粟宏偉，王　杰，朱永生，鄧青富，裴利軍，王　娟

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 646000)

?

鈣化性納米微粒致大鼠腎結(jié)石模型的構(gòu)建*

粟宏偉1，王杰1，朱永生2，鄧青富2，裴利軍2，王娟2

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 646000)

[摘要]目的建立鈣化性納米微粒(CNPs)致大鼠腎結(jié)石模型。方法利用臨床手術(shù)所得腎結(jié)石標(biāo)本分離和培養(yǎng)出CNPs。SD雄性大鼠40只分為CNPs誘石組(A組，鼠尾靜脈注射CNPs)、CNPs+腎石通組(B組，鼠尾靜脈注射CNPs+腎石通溶液灌胃+生理鹽水腹腔注射)、CNPs+硝酸鎵組(C組，鼠尾靜脈注射CNPs+硝酸鎵腹腔注射+生理鹽水灌胃)、空白對(duì)照組(D組，鼠尾靜脈注射生理鹽水+生理鹽水灌胃和腹腔注射)，每組10只。8周后處死大鼠，鏡下觀察腎臟組織的病理改變及晶體分布并計(jì)數(shù)。結(jié)果A、B、C組大鼠腎臟腎小管內(nèi)產(chǎn)生鈣鹽結(jié)晶，Von kossa染色陽性，主要分布在遠(yuǎn)曲小管和近曲小管，D組大鼠腎組織內(nèi)未見鈣鹽結(jié)晶，4組間成石率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鏡下觀察A、B、C組腎組織明顯可見腎小管上皮細(xì)胞變性，腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)灶(主要為淋巴細(xì)胞)，D組腎組織未見病理性改變。各組大鼠尿Ca2+、尿肌酐水平實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d(T2)高于注射CNPs后4周(T1)(P<0.01)；與D組T2尿Ca2+和血肌酐水平相比，A、B、C組均增高(P<0.05)，與A組T2尿Ca2+相比，B、C組有降低趨勢(shì)(P<0.05)；各組之間T2血Ca2+水平、T2尿肌酐水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論CNPs能損傷腎小管上皮細(xì)胞，促使腎小管內(nèi)鈣鹽晶體的形成。

[關(guān)鍵詞]腎結(jié)石；鈣質(zhì)沉著癥；晶體；鈣化性納米微粒；模型；腎石通；硝酸鎵

鈣化性納米微粒因?yàn)槠洫?dú)特的生物礦化特性，近年來已成為腎結(jié)石形成機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。本研究應(yīng)用無菌收集的結(jié)石標(biāo)本分離和培養(yǎng)出鈣化性納米微粒(calcifying nanoparticles,CNPs)，通過鼠尾靜脈注射初步建立大鼠腎結(jié)石模型，并觀察腎石通、硝酸鎵對(duì)CNPs成石的影響。

1材料與方法

1.1材料3月齡雄性SD大鼠40只(瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量150～200 g，分為4組，各組大鼠均先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。分為CNPs誘石組(A組)、CNPs+腎石通組(B組)、CNPs+硝酸鎵組(C組)、空白對(duì)照組(D組)，每組10只，普通顆粒飼料飼養(yǎng)，飲用自來水。A組：鼠尾靜脈注射CNPs 1次(吸光度2.00，0.4 mL)；B組在A組的基礎(chǔ)上每天2次腎石通溶液灌胃(每次100 mg/kg)，同時(shí)生理鹽水(NS)腹腔注射(3次/周)，直至處死；C組在A組的基礎(chǔ)上硝酸鎵腹腔注射(每次1 mg/kg，3次/周)，同時(shí)NS灌胃，直至處死；D組鼠尾靜脈注射NS(0.4 mL)，同時(shí)NS灌胃和腹腔注射作為空白對(duì)照，直至處死。

1.2方法

1.2.1CNPs的分離和培養(yǎng)術(shù)中無菌收集經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)患者的結(jié)石標(biāo)本，在1 mol/L HCl中浸泡30 min，以去除礦物質(zhì)，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)中和、洗滌，用無菌研缽碾碎結(jié)石，加入NS 10 mL混勻，經(jīng)0.22 μm的濾紙加壓過濾，4 ℃離心40 min(20 000×g)，取管底濾過液備用。取4 mL含10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活γ-FBS的1640培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后將處理后的結(jié)石濾過液取1 mL加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、5%CO2和95%O2條件下培養(yǎng)6～8周，30 d換液1次，整個(gè)操作中嚴(yán)格遵循無菌技術(shù)。以等量經(jīng)0.22 μm的濾紙過濾的NS、含10%(體積分?jǐn)?shù))熱滅活γ-FBS的1640培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對(duì)照。待有白色沉淀出現(xiàn)時(shí)篩選出無污染的標(biāo)本，用巴氏管吹打均勻后吸入離心管。離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心20 min，棄上清液，再加入注射無菌用水2 mL吹打混勻。重復(fù)上訴步驟共計(jì)清洗CNPs 3次。倒置相差顯微鏡下形態(tài)學(xué)鑒定和Von kossa染色鑒定。紫外分光光度儀測(cè)定CNPs最大吸收波長(zhǎng)，以此測(cè)定CNPs的相對(duì)生長(zhǎng)濃度。

1.2.2標(biāo)本采集分別于注射CNPS后4周(T1)及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d(T2)用代謝籠收集大鼠24 h尿液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前麻醉大鼠，抽取下腔靜脈血后處死切取腎臟縱向剖開，10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液固定。

1.2.3觀察指標(biāo)固定后的腎臟組織做石蠟切片，Von kossa染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察鈣鹽結(jié)晶在腎組織中的分布情況；蘇木素-伊紅(HE)染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織的病理改變，偏光顯微鏡下觀察鈣鹽結(jié)晶在腎組織中的分布情況并按文獻(xiàn)[1]結(jié)晶分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)作統(tǒng)計(jì)。全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清肌酐、Ca2+及尿肌酐、尿Ca2+水平。

2結(jié)果

2.1CNPs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果培養(yǎng)6周時(shí)，A、B、C組培養(yǎng)液開始出現(xiàn)渾濁，8周肉眼可見白色絮狀沉淀，倒置相差顯微鏡下觀察CNPs聚集成團(tuán)，部分貼壁生長(zhǎng)，漂浮生長(zhǎng)的CNP團(tuán)塊做不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)。Von kossa染色可見CNPs團(tuán)塊呈棕褐色或黑褐色，見圖1。

2.2T1與T2各組大鼠尿Ca2+、尿肌酐水平比較T2各組大鼠尿Ca2+、尿肌酐水平明顯高于T1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各組在T1和T2時(shí)間點(diǎn)上的尿Ca2+、尿肌酐水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)束前各組大鼠血肌酐、血Ca2+、尿Ca2+、尿肌酐水平比較與D組血肌酐水平相比，A、B、C組均增高(P<0.05),A、B、C 3組間血肌酐水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與D組尿Ca2+水平相比，A、B、C組均增高(P<0.05)，與A組尿Ca2+相比，B、C組明顯降低(P<0.05)，B組與C組間尿Ca2+水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組之間血Ca2+水平、尿肌酐水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4各組大鼠腎臟標(biāo)本鈣鹽結(jié)晶情況的比較Von kossa染色+核固紅復(fù)染后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，A、B、C組大鼠腎組織內(nèi)可見散在分布不規(guī)則的棕褐色或黑褐色鈣鹽結(jié)晶沉積，主要分布在遠(yuǎn)曲小管和近曲小管，晶體多呈零星散在分布，有的互相連接成片或成堆(圖2)。HE染色后在偏光顯微鏡下觀察，A、B、C組大鼠腎臟切片在暗視野下可見高亮結(jié)晶，晶體形態(tài)不規(guī)則，或散在分布，或集合成堆。A、B、C組的成石率與D組相比均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組的成石率與B、C兩組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而B組和C組的成石率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

圖1　CNPs Von kossa染色陽性結(jié)果(×400)

組別n尿Ca2+(mmol/L)T1T2尿肌酐(μmol/L)T1T2A100.22±0.150.38±0.12a1803.28±1710.334909.40±1784.63B100.14±0.480.28±0.06a1520.18±953.808325.62±6206.56C100.19±0.080.29±0.08a1175.26±904.233844.72±2277.55D100.19±0.170.21±0.05a2527.28±1248.315164.12±3913.13

a：P<0.01，與T1比較。

表2　T2各組大鼠血肌酐、血Ca2+、尿Ca2+、尿肌酐水平比較

a：P<0.05，與D組比較；b：P<0.05，與A組比較。

表3　各組大鼠腎臟鈣鹽結(jié)晶沉積情況的比較(n)

a：P<0.05，與D組比較；b：P<0.05，與A組比較。

2.5各組大鼠腎臟標(biāo)本病理變化的比較腎臟組織HE染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察:A組大鼠腎臟中可見大量腎小管上皮細(xì)胞變性，主要為空泡樣變性，腎小管上皮細(xì)胞高度水腫，并且腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；B、C組較A組相比，發(fā)生變性改變的腎小管上皮細(xì)胞減少，且主要為顆粒樣變性，偶可見間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；B組和C組腎臟的病理改變比較差異不明顯；D組腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，偶可見顆粒樣變性的腎小管上皮細(xì)胞，腎小球形狀規(guī)則，無病理學(xué)改變。各組腎臟組織均未見腎小管上皮明顯壞死、脫落，見圖3。

A:A組；B：B組；C：C組；D：D組。黑色箭頭所示為Von kossa染色陽性的鈣鹽結(jié)晶。

圖2各組腎臟組織Von kossa染色+核固紅復(fù)染結(jié)果(×200)

A：A組中黑色箭頭所指為腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，紅色箭頭所指為腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；B：B組中黑色箭頭所指為腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性；C：C組中黑色箭頭所指為腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性，紅色箭頭所指為腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；D：D組無病理學(xué)改變。

圖3各組腎臟組織HE染色后的病理改變(×200)

3討論

1998年芬蘭科學(xué)家Kajander首次描述了一種未知的細(xì)胞培養(yǎng)污染物，并命名為納米細(xì)菌(nanobacteria,NB)，但它與一般細(xì)菌的特征不一樣，至今尚未測(cè)出其完整的基因序列，故后來又被命名為CNPs[1]。雖然還不能確定CNPs到底是一種納米級(jí)的能自我復(fù)制的生命體還是一種礦化蛋白質(zhì)復(fù)合體，但CNPs因其獨(dú)特的生化礦化活性，近年來已成為病理性鈣化相關(guān)疾病的研究焦點(diǎn)，在動(dòng)脈粥樣硬化[2]、牙結(jié)石[3]、前列腺炎[4]等疾病中都發(fā)現(xiàn)有CNPs的參與。粟宏偉等[5]在絕大多數(shù)腎結(jié)石患者的血清中成功培養(yǎng)出CNPs，陽性率明顯高于正常組，這說明CNPs與腎結(jié)石形成可能存在密切的關(guān)系。

Garcia等[6]通過將培養(yǎng)出來的CNPs直接經(jīng)皮腎內(nèi)注射，初步建立了CNPs致大鼠腎結(jié)石動(dòng)物模型，但因經(jīng)皮腎穿刺小鼠腎臟技術(shù)較困難且成功率低，故該方法未能被業(yè)界接受。本實(shí)驗(yàn)將由結(jié)石標(biāo)本分離培養(yǎng)出的CNPs通過鼠尾靜脈注射進(jìn)大鼠體內(nèi)，8周后處死大鼠，腎臟組織HE染色后偏光顯微鏡下可見不規(guī)則高亮晶體，腎臟組織Von kossa染色后光鏡下可見棕褐色或黑褐色不規(guī)則晶體，主要分布在近曲小管和遠(yuǎn)曲小管，D組則無晶體，成功建立了CNPs致大鼠腎結(jié)石的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：T2各組大鼠血Ca2+水平無明顯差異，但T2A組大鼠尿Ca2+水平明顯高于D組，提示CNPs可能提高尿Ca2+水平，這可能是CNPs導(dǎo)致腎結(jié)石形成的原因之一。

目前CNPs致腎結(jié)石的具體機(jī)制還不清楚，有研究提示腎小管上皮細(xì)胞損傷機(jī)制可能在腎結(jié)石的形成過程中起重要作用。Yu等[7]已證實(shí)CNPs能對(duì)共同培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞造成損傷，損傷程度隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。CNPs損傷細(xì)胞后，細(xì)胞的晶體黏附性也明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示：A組腎臟組織鏡下可見大量腎小管上皮細(xì)胞變性；腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)灶；近曲小管和遠(yuǎn)曲小管內(nèi)可見鈣鹽晶體沉積。且T2A組大鼠血肌酐水平高于D組，這些證實(shí)了CNPs能損傷腎小管上皮細(xì)胞，促進(jìn)腎小管內(nèi)鈣鹽晶體的黏附、沉積，這可能是腎結(jié)石形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

腎石通具有清熱利濕、排石的功效，能減輕局部組織水腫，其治療泌尿系結(jié)石的療效確切可靠[8]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中，腎石通降低了大鼠尿鈣濃度及成石率，且腎小管上皮細(xì)胞變性和腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度相比于A組都有所減輕。提示腎石通的抗結(jié)石活性成分可能對(duì)CNPs致腎小管上皮細(xì)胞損傷過程有抵抗作用，并且有可能通過降低尿鈣水平而削弱CNPs的自我礦化作用，影響晶體對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的黏附作用。

Eby[9]發(fā)現(xiàn)三價(jià)鎵鹽具有強(qiáng)大的抗炎、抗癌和抗高鈣血鈣癥特點(diǎn)。他在臨床中觀察到1例發(fā)生腎絞痛的尿路結(jié)石患者，在應(yīng)用硝酸鎵后于第2、3日就有溶解的結(jié)石陸續(xù)排出。由此提出了硝酸鎵可能能治療腎結(jié)石，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。本研究結(jié)果中的C組腎臟組織中鈣鹽結(jié)晶沉積較A組明顯減少，血肌酐和尿Ca2+水平明顯降低，提示硝酸鎵可能通過抗CNPs機(jī)制，有保護(hù)腎功能、抑制鈣鹽結(jié)

晶沉積和腎結(jié)石形成的作用。

本研究成功建立了CNPs致大鼠腎結(jié)石動(dòng)物模型，與目前普遍使用的大鼠腎結(jié)石模型改良造模方法相比[10]，CNPs致腎結(jié)石動(dòng)物模型的特點(diǎn)是造模時(shí)間偏長(zhǎng)。腎小管晶體數(shù)量偏少；尿Ca2+、血肌酐水平都相對(duì)偏低，這雖然增加了造模的時(shí)間和成本，但這可能更接近人體腎結(jié)石形成的病理生理過程。因此，CNPs致大鼠腎結(jié)石動(dòng)物模型的建立，可為進(jìn)一步研究腎結(jié)石形成機(jī)制及腎結(jié)石的防治提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1]Kajander EO.Nanobacteria--propagating calcifying nanoparticles[J].Lett Appl Microbiol,2006,42(6):549-552.

[2]Hunter LW,Charlesworth JE,Yu S,et al.Calcifying nanoparticles promote mineralization in vascular smooth muscle cells:implications for atherosclerosis[J].World J Orol,2006,24(1):51-54.

[3]Zeng J,Yang F,Zhang W,et al.Association between dental pulp stones and calcifying nanoparticles[J].Int J Nanomedicine,2014,9:2689-2698.

[4]Kim TH,Kim HR,Myung SC.Detection of nanobacteria in patients with chronic prostatitis and vaginitis by reverse transcriptase polymerase chain reaction[J].Korean J Urol,2011,52(3):194-199.

[5]粟宏偉，朱永生，鄧青富，等.上尿路結(jié)石患者血清、尿液、結(jié)石中納米細(xì)菌的檢測(cè)[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013,42(31)：3754-3756.

[6]Garcia CE,Olavi KE,Ciftcioglu N,et al.Nanobacteria.An experimental neo-lithogenesis model[J].Arch Esp Urol,2000,53(4):291-303.

[7]Yu CF,Huang XB,Chen L,et al.Effect of nanobacteria on cell damage and crystal retention in renal tubular epithelial cells[J].Beijing Da Xue Xue Bao,2010,42(4):436-442.

[8]江文凜，楊志偉.腎石通丸治療泌尿系結(jié)石200例療效觀察[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐,2010(4):219-221.

[9]Eby GA.A hypothesis for anti-nanobacteria effects of gallium with observations from treating kidney disease[J].Medical Hypotheses,2008,71(4):584-590.

[10]李笑然，岳中瑾，裴薇，等.4種大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型的比較[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2013,18(4):329-331,338.

Establishment renal calculus rat model induced by calcifying nanoparticles*

SuHongwei1,WangJie1,ZhuYongsheng2,DengQingfu2,PeiLijun2,WangJuan2

(1.DepartmentofUrology,theAffiliatedT.C.MHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofUrology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish renal calculus rat model induced by calcifying nanoparticles.MethodsWe extracted and cultivated calcifying nanoparticles from clinically diagnosed patients with nephrolithiasis.Forty adult male SD rats were divided into 4 groups (n=10 each):group A(given an intravenous injection of calcifying nanoparticles),group B(given an intravenous injection of calcifying nanoparticles and taken Shenshitong granules),group C(given an intravenous injection of calcifying nanoparticles and intraperitoneal injection of gallium nitrate),group D(as normal control).Eight weeks later,all rats were sacrificed.The kidneys were examined for pathology.ResultsHistopathological studies revealed calcifying nanoparticles induced renal tubular epithelial cells fatty degeneration and renal tubular crystallization,and caused renal interstitial infiltration with inflammatory cells.The formation of renal crystals in group A was more obvious than those in group B and C(P<0.05)．In group D,no crystals were formed and no pathological changes occurred.The levels of urinary calcium and urinary creatinine(of All group) at one day before the observation period (T2) were higher than those at 4 weeks after injection(T1)(P<0.01).The levels of urinary calcium and serum creatinine in group A and B and C were significantly higher than those in group D at T2(P<0.05).The levels of urinary calcium in group B and C were lower than that in group A at T2(P<0.05).However,there were no apparent differences of the levels of serum calcium and urinary creatinine between groups at T2(P>0.05).ConclusionCalcifying nanoparticles could cause renal tubular epithelial cells injury,which leads to the formation of kidney stones.

[Key words]nephrolithiasis；calcinosis；lens,crystalline；calcifying nanoparticles；model；shenshitong；gallium nitrate

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.007

*基金項(xiàng)目：四川省科技廳資助項(xiàng)目(14JC0105)；四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(100288)。

作者簡(jiǎn)介：粟宏偉(1973-)，副教授，碩士，主要從事泌尿系結(jié)石研究。

[中圖分類號(hào)]R692.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)03-0310-03

(收稿日期：2015-08-18修回日期：2015-10-26)