王啟章，陳茂剛，徐格林，劉新峰

1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床學(xué)院/南京軍區(qū)南京總醫(yī)院(南京 210002)；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院

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ERK抑制劑對(duì)1型糖尿病模型小鼠血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生的抑制作用

王啟章1，2，陳茂剛1，徐格林1，劉新峰1

1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床學(xué)院/南京軍區(qū)南京總醫(yī)院(南京 210002)；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院

摘要：目的探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)特異性抑制劑PD98059對(duì)1型糖尿病模型血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生的抑制作用。方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組，假手術(shù)組，1型糖尿病模型血管內(nèi)損傷組，PD98059干預(yù)組。各組小鼠于頸動(dòng)脈損傷后第28天處死并取右頸總動(dòng)脈，檢測(cè)頸動(dòng)脈管腔面積、內(nèi)膜面積、中膜面積及內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)。免疫組化檢測(cè)內(nèi)膜抗磷酸壓ERK(p-ERK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組相比，1型糖尿病模型血管內(nèi)損傷組術(shù)后28 d，管腔面積明顯縮小，內(nèi)膜面積、中膜面積及I/M明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜p-ERK及MMP-9水平也明顯增強(qiáng)(P<0.01)。PD98059干預(yù)組術(shù)后28 d，與1型糖尿病模型血管內(nèi)損傷組相比，管腔面積明顯增加，內(nèi)膜面積、中膜面積及I/M明顯降低(P<0.01)，頸動(dòng)脈內(nèi)膜MMP-9表達(dá)明顯減低，血脂及血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論ERK抑制劑可能通過(guò)抑制MMP-9減輕1型糖尿病高膽固醇飲食模型頸動(dòng)脈血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生。

關(guān)鍵詞：糖尿病；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；血管內(nèi)損傷；內(nèi)膜增生；小鼠

頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫及頸動(dòng)脈支架術(shù)后內(nèi)膜增生影響病人的遠(yuǎn)期預(yù)后，糖尿病病人發(fā)生率更高。關(guān)于頸動(dòng)脈血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生的確切機(jī)制沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論，因而針對(duì)內(nèi)膜增生原因行相應(yīng)的靶向性干預(yù)治療成為難點(diǎn)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)是一種絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，在內(nèi)膜增生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。本研究利用1型糖尿病內(nèi)膜增生模型，探討 ERK抑制劑對(duì)尿病高脂飲食小鼠血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生的抑制作用，并探討頸動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增生的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為C57BL/6品系小鼠，周齡為8周。清潔級(jí)雄性INS2AKITA小鼠(突變型)12只及同窩出生的野生型C57BL/6雄性小鼠6只，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2010-0001。羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。PD98059(ERK特異性抑制劑)購(gòu)自美國(guó)Tocris Bioscience公司。免疫組織化學(xué)SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物科技有限公司?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。高膽固醇飼料購(gòu)自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，飼料配方為： 基礎(chǔ)飼料87.5%；膽固醇2%；豬油10%；膽酸鈉0.5%。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組以INS2AKITA小鼠(是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的基因突變型1型糖尿病模型)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。小鼠分為3組，每組6只，周齡均為8周。第1組為假手術(shù)組：C57BL/6野生型雄性小鼠，普通飼料飲食，喂養(yǎng)8周后行分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，分離結(jié)束后縫合皮膚。第2組為糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組：INS2AKITA雄性小鼠，高膽固醇飼料飲食，喂養(yǎng)8周后行右側(cè)頸動(dòng)脈血管內(nèi)損傷；損傷開(kāi)始每日腹腔注射二甲基亞砜(DMSO) 30 μL，直至處死。第3組為PD98059干預(yù)組：INS2AKITA雄性小鼠，高膽固醇飼料飲食，喂養(yǎng)8周后行右側(cè)頸動(dòng)脈血管內(nèi)損傷；損傷開(kāi)始每日腹腔注射PD98059 30 mg/kg，直至處死。PD98059均用0.1%DMSO溶解。所有小鼠自由飲食水，單籠飼養(yǎng)，室溫20 ℃～25 ℃。均按分組條件喂養(yǎng)8周后，清晨麻醉處死前采血2 mL。麻醉處死后，立即取雙側(cè)頸總動(dòng)脈，左側(cè)頸總動(dòng)脈放入4%多聚甲醛固定；右側(cè)頸總動(dòng)脈放入凍存管，-80℃保存。

1.3頸動(dòng)脈血管內(nèi)探針損傷過(guò)程戊巴比妥鈉腹腔注射(0.5 mL/kg)麻醉后，仰位固定在手術(shù)臺(tái)上。于無(wú)菌條件下逐層分離皮下組織，暴露氣管。于氣管左側(cè)尋找右頸總動(dòng)脈，將頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用絲線結(jié)扎，用顯微止血夾分別夾住頸總動(dòng)脈近心段及頸內(nèi)動(dòng)脈；用顯微剪將頸外動(dòng)脈結(jié)扎近端剪一小切口；左手用顯微鑷將切口上端輕微拉起，右手將探針沿切口從頸外動(dòng)脈管腔進(jìn)入到頸總動(dòng)脈近心端，將探針沿頸總動(dòng)脈分別向上、下、左、右四個(gè)方向各來(lái)回抽拉3次。拔出探針，在頸外動(dòng)脈近心端用絲線結(jié)扎。緩慢松開(kāi)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈顯微止血夾。觀察有無(wú)出血。于傷口涂撒少許青霉素粉末，縫合傷口。放入25 ℃恒溫層流室，單籠喂養(yǎng)，每半小時(shí)觀察小鼠狀態(tài)，并于3 h后小鼠唇邊喂水。所有小鼠術(shù)后均存活。各組繼續(xù)按原來(lái)飼料喂養(yǎng)。各組小鼠于頸動(dòng)脈損傷后第28天清晨麻醉處死。處死前均抽血1 mL。處死后立即分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，并取出頸總動(dòng)脈放入4%多聚甲醛固定。

1.4檢測(cè)血糖、血清三酰甘油(TG)及總膽固醇(TC)水平采用生化法檢測(cè)血糖；采用日本Olympus Type AU2700自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TG及TC水平。

1.5頸動(dòng)脈管腔面積、內(nèi)膜面積、中膜面積、內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)檢測(cè)右側(cè)頸總動(dòng)脈4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，制成3 μm厚橫斷面切片，行HE染色。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)頸動(dòng)脈管腔面積、內(nèi)膜面積、中膜面積及I/M。

1.6免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜p-ERK(ERK的活化表現(xiàn)形式)及MMP-9水平將石蠟切片放入60 ℃烤箱，60 min；脫蠟，水化，抗原修復(fù)后滴加一抗，滴加二抗，繼而行DAB顯色； 復(fù)染，脫水，封片：中性樹(shù)膠；采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)檢測(cè)頸動(dòng)脈內(nèi)膜p-ERK，MMP-9表達(dá)進(jìn)行半定量。棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。以平均光密度乘以陽(yáng)性面積比即積分光密度值表示每張切片的陽(yáng)性蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野后取平均值。

2結(jié)果

2.1各組血糖及血脂(TC、TG)水平與假手術(shù)組相比， 糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組血糖明顯增高(P<0.01)。而與糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組相比， PD98059干預(yù)組血糖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠血糖、TG及TC比較(±s) 　mmol/L

2.2各組小鼠頸動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)比較與假手術(shù)組相比，糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組術(shù)后28 d，管腔面積明顯縮小，內(nèi)膜面積、中膜面積及I/M明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2、圖1。

PD98059干預(yù)組術(shù)后28 d，與糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組相比，管腔面積明顯增加，內(nèi)膜面積、中膜面積及I/M明顯降低(P<0.01)。

表2　各組實(shí)驗(yàn)小鼠頸總動(dòng)脈管腔面積、內(nèi)膜面積、中膜面積及比較(±s)

注：A為假手術(shù)組；B為內(nèi)膜增生模型組；C為PD98059干預(yù)組。

2.3各組小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜MMP-9水平的影響小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜MMP-9水平分別為：假手術(shù)組5.21±1.21，糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組28.22±6.57， PD98059干預(yù)組11.10±2.51。在糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組，與假手術(shù)組相比，術(shù)后28 d頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜MMP-9表達(dá)水平明顯增強(qiáng)(P<0.01)。而與糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組相比，PD98059干預(yù)組頸動(dòng)脈內(nèi)膜MMP-9水平明顯下降(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2。

圖2免疫組化檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜的MMP-9表達(dá)(×200)

2.4各組頸動(dòng)脈內(nèi)膜ERK比較小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜ERK分別為：假手術(shù)組5.28±2.36，糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組23.56±3.54，PD98059干預(yù)組8.79±3.68。與假手術(shù)組相比，糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組術(shù)后28 d頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜p-ERK明顯增強(qiáng)(P<0.01)，而與糖尿病鼠頸動(dòng)脈損傷組相比，p-ERK干預(yù)組頸動(dòng)脈內(nèi)膜p-ERK水平明顯下降(P<0.01)。

3討論

1型糖尿病屬于胰島素依賴型糖尿病，可發(fā)生于各年齡段，以兒童和青少年為主。由于胰島素及降糖藥物的普及，1型糖尿病病人生存率及生存質(zhì)量明顯提高，關(guān)于1型糖尿病病人動(dòng)脈硬化及內(nèi)膜增生的資料尚少，但是隨著1型糖尿病病人步入成年或老年化，飲食結(jié)構(gòu)的變化，往往會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗或高脂血癥[2]，因此，探討1型糖尿病病人血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜是否增生以及增生的機(jī)制具有重要的意義。

本研究中INS2AKITA小鼠模型，是一種位于7號(hào)染色體的Ins2Akita等位基因突變形成自發(fā)性的雜合子1型糖尿病小鼠，與人類(lèi)1型糖尿病發(fā)病機(jī)制較類(lèi)似。本研究顯示，將INS2AKITA 給予高膽固醇飲食，再進(jìn)行頸動(dòng)脈血管內(nèi)損傷，較假手術(shù)組相比，可見(jiàn)明顯的內(nèi)膜增生，表明實(shí)驗(yàn)建立的1型糖尿病頸動(dòng)脈損傷的內(nèi)膜增生模型建立成功，為糖尿病頸動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增生研究奠定良好的基礎(chǔ)。

ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK 超家族中重要的傳導(dǎo)通路之一，ERK通過(guò)磷酸化“瀑布樣”級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將細(xì)胞外信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、和組織浸潤(rùn)，與腫瘤、子宮內(nèi)膜及血管等組織的增殖、增生有有關(guān)。研究顯示ERK信號(hào)參與多種細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等)的增生過(guò)程[3]。Zhang等[4]研究顯示，脂聯(lián)素通過(guò)線粒體融合蛋白-2介導(dǎo)的Ras-Raf-Erk1 / 2的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)途徑的調(diào)制影響血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡。本研究顯示，抑制血管內(nèi)膜p-ERK表達(dá)可抑制血管內(nèi)中膜面積及I/M，減輕管腔狹窄，給予ERK抑制劑后，內(nèi)膜MMP-9表達(dá)明顯降低。MMP-9由體內(nèi)多種細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，是依賴鋅離子而降解各種細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，MMP-9活化可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管內(nèi)膜組織重構(gòu)，金屬蛋白酶造成內(nèi)彈力層間隙增寬，血管平滑肌細(xì)胞從中膜通過(guò)內(nèi)彈力層遷移到內(nèi)膜。因此，MMP-9表達(dá)上調(diào)是內(nèi)膜增生及細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要炎性介質(zhì)。在星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞，鱗狀上皮癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)增強(qiáng)[5-6]。另有研究顯示，G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合蛋白-1在肝細(xì)胞癌中通過(guò)激活ERK/MMP-9信號(hào)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[7]。說(shuō)明ERK/MMP-9通路在細(xì)胞增殖過(guò)程中起到重要作用。

雖然實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明ERK抑制血管內(nèi)損傷后內(nèi)密增生，但是藥物在體內(nèi)的代謝十分復(fù)雜，因此需行體外研究進(jìn)一步證實(shí)藥物對(duì)培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞增殖及遷移是否有影響。由于小鼠頸動(dòng)脈體積很小，損傷的頸動(dòng)脈提取的蛋白及mRNA有限，不能利用westernblot及RT-PCR檢測(cè)整個(gè)頸動(dòng)脈的炎癥因子基因及蛋白表達(dá)，利用免疫組織化學(xué)方法，定位內(nèi)膜，更準(zhǔn)確的檢測(cè)小鼠血管內(nèi)損傷后頸動(dòng)脈內(nèi)膜的MMP-9的表達(dá)水平。并且由于INS2AKITA小鼠樣本量有限，僅研究頸動(dòng)脈損傷后28 d該模型小鼠內(nèi)膜增生的變化情況，對(duì)其損傷后1周～2周、3個(gè)月及半年后的內(nèi)膜增生變化尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)表明， ERK抑制劑可減輕1型糖尿病高膽固醇飲食模型頸動(dòng)脈血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生；ERK抑制劑可能通過(guò)抑制MMP-9等抑制血管平滑肌細(xì)胞增生來(lái)減輕內(nèi)膜增生。體內(nèi)研究和臨床試驗(yàn)有待于進(jìn)一步證實(shí)特異性ERK抑制劑對(duì)糖尿病病人血管內(nèi)損傷后內(nèi)膜增生的醫(yī)治作用。

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(本文編輯薛妮)

Inhibition Effect of ERK Inhibitor on Intimal Hyperplasia after Carotid Endovascular Injury in Type 1 Diabetes Model

Wang Qizhang， Chen Maogang， Xu Gelin， Liu Xinfeng

Jinling Hospital，Southern Medical University， Nanjing 210002， Jiangsu， China； Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Shenzhen 518104， Guangdong， China

Abstract：Objective To investigate the inhibition effect of extracellular signal-regulated kinase(ERK) inhibitor on intimal hyperplasia after carotid endovascular injury.MethodsThe mice were divided into 3 groups： sham operation group，model group(type 1 diabetes model underwent damage of right common carotid artery)， PD98059 treatment group.HE staining was performed in carotid artery and Image Pro Plus 6.0 image analysis software was used to measure the lumen area， intimal area， medial area and intima/media area ratio (I/M).Immunohistochemical staining was performed to detect the expressions of p-ERK and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in carotid intima.ResultsCompared with sham operation group， the lumen area was decreased， the intimal area， medial area and I/M，the expressions of p-ERK and MMP-9 in carotid intima were significantly increased at 28 days after procedure in model group(P<0.01).Compared with model group，the lumen area was increased， the intimal area， medial area and I/M were decreased at 28 days after procedure in PD98059 treatment group(P<0.05).The expressions of p-ERK and MMP-9 were suppressed， but there was no statistical change for serum glucose， triglyceride (TG)， total cholesterol (TC) in PD98059 treatment group.ConclusionERK specific inhibitor can inhibit MMP-9 expression，and suppress intimal hyperplasia after carotid endovascular injury in type 1 diabetes mice with high cholesterol diet.

Key words：diabetes； extracellular signal-regulated kinase； matrix metalloproteinase-9； endovascular injury； intimal hyperplasia；mice

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81501193)；江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK20141373)

通訊作者：劉新峰， E-mail：wqzflm@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R587R255

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．012

文章編號(hào)：1672-1349(2016)08-0837-04

Corresponding Author：Liu xinfeng(Jinling Hospital，Southern Medical University， Nanjing 210002， Jiangsu， China)

(收稿日期：2015-07-01)