史國(guó)娟，康玉明，楊志明

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(太原 030001)；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

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高鹽飲食所致高血壓前期大鼠的中樞調(diào)控機(jī)制

史國(guó)娟1，康玉明2，楊志明1

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(太原 030001)；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

摘要：目的觀察不同含鹽量飼料對(duì)SD大鼠高血壓前期下丘腦室旁核神經(jīng)激素的影響，并探討其機(jī)制。方法選取體重160 g±5 g雄性SPF級(jí)SD大鼠30只，隨機(jī)分為3組：8%NaCl飲食組、4%NaCl飲食組、0.3% NaCl飲食組 (正常飲食組)，嚴(yán)格按各組別NaCl濃度制作大鼠飼料喂養(yǎng)。同時(shí)采用大鼠尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)監(jiān)測(cè)血壓，平均動(dòng)脈壓達(dá)高血壓前期血壓值水平后稱重，麻醉后處死動(dòng)物。采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)3組大鼠下丘腦室旁核p-Ikkβ及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)表達(dá)水平，DHE法原位檢測(cè)下丘腦室旁核氧化應(yīng)激水平。 結(jié)果8%NaCl組和4%NaCl組平均動(dòng)脈壓高于正常飲食喂養(yǎng)組(P<0.05)，8%NaCl組平均動(dòng)脈壓高于4%NaCl組(P<0.05)。8%NaCl組和4%NaCl組下丘腦室旁核p-Ikkβ、IL-1β及活性氧簇表達(dá)均高于正常飲食組(P<0.05)，8%NaCl組下丘腦室旁核p-Ikkβ、IL-1β及活性氧簇表達(dá)高于4%NaCl組(P<0.05)。結(jié)論高鹽飲食可使高血壓前期大鼠炎性細(xì)胞因子、活性氧簇表達(dá)增多，核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)激活。不同含鹽量導(dǎo)致上述因素變化量不同。

關(guān)鍵詞：高血壓前期；高鹽飲食；下丘腦室旁核；核轉(zhuǎn)錄因子；白細(xì)胞介素-1β

高血壓的病因包括遺傳因素和環(huán)境因素。其中，高鹽膳食已被大量流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)為高血壓患病的重要危險(xiǎn)因素。目前認(rèn)為，長(zhǎng)期限鹽有助于預(yù)防或減緩高血壓的發(fā)生發(fā)展，世界衛(wèi)生組織建議每日食鹽量不超過6 g。高鹽攝入除引起水鈉潴留外，也顯著影響血壓調(diào)控其他環(huán)節(jié)，如促發(fā)炎癥、氧化應(yīng)激、增強(qiáng)交感神經(jīng)系統(tǒng)活性和激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)、損害血管內(nèi)皮功能等。現(xiàn)代研究認(rèn)為高血壓時(shí)下丘腦室旁核(paravent ricular nucleus of hypothalamus，PVN)神經(jīng)激素類物質(zhì)，如腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)組分、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、炎性細(xì)胞因子(proinflammatory cytokines，PIC)表達(dá)增多且與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的激活相關(guān)[1]。Leeneen等[2]發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可使鹽敏感性大鼠下丘腦室旁核區(qū)細(xì)胞間質(zhì)Na+濃度增高，RAS組分和活性氧簇增多，腎交感神經(jīng)興奮增強(qiáng)，血壓升高，但導(dǎo)致中樞內(nèi)這些體液因子變化的因素尚未明確。那么對(duì)于不能確定為鹽敏感性或尚未達(dá)到臨床高血壓的正常人群，高鹽飲食是否也引起了中樞神經(jīng)激素改變有待研究。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組及模型制備選取體重160 g±5 g雄性SPF級(jí)SD大鼠(7周齡)30只，隨機(jī)分為3組：8%NaCl飲食組、4%NaCl飲食組、0.3%NaCl飲食組(正常飲食組)，嚴(yán)格按各組別NaCl濃度制作大鼠飼料，恒溫恒濕，自然光照下喂養(yǎng)。采用大鼠尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)監(jiān)測(cè)血壓，8%NaCl飲食組和含4%NaCl飲食組SD大鼠平均動(dòng)脈壓達(dá)高血壓前期水平后說明造模成功。稱重，麻醉后處死動(dòng)物。

1.2無創(chuàng)血壓測(cè)量將清醒大鼠放入無創(chuàng)血壓保溫箱中調(diào)至38 ℃，依次將阻斷器、傳感器套于大鼠尾部，蓋上棕色蓋，當(dāng)基線處出現(xiàn)大鼠脈搏時(shí)將箱體溫度調(diào)至34 ℃，待大鼠安靜后開始給大鼠尾部加壓，當(dāng)阻斷器開始放氣減壓至脈搏出現(xiàn)，此出現(xiàn)脈搏處記錄為收縮壓，繼續(xù)減壓會(huì)出現(xiàn)一個(gè)波峰，在波峰處則記錄為舒張壓，再繼續(xù)減壓，可記錄大鼠平均動(dòng)脈壓。連續(xù)測(cè)3次，取其平均值作為一個(gè)測(cè)量值，每周測(cè)1次，記錄血壓變化規(guī)律。

1.3標(biāo)本采集大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后開胸暴露心臟，用注射針頭刺入其左心室

尖部到達(dá)升主動(dòng)脈后用止血鉗固定，剪開右心耳，灌入1%多聚甲醛150 mL，待右心耳流出無色透明液體后再緩慢灌入4%多聚甲醛約400 mL直至其肝臟、四肢、頭頸部變硬，將頭剪下，用咬骨鉗咬開顱骨，仔細(xì)剝離完整的腦組織，于4%多聚甲醛中后固定，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存或行冰凍切片。用于免疫印跡的腦組織不需經(jīng)多聚甲醛固定，直接取材凍存。

1.4Western Blot檢測(cè)PVN中p-Ikkβ及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平①選取各組大鼠腦中PVN區(qū)域的組織放入5 μLEP管中，用酒精消毒過的眼科剪刀將組織剪碎后放置于冰上，超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎后用微量檢測(cè)儀定量蛋白質(zhì)的濃度，然后據(jù)不同的濃度對(duì)樣本進(jìn)行變性處理；②制膠，加入電泳緩沖液，加樣后電泳；③轉(zhuǎn)膜后用5%小牛血清封閉1 h；④加入一抗，4 ℃孵育過夜；⑤加入二抗，37 ℃條件下孵育2 h；⑥滴加現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光底物，顯影成像；⑦圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所拍膠片用NIH Image software軟件分別計(jì)算各自曝光條帶的面積和灰度的乘積，并計(jì)算出各指標(biāo)對(duì)應(yīng)曝光條帶所得乘積與β-actin 條帶所得乘積的比值。

1.5DHE染色原位檢測(cè)PVN氧化應(yīng)激將冰凍切片取出復(fù)溫后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)沖洗3次，每次3 min；避光稀釋DHE原液后滴加至切片上，37 ℃下孵育30 min；PBS液沖洗3次，每次3 min；熒光封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察，并用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1不同含鹽量飼料喂養(yǎng)對(duì)SD大鼠平均動(dòng)脈壓的影響與正常飲食組比較，8%NaCl組和4%NaCl組平均動(dòng)脈壓升高(P<0.05)，8%NaCl組平均動(dòng)脈壓高于4%NaCl組(P<0.05)。6周時(shí)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓，正常飲食組平均動(dòng)脈壓為(100±4) mmHg，而8%NaCl組和4%NaCl組平均動(dòng)脈壓分別為(132±6)mmHg和(124±5)mmHg，表示高鹽飲食組大鼠均達(dá)到高血壓前期血壓水平，造模成功。詳見圖1。

注：C為初始平均動(dòng)脈壓。與正常飲食組比較，*P<0.05；與4% NaCl組比較，+P<0.05。

圖1不同含鹽量飼料組血壓監(jiān)測(cè)

2.2Western Blot法檢測(cè)下丘腦室旁核IL-1β含量用Western Blot法在蛋白水平半定量檢測(cè)下丘腦室旁核IL-1β表達(dá)水平，灰度分析蛋白條帶后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示8%NaCl組和4%NaCl組下丘腦室旁核IL-1β表達(dá)均高于正常飲食組(P<0.05)，8% NaCl組下丘腦室旁核IL-1β表達(dá)高于4% NaCl組(P<0.05)。詳見圖2。

注：與正常飲食組比較，*P<0.05；與4%NaCl組比較，+P<0.05。

圖2下丘腦室旁核IL-1β表達(dá)

2.3Western Blot法檢測(cè)下丘腦室旁核p-Ikkβ含量8%NaCl組和4%NaCl組下丘腦室旁核p-Ikkβ表達(dá)均高于正常飲食組P<0.05，8%NaCl組下丘腦室旁核p-Ikkβ表達(dá)高于4%NaCl組(P<0.05)。詳見圖3。

注：與正常飲食組比較，*P<0.05；與4%NaCl組比較，+P<0.05。

圖3下丘腦室旁核p-Ikkβ含量

2.4DHE法測(cè)PVN氧化應(yīng)激水平8%NaCl組和4% NaCl組下丘腦室旁核過氧化物表達(dá)均高于正常飲食組(P<0.05)，8%NaCl組下丘腦室旁核過氧化物表達(dá)高于4%NaCl組(P<0.05)。詳見圖4。

注：與正常飲食組比較，*P<0.05；與4%NaCl組比較，+P<0.05。

圖4下丘腦室旁核DHE表達(dá)

3討論

高血壓前期是血壓介于高血壓和正常血壓之間的一種中間狀態(tài)，相當(dāng)于我國(guó)高血壓劃分中的正常高值，是臨床高血壓和一系列與血壓增高相關(guān)的心血管事件的前期[3]。高鹽攝入是高血壓的重要易患因素，由于其沒有達(dá)到臨床高血壓或沒有出現(xiàn)高血壓相關(guān)癥狀而缺乏重視。一系列限鹽實(shí)驗(yàn)均證實(shí)高度或中度限制鹽攝入量均能降低正常人或高血壓病人的收縮壓和舒張壓[4-5]。研究高鹽對(duì)于高血壓前期的影響及其機(jī)制意義重大。

下丘腦室旁核位于第三腦室下丘腦部的上端兩側(cè)，在維持心血管活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，PVN區(qū)域存在完整的腎素-血管緊張素系統(tǒng)、活性氧簇等活性物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)高血壓時(shí)中樞也有免疫細(xì)胞參與，炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多[6]。最近研究提示下丘腦室旁核細(xì)胞對(duì)高鹽飲食導(dǎo)致的鹽敏感性高血壓起著重要的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可使鹽敏感性大鼠PVN區(qū)細(xì)胞間質(zhì)Na+濃度增高，RAS組分和活性氧簇增多，腎交感興奮增強(qiáng)，血壓升高[2]。

大量研究證明，NF-κB 在高血壓中發(fā)揮重要作用。NF-κB 是1986年在B細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，在機(jī)體炎癥免疫、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。靜息狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB二聚體與IκB蛋白結(jié)合于胞漿中，細(xì)胞接受外來刺激后，NF-κB二聚體與IκB蛋白解聚，從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，暴露核定位信號(hào)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。研究證實(shí)，功能性的NF-κB幾乎出現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)所有類型的細(xì)胞，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、PIC和ROS能夠有效的激活多種細(xì)胞類型的NF-κB，NF-κB調(diào)控的靶基因產(chǎn)物多為炎癥反應(yīng)介質(zhì)，如炎性細(xì)胞因子[7]。有關(guān)心力衰竭大鼠中樞機(jī)制研究表明，心力衰竭時(shí)PVN區(qū)域NF-κB激活，并促進(jìn)了PVN區(qū)RAS組分、ROS及PIC的產(chǎn)生[1，8]。對(duì)經(jīng)外周靜脈泵入AngⅡ造成高血壓大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，高血壓時(shí)PVN區(qū)域NF-κB激活[9]。針對(duì)高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓前期大鼠，本實(shí)驗(yàn)觀察到8%NaCl組與4%NaCl組大鼠PVN區(qū)p-Ikkβ表達(dá)增多，說明高鹽可以使高血壓前期大鼠PVN區(qū)域NF-κB激活。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高鹽飲食導(dǎo)致的高血壓前期大鼠PVN區(qū)炎性細(xì)胞因子(IL-1β)表達(dá)增多。IL-1是體內(nèi)炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始動(dòng)因子，IL-1β是其主要活性形式[10]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3組大鼠PVN區(qū)ROS水平，發(fā)現(xiàn)高鹽飲食組PVN區(qū)ROS水平明顯高于正常飲食對(duì)照組，說明高鹽飲食可使高血壓前期大鼠PVN區(qū)氧化應(yīng)激水平提高，與Leeneen等[2]人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。說明炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激在高鹽致高血壓前期已經(jīng)存在。NF-κB的研究結(jié)果推測(cè)高鹽飲食致高血壓前期大鼠PVN區(qū)炎性細(xì)胞因子與活性氧簇表達(dá)增多，進(jìn)而激活了PVN區(qū)域NF-κB，產(chǎn)生了更多的NF-κB調(diào)控的靶基因產(chǎn)物，如IL-1β，其詳細(xì)相互關(guān)系及作用機(jī)制尚有待今后進(jìn)一步研究。

比較8%NaCl組和4%NaCl組SD大鼠PVN區(qū)p-Ikkβ、IL-1β及ROS表達(dá)水平，8%NaCl組均高于4%NaCl組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明高血壓前期大鼠PVN區(qū)神經(jīng)激素的變化與環(huán)境因素中高鹽的攝入量相關(guān)。這一結(jié)論解釋了人群研究發(fā)現(xiàn)的血壓升高與鹽攝入量呈劑量-效應(yīng)關(guān)系[11]，說明高度限鹽或中度限鹽有益于高血壓的防治。本實(shí)驗(yàn)初步揭示高鹽飲食在高血壓前期對(duì)PVN神經(jīng)激素的影響，證實(shí)了飲食含鹽量與機(jī)體平均動(dòng)脈壓的關(guān)系，為預(yù)防或減緩高血壓提供理論依據(jù)。

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(本文編輯薛妮)

The Central Mechanism of Prehypertensive Rats Induced by High-Salt Intake

Shi Guojuan，Kang Yuming，Yang Zhiming

The Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：Objective In this study， we conducted to assess the effect of high-salt diet on the neurohormone in hypothalamic paraventricular nucleus(PVN) and mean arterial pressure so as to explore the central mechanism of prehypertension.MethodsThirty Sprague-Dawley rats with baseline body weights between 155 and 165 grams fed with a normal salt diet(0.3% NaCl) or a high salt (4% NaCl) diet or a higher salt (8% NaCl) diet.Arterial pressure was determined every week by a tail-cuff occlusion and their recording system.After the mean arterial pressure of high-salt groups accord with prehypertension， all the rats were decapitated while were under anesthesia.We performed western blot or DHE to detect the expression of p-Ikkβ， interleukin(IL)-1β and reactive oxygen species(ROS) in PVN of the rats.ResultsHigh-salt diet resulted in higher mean arterial pressure compared with control rats.The arterial pressure of high-salt diet and medicated group had a reduction of 21.65 mmHg compared with control group.RSNA values elicited by Tan IIA administration was 67.97% of control group.Expression of IL-1β，p-Ikkβ and ROS in PVN of high-salt diet group was higher than that in control group.ConclusionThese observations from this study suggest that proinflammatory cytokines(PIC) and ROS are associated with NF-kB within PVN in high-salt diet induced prehypertension.The higher salinity had more effect on neurohormone in PVN of prehypertensive rats than the lower salinity.

Key words：prehypertension； high-salt intake； hypothalamic paraventricular nucleus； proinflammatory cytokines； reactive oxygen species

通訊作者：楊志明，E-mail：Zhimingyang800@sina.com

中圖分類號(hào)：R544.1R255.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．010

文章編號(hào)：1672-1349(2016)08-0829-04

Corresponding Author：Yang Zhiming

(收稿日期：2015-08-08)