趙　敏，李崇陽(yáng)，李新海，錢　冉，李　楊，楊　揚(yáng)，徐世蓮△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科，昆明 650021)

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大鼠伏核微量注射天麻素對(duì)神經(jīng)病理性痛鎮(zhèn)痛作用的研究*

趙敏1,2，李崇陽(yáng)3#，李新海1，錢冉1，李楊1，楊揚(yáng)1，徐世蓮1△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科，昆明 650021)

[摘要]目的構(gòu)建神經(jīng)病理性痛動(dòng)物模型，研究伏核注射天麻素對(duì)神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用。方法實(shí)驗(yàn)采用左側(cè)坐骨神經(jīng)干部分結(jié)扎致神經(jīng)損傷制作神經(jīng)痛動(dòng)物模型，觀察伏核注射天麻素對(duì)傷害性熱刺激和壓力刺激誘發(fā)的大鼠后爪縮爪潛伏期的影響。結(jié)果左側(cè)坐骨神經(jīng)干部分結(jié)扎,引起雙側(cè)后爪縮爪潛伏期縮短，尤以10 d后左側(cè)明顯(熱板測(cè)試：t左=7.35，P<0.01；t右=3.24，P<0.05。Randall Selitto測(cè)試：t左=5.05，P<0.01；t右=3.32，P<0.05)。神經(jīng)病理性痛大鼠伏核注射40 μg/μL和20 μg/μL天麻素引起雙側(cè)后爪縮爪潛伏期延長(zhǎng),但注射10 μg/μL的天麻素沒(méi)有顯著性影響。結(jié)論天麻素在大鼠伏核對(duì)神經(jīng)病理性痛具有鎮(zhèn)痛作用。

[關(guān)鍵詞]天麻甙；疼痛；神經(jīng)節(jié)；伏核；后爪縮爪潛伏期；神經(jīng)病理性痛；鎮(zhèn)痛作用

神經(jīng)病理性痛(neuropathic pain)是慢性疼痛中較為常見(jiàn)的一種,以自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏和痛超敏為特征[1]。國(guó)際疼痛研究會(huì)(IASP,2011年)將由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛定義為神經(jīng)病理性痛。目前發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛與多種周圍神經(jīng)障礙疾病相關(guān),如糖尿病、甲狀腺功能低下、尿毒癥、營(yíng)養(yǎng)缺乏相關(guān)的神經(jīng)障礙，加之帶狀皰疹后神經(jīng)痛、缺血性神經(jīng)病變和頑固性神經(jīng)病理性癌痛等，致使神經(jīng)病理性痛患者人數(shù)逐年增加。但由于神經(jīng)病理性痛的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜,故尚缺乏有效的治療措施[2-4]。臨床常用阿片類藥物緩解各種急慢性疼痛，故在臨床嗎啡仍然是治療神經(jīng)病理性痛的首選藥。但阿片類藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用可發(fā)生耐受、心理/生理依賴、戒斷綜合征和自身覓藥行為等嚴(yán)重毒副作用，而神經(jīng)病理性痛需要長(zhǎng)期治療，因此毒副作用小的新型鎮(zhèn)痛藥物及其機(jī)制的研究逐漸得以凸顯。

天麻，甘平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、平肝潛陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò)之功。天麻素(gastrodin)是天麻的主要活性成分[5]，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇、鎮(zhèn)痛、改善腦供血不足、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)心肌細(xì)胞能量代謝的功能。但天麻素對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的中樞鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究目前國(guó)內(nèi)外尚較少報(bào)道。在腦內(nèi)，存在著內(nèi)源性的鎮(zhèn)痛系統(tǒng)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道伏核在痛覺(jué)信息的產(chǎn)生和調(diào)制中是一個(gè)重要的中樞部位[6-9]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究大鼠伏核微量注射天麻素對(duì)神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)采用雄性Sprague-Dawky大鼠(180～250 g，昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，批號(hào)KMMU2014004)，實(shí)驗(yàn)期間分籠飼養(yǎng)，自然光照,自由取食和飲水。本實(shí)驗(yàn)采取各種措施最大程度減小對(duì)動(dòng)物的傷害和使用數(shù)量，所有操作均依照國(guó)際疼痛協(xié)會(huì)的指導(dǎo)來(lái)完成，且均符合昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。(2)實(shí)驗(yàn)藥品：天麻素(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，使用0.9%的生理鹽水配制。

1.2方法

1.2.1測(cè)量后爪縮爪潛伏期實(shí)驗(yàn)前大鼠需進(jìn)行5 d后爪縮爪潛伏期(hindpaw withdrawal latency，HWL)測(cè)試的訓(xùn)練，以使動(dòng)物對(duì)傷害性刺激的HWL較為平穩(wěn)，保持在3～6 s。實(shí)驗(yàn)使用熱板，溫度維持在(52.0±0.2)℃，測(cè)試大鼠后爪對(duì)熱刺激的縮爪潛伏期。將大鼠左或右側(cè)后爪足底平放于熱板，大鼠縮爪時(shí)間即為大鼠后爪對(duì)傷害性熱刺激的縮爪潛伏期。使用Randall Selitto(UGO Basile TYPE 37215)測(cè)試大鼠后爪對(duì)機(jī)械壓力刺激的縮爪潛伏期。Randall Sellitto的楔形壓力閥壓在鼠爪的爪背靠近腳趾處，踩住開(kāi)關(guān)，步進(jìn)馬達(dá)推動(dòng)砝碼向前移動(dòng)，此時(shí)施加在大鼠后爪上的壓力以30 g/s的速度增加，大鼠后爪回縮時(shí)砝碼所指的刻度即為大鼠后爪對(duì)傷害性機(jī)械壓力刺激的縮爪潛伏期。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先測(cè)量給藥前大鼠的后爪縮爪潛伏期作為前對(duì)照(Basal HWL)，再測(cè)量給藥后5、10、15、20、30、45和60 min的HWL。將給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的縮爪潛伏期換算成變化百分率(%)，運(yùn)算公式為：(給藥后的值-給藥前的值)/給藥前的值×100%。

1.2.2構(gòu)建神經(jīng)病理性痛動(dòng)物模型腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠，在其左側(cè)大腿中部暴露8～10 mm長(zhǎng)的一段坐骨神經(jīng)。用4號(hào)羊腸線每隔1.0～1.5 mm輕度結(jié)扎神經(jīng)，共結(jié)扎4圈。結(jié)扎時(shí)看見(jiàn)后肢抽動(dòng)、神經(jīng)輕度凹陷即可。最后用4號(hào)絲線縫合皮膚。坐骨神經(jīng)結(jié)扎7～10 d后測(cè)定大鼠雙側(cè)HWL，產(chǎn)生痛敏后進(jìn)行伏核內(nèi)注射，觀測(cè)60 min。

1.2.3伏核內(nèi)微量注射方法腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠固定于“腦立體定位儀”進(jìn)行伏核內(nèi)埋管(B,+1.7 mm;L or R,1.6 mm;V,7.0 mm)。將外徑為0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入并用牙科水泥固定，作為腦內(nèi)微量注射時(shí)所用的套管。術(shù)后動(dòng)物恢復(fù)2～3 d。注射時(shí)用外徑為0.4 mm的不銹鋼管作注射管，其尖端伸出套管1.0～1.5 mm,實(shí)驗(yàn)時(shí)以1 μL/min的速度均勻推進(jìn)1 μL的藥物，藥物推注完畢后保留注射管在伏核內(nèi)停留1 min以上。

1.2.4注射位點(diǎn)的組織學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用腹腔注射過(guò)量戊巴比妥鈉(80 mg/kg)處死大鼠，斷頭取腦并置于-80 ℃的冰箱凍存。之后切片，鑒定給藥點(diǎn)是否位于伏核內(nèi)。經(jīng)組織切片鑒定給藥點(diǎn)不在伏核內(nèi)的動(dòng)物則舍去，見(jiàn)圖1。

圖1　注射位點(diǎn)組織學(xué)鑒定圖

2結(jié)果

2.1左側(cè)坐骨神經(jīng)干結(jié)扎對(duì)大鼠后爪縮爪潛伏期的影響坐骨神經(jīng)結(jié)扎前左爪和右爪的HWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12；熱板測(cè)試:t=0.21,P=0.84。Randall Selitto測(cè)試:t=0.12,P=0.91)。結(jié)扎左側(cè)坐骨神經(jīng)干10 d后，測(cè)定結(jié)扎后雙側(cè)HWL。如圖2所示，和結(jié)扎前比較，左側(cè)坐骨神經(jīng)干結(jié)扎后大鼠雙側(cè)HWL均縮短，并且結(jié)扎側(cè)比對(duì)側(cè)明顯(n=12；熱板測(cè)試：t左=7.35，P<0.01；t右=3.24，P<0.05。Randall Selitto測(cè)試：t左=5.05，P<0.01；t右=3.32，P<0.05)。

*：P<0.05，與結(jié)扎前比較。

圖2坐骨神經(jīng)結(jié)扎對(duì)后爪縮爪潛伏期的影響

2.2左側(cè)坐骨神經(jīng)干結(jié)扎大鼠伏核注射天麻素對(duì)后爪縮爪潛伏期的影響和伏核內(nèi)注射鹽水組(n=8)比較，伏核內(nèi)注射40 μg/μL(n=8;熱板測(cè)試：F左=67.98,P<0.01；F右=37.90，P<0.01。Randall Selitto 測(cè)試：F左=93.03，P<0.01；F右=52.48，P<0.01)；20 μg/μL(n=8;熱板測(cè)試：F左=45.21，P<0.01；F右=17.88，P<0.05。Randall Selitto 測(cè)試：F左=41.38，P<0.01；F右=39.42，P<0.01)的天麻素后雙側(cè)后爪對(duì)熱刺激和壓力刺激誘發(fā)的縮爪潛伏期均明顯延長(zhǎng),以給藥后10～15 min最明顯，持續(xù)約60 min。但注射10 μg/μL的天麻素后沒(méi)有顯著影響(n=8;熱板測(cè)試:F左=3.82，P=0.07；F右=2.01，P=0.18。Randall Selitto 測(cè)試:F左=0.38，P=0.55；F右=8.54，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

*：P<0.05,與鹽水組比較。

圖3坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠伏核注射天麻素對(duì)后爪縮爪潛伏期的影響

3討論

大鼠單側(cè)坐骨神經(jīng)干的輕度結(jié)扎，是目前公認(rèn)的一種造成外周神經(jīng)損傷、并導(dǎo)致慢性痛的常用方法。坐骨神經(jīng)干結(jié)扎后，神經(jīng)水腫引起血液供應(yīng)障礙和外周軸突損傷，包括有髓神經(jīng)纖維和無(wú)髓神經(jīng)纖維，尤其是有髓神經(jīng)纖維。結(jié)扎7～10 d后出現(xiàn)疼痛綜合征，其特點(diǎn)是對(duì)熱刺激和壓力刺激的痛敏和感覺(jué)異常,對(duì)熱刺激和壓力刺激的痛敏高峰在14～28 d。本實(shí)驗(yàn)研究采用結(jié)扎左側(cè)坐骨神經(jīng)干來(lái)構(gòu)建神經(jīng)痛動(dòng)物模型，結(jié)果顯示大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)干結(jié)扎10 d后雙側(cè)后爪對(duì)傷害性熱刺激和壓力刺激的縮爪潛伏期縮短，提示坐骨神經(jīng)結(jié)扎后產(chǎn)生自發(fā)性痛和痛敏。

在國(guó)內(nèi)，天麻素注射液目前已被廣泛運(yùn)用于臨床。我國(guó)中醫(yī)臨床上長(zhǎng)期使用天麻來(lái)治療頭昏目暈、癲癇抽搐和偏頭痛等疾病，且療效顯著[10]。郭學(xué)廷等[11]研究顯示，天麻素能顯著改善偏頭痛癥狀，縮短療程，并且沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)。但與臨床應(yīng)用相比，目前關(guān)于天麻素的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究不多。張怡評(píng)等[12]研究表明小鼠灌胃給藥，不同劑量天麻素和天麻苷元能顯著提高熱傷害刺激致痛小鼠的痛閾，明顯抑制醋酸引起的小鼠扭體反應(yīng)，提示天麻素和天麻苷元有鎮(zhèn)痛作用。鄭衛(wèi)紅等[13]研究顯示天麻素可以減輕長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的大鼠化療疼痛反應(yīng)，使其痛閾值明顯增高，且鎮(zhèn)痛效果與天麻素的劑量有關(guān)，大劑量時(shí)效果更明顯。最近有研究報(bào)道腹腔注射不同劑量天麻素對(duì)神經(jīng)痛具有鎮(zhèn)痛作用[14]。在培養(yǎng)的大鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上，中濃度的天麻素(5、10 mmol/L)可能通過(guò)ERK1/2途徑降低痛覺(jué)信息的傳入和整合[15]。

有關(guān)天麻素對(duì)神經(jīng)痛的中樞鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究迄今為止尚較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠伏核注射天麻素引起雙側(cè)后爪縮爪潛伏期延長(zhǎng)，提示天麻素在大鼠伏核對(duì)神經(jīng)痛具有重要的鎮(zhèn)痛作用，但有關(guān)天麻素對(duì)神經(jīng)痛的中樞鎮(zhèn)痛機(jī)制目前仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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Involvement of gastrodin in antinociception in nucleus accumbens of rats with sciatic neuropathy*

ZhaoMin1,2,LiChongyang3#,LiXinhai1,QianRan1,LiYang1,YangYang1,XuShilian1△

(1.DepartmentofPhysiology,SchoolofBasicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China;2.DepartmentofAnatomyandHistoembryology,SchoolofBasicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China;3.DepartmentofTumor,theFourthAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the antinociceptive role of gastrodin in nucleus accumbens (NAc)of rats with neuropathic pain.MethodsThe left sciatic nerve of rat was ligated to mimic neuropathic pain model,after which the present study observed the effect of intra-NAc injection of gastrodin on the hindpaw withdrawal latency (HWL)to noxious thermal and mechanical stimulation.ResultsThe HWL in response to thermal and mechanical stimulation significantly decreased in bilateral hindpaws in the 10th day after left sciatic nerve ligation(thermal stimulation:tleft=7.35,P<0.01;tright=3.24,P<0.05;mechanical stimulation:tleft=5.50,P<0.01;tright=3.32,P<0.05).Intra-NAc injection of 40 or 20 μg/μL,but not 10 μg/μL of gastrodin markedly induced an increase in the HWL in rats with neuropathic pain.ConclusionGastrodin contributes an important antinociceptive role to neuropathic pain in NAc of rats with mononeuropathy.

[Key words]gastrodin；pain；ganglia;nucleus accumbens;hindpaw withdrawal latencies;neuropathic pain;antinociceptive role

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.003

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360245)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目基金(2011FZ111);云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合資金項(xiàng)目(2015FB012)。

作者簡(jiǎn)介：趙敏(1982-)，講師，碩士，主要從事解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)科研與教學(xué)工作?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:shilianxu@126.com。

[中圖分類號(hào)]R338.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)03-0296-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-10-16)

#共同第一作者。