吳　隼，黃　琰，楊　滿，字友梅，馬　棟，賀立山

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100)

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ISCOM型白血病瘤苗對小鼠巨噬細(xì)胞作用的研究*

吳隼，黃琰，楊滿，字友梅，馬棟，賀立山

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，河南新鄉(xiāng) 453100)

[摘要]目的探討免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)型白血病瘤苗對小鼠巨噬細(xì)胞的作用。方法將C57BL/6小鼠30只分為模型組、滅活的紅白血病細(xì)胞(FBL-3)瘤苗組(滅活瘤苗組)和滅活的FBL-3細(xì)胞+ISCOM瘤苗組(ISCOM瘤苗組)，小鼠注射FBL-3細(xì)胞建立白血病荷瘤小鼠模型，治療4周后，分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀察不同組別的巨噬細(xì)胞吞噬功能、一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、巨噬細(xì)胞殺傷活性和抗原呈遞功能。結(jié)果ISCOM瘤苗組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量、巨噬細(xì)胞吞噬功能、IL-1、TNF-α、IL-2、T細(xì)胞增殖能力和NO高于模型組和滅活瘤苗組(P<0.05)，ISCOM瘤苗組巨噬細(xì)胞細(xì)胞殺傷活性顯著高于模型組(P<0.01)。結(jié)論ISCOM型瘤苗可以增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用及抗原呈遞能力。

[關(guān)鍵詞]白血病瘤苗；巨噬細(xì)胞；ISCOMs

目前血液惡性腫瘤多以化療為主，但近年來國內(nèi)外在主動(dòng)免疫治療白血病方面研究甚多,腫瘤疫苗可通過激活患者自身免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)[1-2]。本研究在前期的研究中發(fā)現(xiàn)免疫刺激復(fù)合物(immunostimulating complex，ISCOM)型白血病瘤苗可增強(qiáng)荷瘤小鼠的巨噬細(xì)胞(Mφ)活性和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，達(dá)到改善荷瘤小鼠的非特異性免疫和細(xì)胞免疫功能的作用，在此基礎(chǔ)上，本文旨在探討ISCOM型白血病瘤苗對小鼠巨噬細(xì)胞的作用。

1材料與方法

1.1材料(1)主要試劑：小鼠IL-1 Elisa試劑盒(華美生物工程公司)；小鼠TNF-α Elisa試劑盒(華美生物工程公司)；NO檢測試劑盒(南京建成公司)；小鼠IL-2 Elisa試劑盒(華美生物工程公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO，美國)；脂肪酶蛋白(SIGMA，美國)；卵磷脂(SIGMA，美國)；膽固醇(SIGMA，美國)；絲裂霉素C(SIGMA,美國) ；胎牛血清(GIBCO，美國)；MTT(SIGMA，美國)；皂苷(SIGMA，美國)；Mega-10(Amresco，美國)；[3H]-TdR(中科院上海原子能研究所，中國)。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株：C57BL/6小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量18.0～22.0 g，雌雄各半，購買于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。紅白血病細(xì)胞(FBL-3)細(xì)胞株購買于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1瘤苗的制備ISCOM疫苗的制備[3]：皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白(1 mg/mL)使其濃度為0.02 mg/mL，7 ℃反應(yīng)12 h，隨后加入80 μL脂類混合物溶液和5 mL皂苷溶液(1 mg/mL)，室溫下反應(yīng)4 h。冰浴超聲處理，透析，濃縮，4 ℃保存?zhèn)溆?。脂類混合物溶液的配制[4]：將卵磷脂和膽固醇溶解于20%的Mega-10溶液中，調(diào)整濃度為10 mg/mL；皂苷溶液的配制：皂苷溶解于PBS溶液中，調(diào)整濃度為1 mg/mL。FBL-3細(xì)胞內(nèi)加入絲裂霉素C(100 μg/mL)，于37 ℃水浴中放置30 min，滅活。滅活的FBL-3細(xì)胞制備：FBL-3細(xì)胞內(nèi)加入絲裂霉素C(100 μg/mL)，于37 ℃水浴中放置30 min，PBS液洗3次，使用生理鹽水重新調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。

1.2.2瘤苗免疫動(dòng)物模型的建立所有小鼠均建立負(fù)瘤小鼠模型[5]，F(xiàn)BL-3培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，取0.2 mL 1×106/mL細(xì)胞注射于鼠左肋皮下于3～7 d可觸及腫瘤后[6]。將30只SPF級C57BL/6小鼠分為3組，模型組、滅活的FBL-3瘤苗組(滅活瘤苗組)和滅活的FBL-3細(xì)胞+ISCOM瘤苗組(ISCOM瘤苗組)，各組均進(jìn)行荷瘤小鼠動(dòng)物模型的建立，模型組采用等體積的生理鹽水進(jìn)行治療，上述各組均每周治療1次，治療時(shí)在腫瘤部位注射瘤苗0.2 mL，治療維持4周。

1.2.3小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力、殺傷活性、促炎因子和抗原呈遞能力測定小鼠腹腔灌注RPMI1640培養(yǎng)基收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，37 ℃、5%CO2、RPMI1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。分離巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)考察不同組別中小鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量的改變。吞噬能力：將醛化的雞紅細(xì)胞注入小鼠腹腔檢測腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，吞噬指數(shù)(%)=吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100%[7]。促炎因子：采用一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素(IL)-1和腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液表達(dá)水平。殺傷活性：采用MTT測量各組治療后的巨噬細(xì)胞殺傷活性?？乖蔬f能力測定：分離不同組別瘤苗免疫小鼠T細(xì)胞，將分離巨噬細(xì)胞共孵育，采用IL-2檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中IL-2水平和[3H]-TdR摻入法檢測T細(xì)胞增殖能力[8]。

2結(jié)果

2.1各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量比較模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為(3.82±1.24)×106，滅活瘤苗組為(4.16±1.41)×106，ISCOM瘤苗組為(7.43±2.27)×106；ISCOM瘤苗組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著高于模型組、滅活瘤苗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.37、3.86，P<0.01)，見圖1。

a：P<0.01，與ISCOM瘤苗組比較。

圖1各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量比較

2.2各組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能比較模型組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)為(29.50±8.20)%，滅活瘤苗組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)為(54.80±11.50)%，ISCOM瘤苗組巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)為(68.30±16.30)%，ISCOM瘤苗組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能高于模型組(t=6.72,P<0.01)和滅活瘤苗組(t=2.14,P<0.05)。

2.3各組小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1、TNF-α及NO水平比較ISCOM瘤苗組小鼠IL-1高于模型組、滅活瘤苗組(t=7.36、2.45，P<0.05)，滅活瘤苗組IL-1高于模型組(t=6.04，P<0.01)；ISCOM瘤苗組TNF-α高于模型組、滅活瘤苗組(t=7.13、3.34，P<0.01)，滅活瘤苗組TNF-α高于模型組(t=3.92，P<0.01)；ISCOM瘤苗組NO高于模型組、滅活瘤苗組(t=9.76、3.71，P<0.01)，滅活瘤苗組NO高于模型組(t=6.69，P<0.01)，見表1。

2.4各組小鼠巨噬細(xì)胞殺傷活性比較模型組小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞殺傷活性為(34.23±9.67)%，滅活瘤苗組為(60.32±14.07)%，ISCOM瘤苗組為(69.47±14.79)%，ISCOM瘤苗組、滅活瘤組小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞殺傷活性顯著高于模型組(t=6.31、4.83，P<0.01)；滅活瘤苗組和ISCOM瘤苗組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.5各組小鼠巨噬細(xì)胞抗原提呈能力比較ISCOM瘤苗組IL-2高于模型組、滅活瘤苗組(t=2.34、2.42，P<0.05)；ISCOM瘤苗組T細(xì)胞增殖能力高于模型組、滅活瘤苗組(t=2.78、2.68，P<0.05)，見表2。

表1　各組小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1、TNF-α及

a：P<0.01，與模型組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與滅活瘤苗組比較。

aP<0.01，與模型組比較。

圖2　各組小鼠巨噬細(xì)胞殺傷活性比較

a：P<0.05，與ISCOM瘤苗組比較。

3討論

ISCOM是一種全新的抗原提呈系統(tǒng)，具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，ISCOM是由皂苷、膽固醇、磷脂、蛋白質(zhì)抗原等構(gòu)成的直徑為30～40 nm的球形籠狀顆粒[9]。ISCOM具有增強(qiáng)免疫和抗原遞呈的功能，且能同時(shí)刺激體液和細(xì)胞免疫[10]。用腫瘤疫苗進(jìn)行主動(dòng)特異性免疫治療是一種理想的免疫治療方法。腫瘤疫苗可以激發(fā)全身性細(xì)胞免疫，提高免疫細(xì)胞殺傷腫瘤的能力，并可誘發(fā)長期抗腫瘤免疫功能，防止腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[11]。單核-巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞,廣泛分布于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，可通過主動(dòng)吞噬、殺傷、消化病原體,清除體內(nèi)衰老突變的腫瘤細(xì)胞,在抑制腫瘤細(xì)胞腹腔轉(zhuǎn)移過程中起到重要的免疫作用[12]。因此，本文中觀察了ISCOM型瘤苗對荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響，以探究巨噬細(xì)胞在ISCOM型瘤苗抗腫瘤作用中扮演的作用。

巨噬細(xì)胞可以分泌促炎癥因子IL-1、TNF-α和NO，IL-1可促進(jìn)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、促進(jìn)傷口愈合及刺激造血功能等[13]。TNF-α參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及抗腫瘤等[14]，還能夠誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的釋放。巨噬細(xì)胞受到刺激活化時(shí)，釋放的大量NO具有細(xì)胞毒作用，可殺傷微生物(細(xì)菌、真菌、病毒)、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞等，亦可誘發(fā)炎癥反應(yīng)保護(hù)機(jī)體抵御外界不利因素的侵害[15]。本研究結(jié)果顯示，ISCOM瘤苗組小鼠腹腔體內(nèi)的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著高于模型組和滅活瘤苗組，且巨噬細(xì)胞吞噬功能、殺傷活性、抗原提呈活性顯著增高，IL-1、TNF-α和NO表達(dá)水平亦顯著優(yōu)于模型組和滅活瘤苗組，此結(jié)果顯示ISCOM型瘤苗對荷瘤小鼠免疫后，巨噬細(xì)胞數(shù)量和活力均得到增強(qiáng)。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體抗原提呈細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞在ISCOM型瘤苗介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)中起重要作用。

綜上所述，ISCOM型瘤苗可以增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用及抗原呈遞能力，也意味著提高了荷瘤小鼠的非特異性細(xì)胞免疫功能，如免疫監(jiān)視、抗原遞呈等，以便活化T淋巴細(xì)胞。白血病作為血液惡性腫瘤，臨床中需考慮化療后或骨髓移植后對殘留微小病灶的治療及預(yù)防復(fù)發(fā)，而ISCOM型瘤苗明顯提高荷瘤小鼠的巨噬細(xì)胞殺傷功能，為進(jìn)一步激活T淋巴細(xì)胞創(chuàng)造條件。在臨床中，白血病患者治療后采用ISCOM型瘤苗，對消滅殘留微小病灶、防止復(fù)發(fā)意義重大。

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Study on effect of ISCOM leukemia vaccine on mouse macrophages﹡

WuSun,HuangYan,YangMan,ZiYoumei,MaDong,HeLishan

(DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453100,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of immunostimulatory complex(ISCOM) leukemia vaccine on macrophages of tumor-burdened mice.MethodsA total of 30 C57BL/6 mice were randomly divided into the model group,inactivated erythroleukemia cell FBL-3 vaccine group and inactivated FBL-3 cell plus ISCOM leukemia vaccine group.The FBL-3 cell leukemia tumor-burdened mice model was established by injection of FBL-3 cells.After treatment for 4 weeks,the mouse peritoneal macrophages were separated.Their phagocytosis effect,NO TNF-α and IL-1,killing activity and antigen-presenting function were investigated in various groups.ResultsThe number of mouse abdominal cavity macrophages,macrophage phagocytosis function,IL-1,TNF-α,NO,IL-2 and T cell proliferation ability in the ISCOM leukemia vaccine group were higher than those in the model group and the inactivated FBL-3 tumor vaccines group(P<0.05).The cell killing activity of macrophages in the ISCOM leukemia vaccine group was significantly higher than that in the model group(P<0.01).ConclusionThe ISCOM leukemia vaccine can increase the number of macrophages and enhance the phagocytosis and antigen-presenting ability of macrophages.

[Key words]leukemia vaccine;macrophages;ISCOMs

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.007

*基金項(xiàng)目：河南省教育廳基金資助項(xiàng)目(2006320039)。

作者簡介：吳隼(1968-)，副教授、副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事血液病惡性腫瘤的免疫治療研究。

[中圖分類號(hào)]R392.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)04-0451-03

(收稿日期：2015-06-18修回日期：2015-10-24)