劉　玲(LIU Ling)，朱湘成(ZHU Xiang-cheng), 2，黃　勇(HUANG Yong), 3

(1中南大學(xué)湘雅國(guó)際轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)聯(lián)合研究院，湖南 長(zhǎng)沙　410013； 2 組合生物合成與天然產(chǎn)物藥物湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙　410205； 3 新藥組合生物合成國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

(1 Xiangya International Academy of Translational Medicine， Central South University， Changsha 410013,China; 2 Hunan Engineering Research Center of Combinatorial Biosynthesis and Natural Product Drug Discovery， Changsha 410205, China; 3 National Engineering Research Center of Combinatorial Biosynthesis for Drug Discovery， Changsha 410205, China)

·綜述·

微生物核糖體工程在抗生素研發(fā)中的應(yīng)用Application of microbial ribosome engineering in the research and development of antibiotics

劉玲(LIU Ling)1，朱湘成(ZHU Xiang-cheng)1, 2，黃勇(HUANG Yong)1, 3

(1中南大學(xué)湘雅國(guó)際轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)聯(lián)合研究院，湖南 長(zhǎng)沙410013； 2 組合生物合成與天然產(chǎn)物藥物湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410205； 3 新藥組合生物合成國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

(1 Xiangya International Academy of Translational Medicine， Central South University， Changsha 410013,China; 2 Hunan Engineering Research Center of Combinatorial Biosynthesis and Natural Product Drug Discovery， Changsha 410205, China; 3 National Engineering Research Center of Combinatorial Biosynthesis for Drug Discovery， Changsha 410205, China)

[關(guān)鍵詞]多重耐藥菌； 次級(jí)代謝產(chǎn)物； 微生物； 抗生素； 核糖體工程

為有助于解決全球多重耐藥菌感染問(wèn)題，有必要加速抗生素的研發(fā)。針對(duì)微生物擁有的巨大生物合成潛力的核糖體工程(ribosome engineering)，利用鏈霉素、慶大霉素和利福霉素等與微生物核糖體或RNA聚合酶的相互作用，有助于快速、簡(jiǎn)便地篩選出對(duì)應(yīng)的突變菌株，進(jìn)而改進(jìn)其環(huán)境耐受性，提高其次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物。本文主要綜述核糖體工程在抗生素產(chǎn)量提升，以及新抗生素發(fā)現(xiàn)等方面的研究進(jìn)展。

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，抗生素不僅在臨床上用于治療細(xì)菌和真菌感染，而且在農(nóng)林牧漁等行業(yè)也得到了廣泛應(yīng)用。2013年我國(guó)消耗各類抗菌藥物約16萬(wàn)噸，占世界用量的一半，然而其中有5萬(wàn)余噸通過(guò)多種方式最終進(jìn)入了我們的水土環(huán)境，極大地增加了多重耐藥菌產(chǎn)生的概率[1-3]?，F(xiàn)今，抗菌藥物濫用和多重耐藥菌感染問(wèn)題已成為全球主要的公共衛(wèi)生危機(jī)之一，我國(guó)尤其嚴(yán)重。規(guī)范抗生素使用的同時(shí)，通過(guò)核糖體工程加速抗生素的研發(fā)將有助于解決上述問(wèn)題。見(jiàn)圖1。

1996年，日本食品研究所Ochi研究小組Shima等[4]觀察到1株耐鏈霉素變鉛青鏈霉菌(StreptomyceslividansTK24)能產(chǎn)生大量的Act。與不耐鏈霉素且不產(chǎn)生Act的S.lividansTK21菌株相比，TK24的核糖體蛋白S12發(fā)生賴氨酸-88到谷氨酸(K88E)的突變。Ochi進(jìn)一步以鏈霉素為抗性指征，直接從TK21篩選獲得200個(gè)以上耐鏈霉素的突變菌株，其中約40%能產(chǎn)生Act。Ochi和其他研究者進(jìn)而分別采用利福霉素(rifamycin，Rif)和慶大霉素(gentamycin，Gen)等抗生素進(jìn)行類似的抗性篩選，提高了目標(biāo)菌株產(chǎn)生包括抗生素在內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，或產(chǎn)生了新的天然產(chǎn)物。

這些研究中使用的抗生素一般作用于微生物的核糖體或RNA聚合酶上。Ochi研究小組因此提出了核糖體工程的概念：與微生物在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)相似，利用抗生素篩選出相應(yīng)的耐藥菌株，其核糖體或RNA聚合酶上發(fā)生的改變將導(dǎo)致其基因表達(dá)發(fā)生變化，表現(xiàn)在改善菌株的環(huán)境耐受性，提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量或刺激新天然產(chǎn)物的產(chǎn)生[5]。見(jiàn)圖2。近年來(lái)有學(xué)者[6-8]對(duì)核糖體工程的原理及其應(yīng)用進(jìn)行了綜述，認(rèn)為該技術(shù)不需要了解目標(biāo)菌種的清晰遺傳背景，簡(jiǎn)便易行，能與其他菌種改良方法聯(lián)合使用。

核糖體工程用于提高抗生素產(chǎn)量：1為放線紫紅素(actinorhodin，Act)，2為紅霉素，3為達(dá)托霉素；核糖體工程用于發(fā)現(xiàn)新的抗生素：4為piperidamycin A，5為mutaxanthene A

A：微生物在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)；B：Ochi提出的核糖體工程原理；★：RNA聚合酶或核糖體的變化

1各種抗生素在核糖體工程中可能的作用機(jī)理

1.1鏈霉素篩選機(jī)理

鏈霉素引起核糖體改變的機(jī)制分為兩種：高濃度鏈霉素主要誘導(dǎo)負(fù)責(zé)編碼核糖體30S亞基中S12蛋白的rpsL基因突變，而低濃度鏈霉素則導(dǎo)致編碼16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的rsmG基因發(fā)生突變[9]。另外，rpsL基因突變可能促進(jìn)frr基因表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物核糖體循環(huán)因子(ribosome recycling factor)在蛋白合成的最后一步能通過(guò)促進(jìn)信使RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA與核糖體解離，提高基因表達(dá)[10]。

1.2利福霉素及其他抗生素的篩選機(jī)理

產(chǎn)生利福霉素抗性的突變菌株，其RNA聚合酶的β亞基(rpoB基因編碼蛋白)發(fā)生的變化可能導(dǎo)致RNA聚合酶的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成或其相關(guān)基因的變化。如在紅霉素產(chǎn)生菌糖多孢紅霉菌中加入超過(guò)其最低抑菌濃度劑量的利福霉素，篩選獲得的突變菌株不僅能耐受高濃度的利福霉素，而且紅霉素的產(chǎn)量也提高了近4倍，其原因在于紅霉素生物合成的底物之一——丙酰輔酶的生物合成基因被過(guò)量表達(dá)[11]。慶大霉素可能導(dǎo)致負(fù)責(zé)編碼核糖體30S亞基中L6蛋白的rplF基因發(fā)生突變[12]， 而其他氨基糖苷類抗生素，包括巴龍霉素(paromomycin，Par)和新霉素篩選引起的突變通常位于16S rRNA基因的A位點(diǎn)[13]。核糖體工程最初應(yīng)用于鏈霉菌，隨后推廣到枯草桿菌[14]、假單胞菌[15]、變棲克雷伯氏菌[16]、大腸埃希菌[17]以及海洋來(lái)源的真菌[18]。

2應(yīng)用核糖體工程提高抗生素產(chǎn)量

抗生素在野生菌株中的產(chǎn)量一般較低，只有經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的菌種優(yōu)化，抗生素生產(chǎn)水平才能得到提高，進(jìn)而進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。以青霉素為例，通過(guò)幾代人的努力，從上世紀(jì)四十年代的40 U/mL提升至目前的10 WU/mL，產(chǎn)量提高近2 500倍[19]。與傳統(tǒng)的遺傳育種方法相比，核糖體工程在較短的時(shí)間內(nèi)不僅可以增加野生菌株中次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，而且可以進(jìn)一步提升已有工業(yè)菌種的產(chǎn)量。見(jiàn)表1。

表1　利用核糖體工程提升抗生素產(chǎn)量相關(guān)文獻(xiàn)

Hu等[20]研究表明，在抗生素產(chǎn)量的提升方面，運(yùn)用單一抗生素進(jìn)行篩選后發(fā)生的單突變不如雙突變和多突變，組合突變篩選的效果優(yōu)于單突變，如在天藍(lán)色鏈霉菌中，Str/Gen和Str/Rif雙抗性突變株合成放線紫紅素的能力比Str、Gen或Rif單抗性突變株高1.7～2.5倍，而Str/Gen/Rif三抗性突變株產(chǎn)生的放線紫紅素產(chǎn)量是野生型天藍(lán)色鏈霉菌的48倍。2011年Gomez-Escribano等[28]將雙抗性突變與異源表達(dá)結(jié)合使用，在天藍(lán)色鏈霉菌rpsL(K88E)rpoB(S433L)的工程菌株中，分別將氯霉素、紡錘菌素的產(chǎn)量提升了20～40倍。Ahmetagic等[29]用林可霉素(lincomycin，Lin)和卡那霉素(kanamycin，Kan)雙抗性篩選聯(lián)合異源表達(dá)，將紫色桿菌素的產(chǎn)量提升了41倍。

在工業(yè)菌株的應(yīng)用中，Tamehiro等[21]運(yùn)用Str/Gen/Rif 3種抗生素進(jìn)行組合篩選，最終獲得突變菌株的沙利霉素產(chǎn)量較原始工業(yè)菌株的產(chǎn)量(10g/L)提升了2.3倍。華北制藥通過(guò)紫外、高能電子誘變聯(lián)合Str、Rif篩選，把去甲萬(wàn)古霉素的產(chǎn)量提高了145%[22]。Beltramett等[23]獲得了Str，Gen或Rif的3種抗生素抗性單突變菌株，噻唑肽 GE2270產(chǎn)量是初始工業(yè)菌株的1.8倍。2010年Li等[27]通過(guò)表達(dá)阿維鏈霉菌中的核糖體循環(huán)因子，將阿維菌素的產(chǎn)量提高了3～3.7倍。2014年Ma等[35]基于相同的理論基礎(chǔ)，過(guò)度表達(dá)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628中的frr基因，使豐加霉素增產(chǎn)1.46倍。

2013年Lv等[33]將60Co γ射線物理誘變、基因組改組技術(shù)(genome shuffling)與鏈霉素抗性篩選結(jié)合，獲得卑霉素的高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量較初始菌株提高了36.8倍。2014年Wang等[34]用同樣的方法獲得了活躍鏈霉菌AW7的突變株，諾西肽的產(chǎn)量提高了9.2倍，達(dá)到1.54 g/L的工業(yè)發(fā)酵水平。Li等[32]聯(lián)合基于報(bào)告基因的代謝工程與核糖體工程，獲得產(chǎn)量提升130%的達(dá)托霉素突變菌株。

本課題組目前聯(lián)合紫外誘變和慶大霉素篩選，提高新型抗腫瘤抗生素 6-脫羥-博萊霉素的產(chǎn)量，突變菌株的產(chǎn)量提高了近2倍(待發(fā)表)。此外，為提高新穎抗生素平板霉素在普拉特鏈霉菌中的產(chǎn)量，我們分別應(yīng)用Rif或Str篩選獲得了300多株抗性菌株，部分菌株的平板霉素產(chǎn)量提高了1.3倍左右(待發(fā)表)。

3應(yīng)用核糖體工程發(fā)現(xiàn)新抗生素

微生物全基因組測(cè)序研究揭示了微生物產(chǎn)生各類次級(jí)代謝產(chǎn)物的巨大潛力，如一個(gè)典型的鏈霉菌基因組中約含有20～40個(gè)生物合成基因簇，但是在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的條件下，這些生物合成基因簇一般不會(huì)全部表達(dá)。運(yùn)用核糖體工程快速激活微生物基因組中“沉默”的基因簇，將有助于發(fā)現(xiàn)全新的抗生素，以及其他活性天然產(chǎn)物，見(jiàn)表2。

表2　利用核糖體工程發(fā)現(xiàn)新抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)文獻(xiàn)

2009年Hosaka等[36]運(yùn)用Rif、Str和Gen 3種抗生素針對(duì)土壤中的放線菌進(jìn)行篩選，成功獲得在rpoB基因和rpsL基因發(fā)生突變的菌株，并發(fā)現(xiàn)了一種新抗生素piperidamycin。2013年Ochi等[37]在多種放線菌中篩選到多株rpoB基因突變的菌株，對(duì)這些菌株的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，大量沉默的生物合成基因簇的表達(dá)增加(最高增高達(dá)70倍)；對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和糖多孢紅霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其均產(chǎn)生了新的次級(jí)代謝物，包括多種放線紫紅素衍生物。Derewacz等[38]在稀有放線菌擬諾卡氏菌中，利用Str和Rif篩選獲得突變菌株，以此為基礎(chǔ)獲得了一組嶄新的芳香聚酮化合物 mutaxanthenes。2015年Bachmann等[41]又通過(guò)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抗性篩選獲得的天藍(lán)色鏈霉菌突變菌株，可以產(chǎn)生大量放線紫紅素等16個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物。Zhang等[40]運(yùn)用核糖體工程激活海洋菌株S.somaliensisSCSIO ZH66中沉默基因，從該菌種的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤先導(dǎo)化合物fredericamycin A (原始菌株不產(chǎn)生該產(chǎn)物)，并聯(lián)合響應(yīng)曲線法優(yōu)化該菌種的發(fā)酵條件，將產(chǎn)量?jī)?yōu)化至( 679.5±15.8) mg/L。此外，核糖體工程也能激活真菌中的部分沉默生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)。2014年Dong等[39]在海洋真菌雜色曲霉菌ZBY-3 獲得耐新霉素的突變菌株，與原始菌株相比，發(fā)現(xiàn)了6種新型的抗腫瘤活性物質(zhì)。2015年Wu等[18]用新霉素在海洋真菌產(chǎn)紫青霉G59中進(jìn)行抗性篩選，發(fā)現(xiàn)了彎孢霉菌素和penicitrinone A等5種新型抗生素或抗腫瘤化合物。

4展望

原創(chuàng)藥物研發(fā)費(fèi)用高達(dá)26億美元，耗時(shí)10年以上[42]。而相對(duì)一般藥物，抗生素開(kāi)發(fā)周期更長(zhǎng)，上市成本更高，導(dǎo)致很多大型制藥公司退出了抗生素的研發(fā)[43]。迄今為止，全球已發(fā)現(xiàn)了上萬(wàn)種抗生素，而臨床使用的2/3以上的抗生素均來(lái)源于土壤放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[43]。1970年后，大量已知抗生素的重復(fù)發(fā)現(xiàn)使得直接從自然界中發(fā)現(xiàn)新抗生素的難度逐漸加大。即使發(fā)現(xiàn)新抗生素，其在野生菌株中的產(chǎn)量也很低，需要長(zhǎng)期的遺傳育種才能大幅度增加產(chǎn)量，1999年后至今，全球僅有3種新型抗生素，利奈唑胺、達(dá)托霉素和非達(dá)霉素投入臨床使用[44]。面對(duì)新抗生素匱乏和多重耐藥菌泛濫的矛盾，人們?cè)噲D解決抗生素研發(fā)中的兩大問(wèn)題，即如何快速提高已有抗生素的產(chǎn)量和發(fā)現(xiàn)新的抗生素，核糖體工程的應(yīng)用則成為解決上述問(wèn)題的一條有效的途徑。盡管核糖體工程已經(jīng)用于沙利霉素、去甲萬(wàn)古霉素、阿維菌素和GE2270等，但在工業(yè)遺傳育種上的應(yīng)用范圍仍不廣泛，而且產(chǎn)量提高有限。由于微生物代謝的復(fù)雜性，核糖體工程詳細(xì)作用機(jī)制尚未十分清晰，如核糖體、RNA聚合酶突變后，具體如何精確調(diào)控與天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因的表達(dá)。如何把模式菌株如天藍(lán)色鏈霉菌中核糖體工程的作用機(jī)理進(jìn)一步推廣，用于指導(dǎo)臨床用抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，將有廣泛的應(yīng)用前景。微生物基因組測(cè)序揭示了微生物產(chǎn)生抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的巨大生物合成潛力。Ochi和Bachmann作為核糖體工程方面的兩位權(quán)威學(xué)者，其研究[37，41]證明了核糖體工程可以非常有效地激活沉默的生物合成基因簇，而獲得在一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下無(wú)法產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為抗生素的發(fā)現(xiàn)開(kāi)辟了一條新的途徑。其他用于發(fā)現(xiàn)新抗生素的篩選方法也不斷出現(xiàn)，如Ling等[45]利用多通道微生物培養(yǎng)原位培養(yǎng)裝置，成功地從未被培養(yǎng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)了對(duì)多重耐藥菌有優(yōu)異活性的脂肽類小分子teixobactin；Hamamoto等[46]通過(guò)家蠶感染模型，發(fā)現(xiàn)了活性優(yōu)異的脂肽類抗生素lysocin E。因此，如何把這些抗生素篩選方法與核糖體工程結(jié)合，以快速發(fā)現(xiàn)更多新穎的抗生素將值得期待。

致謝：感謝段燕文教授對(duì)本文寫(xiě)作和修改過(guò)程中給予的建設(shè)性意見(jiàn)。

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(本文編輯：熊辛睿)

[收稿日期]2015-09-29

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473123)

[作者簡(jiǎn)介]劉玲(1990-)，女(漢族)，湖南省岳陽(yáng)市人，研究生，主要從事天然產(chǎn)物的生物合成研究。 [通信作者]黃勇E-mail:jonghuang@csu.edu.cn

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.05.019

[中圖分類號(hào)]R978.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-9638(2016)05-0355-06