李小好，楊　波，姜　丹，周志斌△

(1.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院急診科，武漢 430064 2.武漢工程大學校醫(yī)院，武漢 430074；3.湖北省中山醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430030;4.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430064)

?

聯(lián)合基因沉默TLR2、4對于LPA誘導的RASMCs表型轉(zhuǎn)化的影響*

李小好1,2，楊波3，姜丹4，周志斌4△

(1.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院急診科，武漢 430064 2.武漢工程大學校醫(yī)院，武漢 430074；3.湖北省中山醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430030;4.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430064)

[摘要]目的應用RNA干擾技術(shù)單一或者聯(lián)合沉默Toll樣受體(TLR)2、4基因，探討其在溶血磷脂酸(LPA)誘導的平滑肌細胞(VSMCs)表型轉(zhuǎn)化中的作用。方法根據(jù)文獻建立分化表型大鼠VSMCs(RASMCs)培養(yǎng)體系，予TLR2、4特異性小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染RASMCs，LPA 1 μmol/L處理4 h后，熒光定量RT-PCR法、Western blot法檢測分化和去分化細胞表型標志基因平滑肌肌動蛋白(SMA-α)和骨橋蛋白(OPN)基因及蛋白水平的表達。結(jié)果TLR2、4-siRNA分別轉(zhuǎn)染細胞后可顯著抑制LPA誘導的RASMCs細胞SMA-α基因、蛋白下調(diào)及OPN基因、蛋白上調(diào)，TLR2、4聯(lián)合干擾組對于LPA誘導的RASMCs細胞SMA-α基因、蛋白下調(diào)及OPN基因、蛋白上調(diào)的抑制作用較TLR2、4單獨干擾組進一步加強。結(jié)論TLR2、4信號通路參與了LPA誘導的表型轉(zhuǎn)化，聯(lián)合干預TLR2、4，有可能成為穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、抗粥樣硬化治療的一個新途徑之一。

[關(guān)鍵詞]Toll樣受體；RNA干擾；溶血磷脂素類；血管；肌細胞，平滑肌；表型轉(zhuǎn)化

Toll樣受體(toll-1ike receptors，TLRs)是一個模式識別受體家族，其可以識別多種病原相關(guān)分子模式，是天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中非常關(guān)鍵的受體，其可調(diào)節(jié)、控制天然免疫向后天免疫的轉(zhuǎn)變，被認為是聯(lián)系二者之間的橋梁[1-2]。大量研究證明，TLR 信號通路在動脈粥樣硬化進程中起著重要的作用，TLR與相應配體結(jié)合后，通過系列級聯(lián)反應激活核因子-κB((nuclear factor -kappaB，NF-κB)，啟動受NF-κB 調(diào)控的炎性因子轉(zhuǎn)錄[3]，參與動脈粥樣硬化炎癥反應。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型轉(zhuǎn)化可導致血管重構(gòu)，最終導致血管再狹窄和動脈粥樣硬化等血管疾病。TLRs的重要內(nèi)源性配體氧化脂蛋白的主要活性成份——溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是血清中導致VSMCs表型轉(zhuǎn)換的惟一成份[4]。本研究應用RNA干擾技術(shù)分別或聯(lián)合沉默TLR2、4基因后，予LPA刺激體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs(RASMCs)，觀察TLR2、4在LPA誘導的RASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用，進一步探討LPA致動脈粥樣硬化相關(guān)信號傳導途徑。

1材料與方法

1.1材料健康SD大鼠5只，體質(zhì)量150～200 g，雌雄不限，10～12周齡，購自北京維通利華驗動物技術(shù)有限公司。18∶1溶血磷脂酸(1-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate,18∶1 LPA)。LPA溶解于包含不含脂肪酸的0.1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中。胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)購自Lab Vision Corporation。層粘連蛋白購自BD discovery labware。Trizol Reagent,(Invitrogen) Taq RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) Deoxyribonuclease I (DNase I)(Fermentas)RiboLockTMRibonuclease Inhibitor,(Fermentas),SYBR Green PCR Master Mix(ABI),Lipofectamine?2000 (Invitrogen),Opti-MEM?Ⅰ低血清培養(yǎng)基(GIBCO )。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及干預試驗根據(jù)文獻[4]方法，取SD大鼠胸主動脈VSMCs，進行分化型血管VSMCs的原代培養(yǎng)，將TLR2、4特異性siRNA分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染RASMCs，LPA 1 μmol/L處理4 h，檢測平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA-α)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)基因、蛋白的表達。

1.2.2熒光定量RT-PCRTrizol法提取各組細胞總RNA。行實時定量PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參，反應體系為:cDNA 1.0 μL、2×SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL、上下游引物各100 nm、ddH2O補足至25.0 μL。擴增的反應條件:95 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃再延伸5 min，55 ℃退火10 s，共40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進行融點曲線分析，于60～95 ℃進行測定，(升溫幅度：每次0.5 ℃，每次5 s)。引物序列如下：TLR2上游5′-TGC TAT GAC GCT TTC GTG TC-3′，下游5′-TTC TCG GAA AGC ACG AAG AT-3′； TLR上游5′-ACA TCA AAT GCC CCT ACT CA-3′，下游5′-CTA AAC CAG CCA GAC CTT GA-3′；β-actin上游5′-CAT TAA GGA GAA GCT GTG CT-3′，下游5′-GTT GAA GGT AGT TTC GTG GA-3′；SMA-α上游5′- GCA TCC ACG AAA CCA CCT A-3′，下游:5′-CGC CGA TCC AGA CAG AAT A-3′；OPN 上游 5′-GCT GAA GCC TGA CCC ATC T-3′，下游 5′- GGT CTT CCC GTT GCT GTC-3′。反應結(jié)束后，根據(jù)Ct值通過公式2-ΔΔCt分析計算各目的基因相對表達量。

1.2.3Western blot檢測收集RASMC，各組細胞蛋白抽提，BCA法定量。取蛋白樣品10 μg 行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，然后分別與小鼠抗SMA-α、OPN(1∶300，Santa Cruz)室溫反應2 h，洗膜3次，隨后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗(1∶80 000，Santa Cruz)室溫反應2 h，于4-氯-1-萘酚，H2O2溶液中顯色，顯示蛋白條帶。Gelpro4 版凝膠光密度分析軟件分析陽性條帶，測其IOD值，然后用其表達量與對應的GAPDH表達量的比值進行比較分析。

1.2.4干涉片段的設計針對TLR2、4的序列，設計干涉序列和陰性對照序列，TLR2正義和反義鏈序列如下：TLR2-siRNA-1正義鏈5′-CAA AGA GUC UGA GGU CAA UUC AGA A-3′，反義鏈5′-UUC UGA AUU GAC CUC AGA CUC UUU G-3′；TLR2-siRNA-2正義鏈5′-UGG ACA CAA UUA AAU CCC UCG GUA A-3′，反義鏈5′-UUA CCG AGG GAU UUA AUU GUG UCC A-3′；TLR2-siRNA-3正義鏈5′-CCU GUU CCC UUU CAC AGC AUU UAA A-3′，反義鏈5′-UUU AAA UGC UGU GAA AGG GAA CAG G-3′。TLR4正義和反義鏈序列如下：TLR4-siRNA-1 正義鏈5′-UCU AGA GCA CUU GGA CCT TTT-3′，反義鏈5′-TTA GAU CUC GUG AAC CUG GUU-3′；TLR4-siRNA-2正義鏈5′-GUU GAU CUA CCA AGC CUU GTT-3′，反義鏈5′-TTC AAC UAG AUG GUU CGG AAC-3′；TLR4-siRNA-3正義5′-CGA AUG GAA UGU GCA ACA CTT-3′,反義鏈5′-TTG CUU ACC UUA CAC GUU GUG-3′。陰性對照：siRNA正義鏈5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義鏈5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.2.5RNA干擾轉(zhuǎn)染前1 d，將RASMC細胞以1×105密度接種于6孔板上過夜，培養(yǎng)基為2 mL含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。第2天細胞達到70%融合后，培養(yǎng)基更換為無血清、無抗生素培養(yǎng)液，準備轉(zhuǎn)染。 RASMC分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染組),陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA)及轉(zhuǎn)染陽性siRNA組。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000說明書，細胞轉(zhuǎn)染后24 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并進行熒光定量RT-PCR檢測，以確定最佳干預片段。

1.2.6VSMCs表型判斷選取SMA-α和OPN分別作為分化和去分化VSMC表型標志基因[4-5]。SMA-α在分化表型VSMC表達升高，在去分化表型VSMC則降低，OPN則與之相反。

2結(jié)果

2.1最佳siRNA序列的篩選熒光定量RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前、后細胞中TLR2、4 mRNA的表達，結(jié)果顯示RASMCs表達TLR2、4 mRNA。轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-1、TLR2-siRNA-3細胞組中TLR2 mRNA表達水平均顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-2細胞組中TLR2 mRNA表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組細胞中，轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-1的細胞組TLR2 mRNA的表達最低，空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) ，見圖1。轉(zhuǎn)染TLR4-siRNA-1、TLR4-siRNA-2和TLR4-siRNA-3的3組細胞中TLR4 mRNA表達水平均顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，且以轉(zhuǎn)染TLR4-siRNA-2的細胞組TLR4 mRNA的表達最低，空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。上述結(jié)果證實了TLR2、4 siRNA分子對TLR2、4基因抑制作用的特異性，并排除了轉(zhuǎn)染試劑的作用。因此，將TLR2-siRNA-1、TLR4-siRNA-2用于后續(xù)相關(guān)實驗研究。

1:空白對照組；2：陰性對照組；3：轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-1組；4：轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-2組；5：轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-3組。a：P<0.01，與轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-1組比較；b：P<0.01與轉(zhuǎn)染TCR2-siRNA-3組比較。

圖1轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA對TLR2 mRNA表達的影響(n=3)

1:空白對照組；2：陰性對照組；3：轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-1組；4：轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-2組；5：轉(zhuǎn)染TLR2-siRNA-3組。a：P<0.01，與空白及陰性對照組比較。

圖2轉(zhuǎn)染TLR4-siRNA對TLR4mRNA表達的影響(n=3)

2.2TLR2-siRNA-1、TLR4-siRNA-2轉(zhuǎn)染細胞后對LPA誘導的RASMCs細胞表型轉(zhuǎn)化的影響原代培養(yǎng)的分化表型VSMC予LPA-1 μmol/L處理4 h后，顯著下調(diào)SMA-α基因、蛋白的表達，并同時上調(diào)OPN基因、蛋白表達，TLR2-siRNA-1、TLR4-siRNA-2分別轉(zhuǎn)染細胞后均可抑制LPA誘導的RASMCs細胞SMA-α基因、蛋白下調(diào)及OPN基因、蛋白上調(diào)，TLR2、4聯(lián)合干擾組對于LPA誘導的RASMCs細胞SMA-α基因、蛋白下調(diào)及OPN基因、蛋白上調(diào)的抑制作用較TLR2、4單獨干擾組進一步加強，見圖3、4。

1:分化表型細胞組；2：LPA干預組；3：TLR2干擾組；4：TLR4干擾組；5：TLR2、4聯(lián)合干擾組；a：P<0.01，與分化表型細胞組比較；b：P<0.01與LPA干預組比較；c：P<0.01，與TLR2干擾組比較；d：P<0.05，與TLR4干擾組比較。

圖3TLR2、4干擾對LPA誘導的RASMCs表型

轉(zhuǎn)化標志基因mRNA的影響(n=3)

1:分化表型細胞組；2：LPA干預組；3：TLR2干擾組；4：TLR4干擾組；5：TLR2、4聯(lián)合干擾組；a：P<0.01，與分化表型細胞組比較；b：P<0.01，與LPA干預組；c：P<0.01，與TLR2干擾組比較；d：P<0.05，與TLR4干擾組比較；e：P<0.01，與TLR2、4干擾組比較。

圖4TLR2、4干擾對LPA誘導的RASMCs表型轉(zhuǎn)化

標志基因、蛋白水平的影響(n=3)

3討論

血管疾病中VSMC的改變可以認為是其分化狀態(tài)的改變，LPA則是低密度脂蛋白致血管內(nèi)皮病變的活性成分[6]，體內(nèi)LPA主要來源于對損傷和炎癥刺激應答所致激活的血小板、受損的細胞及生長因子刺激的細胞[7]。體外及活體實驗均充分證明不飽和LPA可以誘導VSMC表型轉(zhuǎn)化，刺激VSMC遷移和增殖[8]，本課題前期研究表明LPA以劑量依賴的方式促進RASMCs表型轉(zhuǎn)化[9]，但LPA誘導RASMCs表型轉(zhuǎn)化信號通路尚需進一步闡明。

多項研究證實，迄今發(fā)現(xiàn)的12種TLRs中，主要是TLR2和TLR4信號通路參與了動脈粥樣硬化病理、生理過程[10-11]。參與動脈粥樣硬化的巨噬細胞、樹突狀細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞均表達TLR2、4，某些T淋巴細胞表達TLR2[12]。在低密度脂蛋白受體缺失(LDLR-/-)和載脂蛋白E缺失(ApoE-/-)小鼠粥樣硬化模型中，TLR2、4在粥樣硬化斑塊的表達均增高。TLR4或TLR2缺失的ApoE-/-小鼠粥樣硬化損傷面積較正常小鼠粥樣硬化模型比，顯著下降[13-14]，Cao等[15]對TLR4和ApoE雙基因敲除小鼠高膽固醇喂養(yǎng)6個月后，發(fā)現(xiàn)小鼠主動脈竇處的巨噬細胞浸潤程度較ApoE基因敲除小鼠降低了65%，斑塊面積減少了55%；而TLR的下游基因MyD88與ApoE雙基因敲除小鼠的巨噬細胞浸潤程度較對照組降低了75%，斑塊面積減少了60%。

本研究應用RNA干擾技術(shù)分別沉默TLR2、4基因后，發(fā)現(xiàn)LPA誘導的RASMCs細胞SMA-α基因、蛋白下調(diào)及OPN基因、蛋白上調(diào)均可被顯著抑制，表明TLR2、4信號通路均參與了LPA誘導的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化，并且聯(lián)合干擾TLR2、4對于LPA誘導的RASMCs細胞SMA-α基因、蛋白下調(diào)及OPN基因、蛋白上調(diào)的抑制作用較TLR2、4單獨干擾組進一步加強。聯(lián)合干擾TLR2、4對于LPA誘導的RASMCs表型轉(zhuǎn)化具有更強的抑制作用，二者具有協(xié)同作用。

綜上所述，TLR信號通路主要是TLR2、4參與了LPA誘導的表型轉(zhuǎn)化，聯(lián)合干預TLR2、4，抑制信號通路后的炎癥反應及免疫反應，有可能成為穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、抗粥樣硬化治療的一個新途徑之一。

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Effects of joint gene silence of TLR2 and TLR4 on LPA induced phenotypic modulation of RASMCs﹡

LiXiaohao1,2,YangBo3,JiangDan4,ZhouZhibin4△

(1.DepartmentofEmergency,AffiliatedTianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430064China;2.HospitalofWuhanInstituteofTechnology,Wuhan,Hubei430074,China;3.DepartmentofCardiology,HubeiProvincialZhongshanHospital,Wuhan,Hubei430030,China;4.DepartmentofNeurology,AffiliatedTianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430064,China)

[Abstract]ObjectiveTo apply the RNA interference technology to singly or jointly to silence toll-like receptor(TLR)-2,4 genes and to investigate their effects on lysophosphatidic acid(LPA) induced phenotypic modulation of vascular smooth muscle cells(VSMCs).MethodsThe culture system of rat aortic smooth muscle cells (RASMCs) in differentiated phenotype rats was established according to the literature.Then TLR-2 and TLR 4 specially small interference RNA(TLR2-siRNA,TLR4-siRNA) were tranfected into RASMCs.After the treatment by 1 μmol/L of LPA for 4 h,the gene and protein levels of SMA-α and OPN as the marker genes for VSMC differentiated and dedifferentiated phenotype were detected by real-time quantitative RT-PCR and Western blot respectively.ResultsTLR2-siRNA and TLR4-siRNA transfection could significantly inhibit the down-regulation of SMA-α gene and protein,and the up-regulation of OPN gene and protein in LPA induced RASMCs,the inhibiting effect of the joint interference of TLR2 and TLR4 on the down-regulation of SMA-α gene and protein,and the up-regulation of OPN gene and protein in LPA induced RASMCs was further strengthened than the single interference of TLR2 and TLR 4.ConclusionThe TLR2 and TLR4 signal pathway participates in the LPA-stimulated phenotypic modulation of RASMCs.The joint intervention on TLR2 and TLR4 might become one of new pathway for stabilizing atherosclerotic plaque and anti-atherosclerotic therapy.

[Key words]toll-like receptors;RNA interference;lysophospholipids;blood vessels;myocytes,smooth muscle;phenotypic modulation

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.006

基金項目:湖北省衛(wèi)生廳科研指導性項目(JX6C-19);湖北省教育廳科學技術(shù)研究計劃優(yōu)秀中青年人才項目(Q20121117)。

作者簡介:李小好(1977-),副主任醫(yī)師，大學本科，主要從事急診醫(yī)學研究?！魍ㄓ嵶髡?Tel：13329732347;E-mail：zhouzhibin74@163.com。

[中圖分類號]R34

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)04-0448-03

(收稿日期：2015-08-05修回日期：2015-10-13)