(95%CI)對(duì)照vsUC組P值OR(95%CI)TT1(4.3)2(12.5)3(23.1)0.6191.000.2621.00CT13(56.5)7(43.8)6(46.1)0.269(0.021～3.519)0.154(0.013～1.803)CC9(39.1)7(43.8)4(30.8)0.389(0.029～5.214)0.148(0.012～1.900)T15(32.6)11(34.4)12(46.2)0.8710.924(0.355～2.401)0.2540.565(0.210～1.515)C31(67.4)21(65.6)14(53.8)

表5 rs1051992位點(diǎn)的基因型與IBD患者臨床特征的相關(guān)性

Tab 5 Association between rs1051992 genotypes and IBD patients’ clinical characteristics

TTCTCC(TT+CT)vsCCP值(CC+CT)vsTTP值L1/L2/L3/L4(CD)1/1/1/115/5/9/06/4/4/20.5700.311B1/B2/B3(CD)1/2/111/11/77/7/20.6281.000肛周病變(有/無(wú))2/213/169/70.4780.931E1/E2/E3(UC)0/1/32/7/70/6/60.7420.696

3 討論

IBD是一種復(fù)雜的多基因病，目前國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種基因?yàn)镮BD的易感基因，PRKCDBP是一種腫瘤抑制蛋白，位于染色體11p15.5-15.4。最初，Izumi等[3]通過(guò)去血清法誘導(dǎo)蛋白激酶C結(jié)合蛋白的表達(dá)，并將其分離。Lee等[4]發(fā)現(xiàn)PRKCDBP可以通過(guò)加強(qiáng)P53蛋白的穩(wěn)定性誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。他們還發(fā)現(xiàn)PRKCDBP的轉(zhuǎn)錄是由于TNF-α通過(guò)NF-κB信號(hào)通路直接激活引起，作為TNF-α-NF-κB信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)，PRKCDBP在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在腸癌患者也可見到其表達(dá)缺失或下降[5]。TNF-α是一個(gè)重要的促炎細(xì)胞因子，不僅在炎癥過(guò)程中起作用，還涉及到凋亡、增殖及分化等過(guò)程[6]，參與結(jié)腸炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

Kim等[7]也發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸黏膜PRKCDBP的表達(dá)與TNF-α的表達(dá)高度相關(guān)，提示PRKCDBP在結(jié)腸的炎癥發(fā)展過(guò)程中有一定的作用，其調(diào)節(jié)異?？赡芘cIBD發(fā)病機(jī)制有關(guān)。目前已有數(shù)個(gè)研究報(bào)道了TNF-α基因與IBD發(fā)病的相關(guān)性，TNF-α及TNFSF1基因的啟動(dòng)子區(qū)的SNP與不同種族人群的遺傳易感性均有關(guān)[8]。但PRKCDBP基因的SNP研究較少，目前在許多惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)染色體11p15存在等位基因的缺失，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等[9]。我們有理由懷疑PRKCDBP可能成為IBD一個(gè)新的易感基因。

本研究選取PRKCDBP基因rs1051992位點(diǎn)研究中國(guó)漢族人群IBD的相關(guān)性，該位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，T(野生型)突變?yōu)镃(突變型)會(huì)導(dǎo)致其編碼氨基酸由亮氨酸變?yōu)楦彼?，Kim等[1]發(fā)現(xiàn)韓國(guó)人群IBD患者該位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率與健康對(duì)照組分布明顯不同，具體表現(xiàn)為IBD患者CC基因型頻率較正常對(duì)照組明顯升高，TT及CT基因型頻率未見明顯差異。此外，UC患者C等位基因頻率較正常對(duì)照組升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CD患者的C等位基因頻率較正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在我們的研究中，我們并沒有發(fā)現(xiàn)CD及UC組與正常對(duì)照組在基因型及等位基因頻率分布上有差異，進(jìn)一步根據(jù)臨床資料分析發(fā)現(xiàn)男性CD患者在基因型分布與正常對(duì)照組存在差異，CT基因型更易患CD，而等位基因頻率與正常人相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UC患者在性別上未見明顯差異，CD及UC患者該位點(diǎn)基因型與發(fā)病部位、疾病行為、有無(wú)肛周病變均無(wú)關(guān)。與Kim等[1]研究的結(jié)果不同，推測(cè)可能與我們研究樣本量較小，或者存在種族、地域的差異有關(guān)。

本研究結(jié)果表明PRKCDBP基因多態(tài)性可能與中國(guó)漢族人群男性CD發(fā)病相關(guān)，結(jié)合國(guó)外研究結(jié)果，提示IBD易感基因多態(tài)性存在明顯的地域、種族和病種差異。由于本研究納入的樣本量較小、地域較局限，因此還需進(jìn)一步行多中心、大樣本隊(duì)列研究以最終明確該基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群IBD發(fā)病的相關(guān)性。

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[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組. 中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見[J].中華內(nèi)科雜志, 2008, 47(1): 73-79. Inflammatory Bowel Disease Cooperation Group of Digestive Disease Association of Chinese Medical Association. Consensus of diagnosis and treatment standard in Chinese inflammatory bowel disease [J]. Chin J Intern Med, 2008, 47(1): 73-79.

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(責(zé)任編輯：李 健)

Association between the polymorphism of PRKCDBP gene and inflammatory bowel disease in Chinese Han population

BAO Wenxia1, LI Ling1, TAO Lihua1, ZHANG Hailing1, PANG Zhi2

1.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006; 2.Department of Gastroenterology, Suzhou Municipal Hospital (North Branch), China

Objective To investigate whether the single nucleotide polymorphism (SNP) of PRKCDBP gene is associated with inflammatory bowel disease (IBD) in Chinese Han population.Methods Genomic DNA from 131 individuals of Chinese Han origin including 81 patients with IBD and 50 healthy controls were analyzed for the SNP (rs1051992) of the PRKCDBP gene. SNP rs1051992 was genotyped by restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction (RFLP-PCR) and verified by DNA sequence analysis.Results The genotypes and allelic frequencies at PRKCDBP SNP of rs1051992 of CD patients, UC patients and normal controls were in Hardy-Weinberg equilibrium. There were no significant differences in the genotypes and allelic frequencies among CD patients, UC patients and normal controls (P>0.05). Genotype-clicinal data analysis suggested that genotypes distribution of CD patients was associated with gender. The CT genotype increased the risk of male patients with CD (OR=12.8, 95%CI: 2.095-78.597，P<0.05). No significant difference was observed among disease location, disease behavior, perianal lesions of CD patients and gender, disease distribution of UC patients (P>0.05).Conclusion The polymorphism of PRKCDBP gene may be associated with male patients with CD in Chinese Han population.

Inflammatory bowel disease; PRKCDBP gene; Single nucleotide polymorphism; Han nationality

包文霞，在讀碩士研究生，E-mail：20135232037@stu.suda.edu.cn

龐智，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，博士，研究方向：IBD的基礎(chǔ)與臨床治療。E-mail：pangzhi0273@sina.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.07.010

R574.62

A

1006-5709(2016)07-0752-04

2015-10-26