包蕓+李瓊+唐峰

摘 要 目的：觀察乳腺癌患者術前短期化療對腫瘤細胞中P -糖蛋白（P-gp）以及相關因子表達的調(diào)節(jié)，并探討其臨床意義。方法：選擇2002—2007年40例乳腺浸潤性導管癌患者，均經(jīng)紫杉醇和表阿霉素治療后行改良根治術。對手術標本進行HE染色，比較患者化療前、后腫瘤大小、組織形態(tài)學變化及局部淋巴結轉移情況。采用免疫組化法檢測P-gp及相關因子[表皮生長因子受體（EGFR）、C-erbB-2、CD147、Ki67）表達。結果：化療后，40例患者中10例出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，4例有大片腫瘤組織壞死，腫瘤間質(zhì)膠原纖維彌漫增生，腫瘤細胞密度減少，散在分布。化療前、后P-gp陽性率分別為35.0%和60.0%（P>0.05），EGFR陽性率分別為42.5%和80.0%（P<0.01）；化療后C-erbB-2、CD147、Ki67陽性率均較化療前明顯下降。EGFR、P-gp和C-erbB-2表達與臨床分期、腫瘤大小、細胞核分級無關；化療前P-gp表達與EGFR、C-erbB-2和CD147無明顯相關性。結論：乳腺癌術前短期化療可有效殺傷腫瘤細胞，誘導EGFR表達增強，但并不引起CD147等會導致腫瘤轉移的下游因子表達，提示在腫瘤進展中腫瘤細胞的原發(fā)性耐藥與其侵襲力可能并無關聯(lián)。

關鍵詞 乳腺癌 P -糖蛋白 表皮生長因子受體 化療

中圖分類號：R737.9 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2016）10-0006-05

The effect of short-term chemotherapy preoperatively on P-glycoprotein expression in breast cancer

BAO Yun， LI Qiong， TANG Feng

（Department of Pathology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Objective： To observe the effect of short-term chemotherapy preoperatively on the expression of P-glycoprotein（P-gp）and some related factors in patients with breast cancer and its clinical significance. Methods： Forty patients with invasive ductal breast cancer confirmed by biopsy were treated with paclitaxel and epirubicin for 2-3 courses followed by modified radical mastectomy from 2002 to 2007. The surgical specimens were stained using HE， and tumor size， histological changes， and the local lymph node metastasis were compaired before and after chemotherapy. The expressions of P-gp and some related factors of epidermal growth factor receptor（EGFR）， C-erbB-2， CD147 and Ki67 were assessed by immunohistochemistry. Results： After chemotherapy， a large number of inflammatory cell infiltration was found in 10 cases and necrosis in 4 cases. It showed that the collagen fibers were proliferated and the density of cancer cells was reduced and scattered. The positive rate was 35.0% and 60.0% in P-gp expression（P>0.05）， and was 42.5% and 80.0% in EGFR expression befor and after chemotherapy（P<0.01）， respecitvely. The positive rates of C-erbB-2， CD147 and Ki67 were decreased after chemotherapy. The expressions of P-gp， EGFR and C-erbB-2 had no relation with clinical stage， tumor size and grade of the nucleus， so as the expression of P-gp， befor chemotherapy， with EGFR， C-erbB-2 and CD147. Conclusion： Short-term chemotherapy can kill tumor cells and increase the expression of EGFR， but does not alter the expressions of downstream factors such as CD147 that enough to cause the metastasis of tumor cells， which indicates that during the progression of breast cancer there was no relationship between invasion/ metastasis of tumor cells and primary drug resistance.

KEY WORDS breast cancer； P-glycoprotein； epidermal growth factor receptor； chemotherapy

化療可有效緩解甚至治愈某些人類腫瘤，但在臨床上，腫瘤細胞在化療進程中普遍會產(chǎn)生耐藥性，特別是多藥耐藥（MDR），從而嚴重影響腫瘤治療的臨床療效。腫瘤細胞耐藥機制較復雜[1-2]，與細胞周期、增生狀態(tài)及生化機制如解毒、細胞藥物運輸或DNA復制和修復有關[3]。已發(fā)現(xiàn)跨膜藥泵基因擴增是造成耐藥的最重要原因，對MDR研究最多的是MDR1基因。該基因編碼的細胞膜上的P-糖蛋白（P-gp）能將化療藥物從細胞內(nèi)泵至細胞外而引起腫瘤耐藥，當腫瘤暴露于某一化療藥物后，可以上調(diào)MDR1基因表達，從而誘發(fā)腫瘤對其他多種化療藥物耐受。有研究證實P-gp表達與CD147表達密切相關，提示腫瘤細胞的獲得性耐藥與其侵襲性增強

密切相關[4]。

目前，乳腺癌術前化療因具有可使瘤體縮小、降低腫瘤細胞活力、防止術中瘤細胞播散和轉移等而普遍采用。但是，短期化療對腫瘤細胞的MDR和腫瘤轉移產(chǎn)生的效果尚少有評價。本研究對化療前、后乳腺癌組織進行檢測，探討乳腺癌中P-gp表達與表皮生長因子受體（EGFR）、C-erbB-2、CD147表達間的關聯(lián)，以期發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞原發(fā)性耐藥與侵襲力間的關系。

1 材料及方法

1.1 一般資料

收集上海復旦大學附屬華山醫(yī)院2002—2007年乳腺浸潤性導管癌患者40例，年齡31～68歲，平均51歲，均經(jīng)活檢病理證實，在行乳腺改良根治術前經(jīng)紫杉醇及表阿霉素治療2～3個療程。按TNM分期，Ⅲa 37例，其中34例腫瘤直徑>5 cm，3例<5 cm；Ⅱb 3例，腫瘤直徑均<5 cm。手術后證實淋巴結轉移26例（65.0%）。

1.2 方法

1.2.1 病理觀察

取乳腺穿刺標本（大部分為條索狀組織）5～10條，長度1.0～1.2 cm，直徑0.1～0.2 cm；乳腺手術標本分別于腫塊及交界處取材（1 cm×1 cm×0.3 cm），所有標本用4%甲醛液固定，石蠟包埋，切片（厚4 mm），常規(guī)HE染色。

1.2.2 免疫組化檢測

實驗中P-gp（Labvision）、EGFR（Labvision）、C-erbB-2（Dako）、CD147（Dako）和Ki67（Novocastia）一抗均按1∶50稀釋，采用EnVision兩步法染色。①石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟3次。②經(jīng)100%、95%、80%乙醇蒸餾水水化，蒸餾水充分洗凈。③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：0.3% H2O2甲醇液置室溫10 min，TBS（0.05 mol/L，pH 7.6，下同）洗5 min×3次。④微波高溫法抗原修復：枸櫞酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）高溫預熱10 min，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中火加熱5 min×2次，低火保溫5 min，取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水洗2次后用TBS洗5 min×3次。⑤去除組織非特異性吸附：5%小牛血清37 ℃孵育20 min（無需洗凈）。⑥滴加一抗（陰性對照片以TBS代替一抗）37 ℃溫箱1 h，TBS洗5 min×3次。⑦滴加二抗：EnVision抗鼠工作液，37 ℃溫箱1 h，TBS洗5 min×3次。⑧辣根過氧化物酶新鮮配制DAB顯色液：10 ml TBS液中加入4 mg DAB，充分混勻，滴加0.5 ml H2O2，室溫下顯色10 min。⑨常規(guī)蘇木精復染細胞核1 min，充分水洗，烘干，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 免疫組化結果評定

P-gp：陽性反應物主要表達于腫瘤細胞膜上，細胞質(zhì)中也有少量表達，呈棕黃色顆粒狀。以腫瘤細胞染色強弱程度進行半定量測定，每張切片隨機選取10個高倍視野，以陽性細胞所占比例的平均值定義為陽性細胞率（%）。判斷標準：陽性細胞≤10%為（-）；>10%～25%為（+）；>25%～75%為（++）；>75%為（+++），并重復2次。

EGFR和CD147：陽性反應物質(zhì)大多位于細胞膜，細胞質(zhì)內(nèi)亦有少量。光鏡下觀察5個具有代表性的高倍視野，分別計數(shù)200個細胞，共1 000個細胞。按陽性細胞所占比例分別計分，陽性細胞百分數(shù)0計0分，1%～50%計1分，51%～80%計2分，>80%計3分。染色深度以大多數(shù)細胞的呈色反應為準，不著色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，深棕黃色計3分。根據(jù)這2項指標的分數(shù)之和分為4級，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強陽性（+++）。

C-erbB-2：陽性表達為細胞膜呈清晰的棕色染色。強度評定分為-、+、++和+++，腫瘤細胞無著色為（-），<10%的腫瘤細胞胞膜輕度著色為（+），>30%的腫瘤細胞出現(xiàn)連續(xù)而完整的強胞膜陽性為（+++），介于中間者為（++）。

Ki67蛋白：陽性染色為腫瘤細胞核呈棕黃色顆粒，每張切片隨機選取10個高倍視野，以陽性細胞所占比例的平均值定義為陽性細胞率（%）。判斷標準：陽性細胞≤10%為（-）；>10%～25%為（+）；>25%～75%為（++）；>75%為（+++），并重復2次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料用百分率表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病理觀察

大體可見乳腺組織呈灰紅和灰黃色。光鏡下見化療前腫瘤細胞呈巢狀、片狀分布（圖1a），腫瘤伴壞死1例（2.5%），伴炎癥細胞浸潤2例（5.0%）。細胞核有異形，核分級Ⅰ級4例，Ⅱ級31例，Ⅲ級5例。化療后腫瘤組織出現(xiàn)明顯變化，主要改變有10例出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤（圖1b），其中4例伴有大片壞死（圖1c）；腫瘤間質(zhì)膠原纖維彌漫增生，腫瘤細胞密度減少，呈散在分布（圖1d）。

圖1 腫瘤細胞化療前、后形態(tài)學特征（HE，×200）

2.2 免疫組化觀察

40例患者中，化療前P-gp表達陰性26例，陽性14例（35.0%），化療后表達陰性16例，陽性24例（60.0%），治療前、后P-gp表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 P-gp與臨床及各蛋白間的關系

P-gp表達與腫瘤臨床分期、大小、細胞核分級及淋巴結轉移無明顯相關性（表1）；與EGFR、C-erbB-2、CD147蛋白表達均無明顯相關性（表2）。

3 討論

腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成化療失敗的主要原因，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤耐藥的分子機制很復雜，目前認為主要有4個方面：①跨膜藥泵基因的擴增或過表達，這類基因以MDR1（產(chǎn)生P-gp）最為重要[5-7]，另外，還發(fā)現(xiàn)一些耐藥相關分子如多藥耐藥相關蛋白（MRP）；②細胞內(nèi)一些蛋白酶的變化引起細胞解毒功能增強，如谷胱甘肽S轉移酶Pi的表達或活性增加；③核酶DNA拓撲異構酶Ⅱ含量減少或性質(zhì)改變；④其他因素，其中跨膜藥泵基因的擴增被認為是造成耐藥的最重要原因。

MDR1定位于第7號染色體，基因蛋白編碼區(qū)由27個外顯子組成，其編碼的170×103的P-gp屬于腺苷三磷酸結合蛋白超家族成員，P-gp的主要生理功能可能與各種保護屏障有關，在耐藥細胞膜上過表達。P-gp具有ATP依賴性藥物泵功能，當腫瘤細胞與抗癌藥物接觸時，脂溶性藥物按濃度梯度進入細胞，在細胞內(nèi)，藥物與P-gp結合，同時水解ATP獲得能量，將藥物從細胞內(nèi)泵出，細胞內(nèi)藥物濃度不斷下降，使藥物對細胞的損傷減弱直至消失，最終出現(xiàn)耐藥[8-10]。

Yang等[8]將耐藥小鼠白血病細胞接種于同種小鼠腹腔后用P-gp相關藥物治療，與接種耐藥腫瘤細胞后用P-gp不相關藥物治療或接種不耐藥腫瘤細胞用同樣化療藥物相比，其肝臟轉移程度更為明顯，小鼠帶瘤生存時間也較短。這一現(xiàn)象提示P-gp的表達及其轉運藥物能力與腫瘤細胞的侵襲轉移之間可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。Yang等[4]的后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素誘導的耐藥乳腺癌細胞株（MCF7/AdrR）CD147和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達明顯高于不耐藥細胞，提示耐藥細胞的高侵襲性可能與CD147的表達增強有關。文獻中也有報道腫瘤細胞分泌的CD147可以通過自分泌和旁分泌作用刺激腫瘤周圍成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞自身產(chǎn)生多種MMP降解周圍基質(zhì)而引起腫瘤浸潤轉移[11]。

然而，少有P-gp與CD147的內(nèi)在聯(lián)系以及MDR藥物在其中作用的報道，特別是惡性腫瘤術前短期化療中是否存在上述現(xiàn)象亦少見報道。我們前期的體外研究發(fā)現(xiàn)，MDR藥物可以引起MCF7/AdrR細胞EGFR表達增強，而非MDR相關藥物（博萊霉素）或用MDR藥物作用于不耐藥腫瘤細胞（MCF7）均無此作用。我們的實驗以及文獻報道均揭示EGFR能刺激腫瘤細胞產(chǎn)生CD147，從而誘導P-gp表達[12-13]。EGFR還參與了P-gp的磷酸化，從而使腫瘤細胞內(nèi)藥物的蓄積總量持續(xù)下降，引發(fā)耐藥[14]。用P-gp中和抗體Hyb-241預處理MCF7/ Adr細胞后，可以出現(xiàn)與EGFR抑制劑AG1478相同的作用，即MDR藥物的上述作用被完全阻斷[15]，說明MDR藥物促進腫瘤細胞侵襲轉移的機制中有P-gp功能活化的參與。

本研究發(fā)現(xiàn)，術前乳腺癌組織P-gp表達與MDR藥物治療后腫瘤組織EGFR、C-erbB-2和CD147無明顯相關性，提示乳腺癌的原發(fā)性耐藥與腫瘤侵襲力增強之間可能并無關聯(lián)。這與我們以前發(fā)現(xiàn)不耐藥乳腺癌細胞MCF7經(jīng)MDR1基因轉染后可以獲得耐藥性，但并不呈現(xiàn)上述MCF7/AdrR的類似表現(xiàn)相一致。這可能預示在化療藥物誘導MDR過程中還有目前尚不知的腫瘤細胞結構或功能變化，而這些變化是MDR藥物促進腫瘤細胞侵襲轉移所必需。

綜上所述，本研究顯示原發(fā)性MDR（術前腫瘤細胞表達P-gp）可能與腫瘤細胞侵襲能力之間并無內(nèi)在聯(lián)系，以往體外實驗中MDR藥物促進MDR細胞侵襲和轉移的內(nèi)在機制有待進一步探討。臨床上腫瘤術前短期化療是安全的。

參考文獻

[1] Lacueva FJ， Teruel A， Calpena R， et al. Detection of P-glycoprotein in frozen and paraffin-embedded gastric adenocarcinoma tissues using a panel of monoclonal antibodies[J]. Histopathology， 1998， 32（4）： 328-334.

[2] Meijer GA， Schroeijers AB， Flens MJ， et al. Increased expression of multidrug resistance related proteins Pgp， MRP1， and LRP/MVP occurs early in colorectal carcinogenesis[J]. J Clin Pathol， 1999， 52（6）： 450-454.

[3] Hutter G， Sinha P. Proteomics for studying cancer cells and the development of chemoresistance[J]. Proteomics， 2001， 1（10）： 1233-1248.

[4] Yang JM， Xu Z， Wu H， et al. Overexpression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells[J]. Mol Cancer Res， 2003， 1（6）： 420-427.

[5] Hoffmann J， Schmidt-Peter P， Hansch W， et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markersin early passage human sarcomas[J]. Clin Cancer Res， 1999， 5（8）： 2198-2204.

[6] Arts HJ， Katsaros D， Vries EGD， et al. Drug resistanceassociated markers P-glycoprotein， multidrug resistance- associated protein 1， multidrug resistance-associated protein 2， and lung resistance[J]. Clin Cancer Res， 1999， 5（10）： 2798-2805.

[7] Robey-Cafferty SS， Bruner JM， Caffery LL. P-glycoprotein expression in gastroesophageal adenocarcinomas， their metastases， and surrounding mucosa： a mapping study[J]. Mod Pathol， 1991， 4（6）： 694-697.

[8] Yang JM， Yang GY， Medina DJ， et al. Treatment of multidrug resistant （MDR1） murine leukemia with P-glycoprotein substrates accelerates the course of the disease[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1999， 266（1）： 167-173.

[9] Leeuwen FW， Buckle T， Kersbergen A， et al. Noninvasive functional imaging of P-glycoprotein-mediated doxorubicin resistance in a mouse model of hereditary breast cancer to predict response， and assign P-gp inhibitor sensitivity[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging， 2009， 36（3）： 406-412.

[10] Ambudkar SV， Kimchi-Sarfaty C， Sauna ZE， et al. P-glycoprotein： from genomics to mechanism[J]. Oncogene， 2003， 22（47）： 7468-7485.

[11] Guo H， Li R， Zucker S， et al. EMMPRIN （CD147）， an inducer of matrix metalloproteinase synthesis， alsobinds interstitial collagenase to the tumor cell surface[J]. Cancer Res， 2000， 60（4）： 888-891.

[12] Menashi S， Serova M， Ma L， et al. Regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer and matrix metalloproteinase expression by amphiregulin in transformed human breast epithelial cells[J]. Cancer Res， 2003， 63（22）： 7575-7580.

[13] Shi Y， Ouyang P， Sugrue SP. Characterization of the gene encoding pinin/DRS/memA and evidence for itspotential tumor suppressor function[J]. Oncogene， 2000， 19（2）： 289-297.

[14] Yang JM， Sullivan GF， Hait WN. Regulation of the function of P-glycoprotein by epidermal growth factor through phospholipase C[J]. Biochem Pharmacol， 1997， 53（11）： 1597-1604.

[15] Li QQ， Wang WJ， Xu JD， et al. Up-regulation of CD147 and matrix metalloproteinase-2， -9 induced by P-glycoprotein substrates in multidrug resistant breast cancer cells[J]. Cancer Sci， 2007， 98（11）： 1767-1774.