劉　偉，代應(yīng)貴，袁振興，孫際佳，劉　麗

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，貴陽(yáng)　550025；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州　510642)

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劉偉1，代應(yīng)貴1，袁振興1，孫際佳2，劉麗2

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，貴陽(yáng)550025；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州510642)

摘要：以采自都柳江40尾粗唇(Leiocassis crassilabris)個(gè)體為樣品，采用PCR和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)粗唇都柳江種群Cyt b基因和D-loop序列進(jìn)行了分析。獲得了長(zhǎng)度分別為1 118 bp、776～778 bp的粗唇Cyt b基因、D-loop序列。2段序列的堿基組成均為A+T的含量高于G+C的含量，但Cyt b基因堿基變異率(0.27%)顯著低于D-loop的堿基變異率(3.34%～3.35%)。對(duì)粗唇D-loop序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，識(shí)別了其終止序列區(qū)、中央保守區(qū)和保守序列區(qū)等的特征序列。都柳江粗唇40個(gè)個(gè)體Cyt b基因、D-loop序列中分別有3、20個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別定義了4、10種單倍型。都柳江粗唇種群Cyt b基因和D-loop序列的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)分別為 0.146、0.000 13、0.150和0.404、0.003 17、2.444。都柳江粗唇種群遺傳多樣性較低，開(kāi)展該種魚(yú)類(lèi)種群遺傳多樣性的研究和保護(hù)十分必要。

關(guān)鍵詞：都柳江；粗唇(Leiocassis crassilabris)；線(xiàn)粒體DNA；Cyt b 基因；D-loop；遺傳多樣性

線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速率快、母系遺傳等特點(diǎn)，其中一些基因已被廣泛用于魚(yú)類(lèi)遺傳多樣性和保護(hù)生物學(xué)研究的重要標(biāo)記。Cyt b基因進(jìn)化速率較慢，但易于用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，為mtDNA中結(jié)構(gòu)和功能被了解得最清楚的蛋白質(zhì)編碼基因之一，已被用于魚(yú)類(lèi)種內(nèi)遺傳變異的研究[2-3]。線(xiàn)粒體DNA D-loop，又稱(chēng)線(xiàn)粒體DNA控制區(qū)，為非編碼基因，受自然選擇壓力較小，發(fā)生突變并被保留下來(lái)的可能性大，因此比線(xiàn)粒體其它基因進(jìn)化快，可被用于種內(nèi)遺傳變異的分子標(biāo)記[4]。結(jié)合線(xiàn)粒體DNA Cyt b基因和D-loop 2種分子標(biāo)記方法，可以從不同角度揭示魚(yú)類(lèi)種群遺傳變異及多樣性的特點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.2總DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒，并按照試劑盒提示的操作步驟進(jìn)行總 DNA 的提取。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量和純度，并于-20 ℃保存、備用。

用于擴(kuò)增Cyt b基因、D-loop的引物由上海生物工程有限公司提供并合成，Cyt b基因引物序列分別為L(zhǎng)14724:5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915:5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′；D-loop引物序列分別為D-loop-F:5′-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′和D-loop-R:5′-ATCTTAGCA TCTTCAGTG-3′。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包括2×ExTaqBufffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)的條件參照文獻(xiàn)[9-10]所用條件。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海生物工程有限公司純化及測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物。

1.3數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

表1　都柳江粗唇　種群Cyt b基因的變異位點(diǎn)及單倍型

注:圓點(diǎn)(·)表示與 Hap_1 相同的堿基。表3同。

Cyt b基因中，T、C、A和G 4種堿基的平均含量為29.1%、28.0%、29.7%和13.2%，A+T的含量(58.8%)高于G+C(41.2%)的含量，以G的含量最低(表2)。Cyt b基因密碼子第1位上4種核苷酸使用頻率相差不大；密碼子第2位上T的使用頻率最高(42.6%)，分別為A、G的2倍、3.46倍；密碼子第3位上A的使用頻率最高，以G的最低。

2.2.1D-loop序列的組成

2.2.2D-loop序列的結(jié)構(gòu)

表2　都柳江粗唇　種群線(xiàn)粒體DNA Cyt b基因和D-loop序列堿基組成及變異率

注：ETAS，終止序列區(qū)；CD，中央保守區(qū)。

表3　都柳江粗唇　種群線(xiàn)粒體DNA D-loop的變異位點(diǎn)及單倍型

圖1　都柳江粗唇　種群線(xiàn)粒體DNA D-loop部分序列

表4　都柳江粗唇　種群線(xiàn)粒體DNA Cyt b基因

3討論

致謝：感謝貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室曾智勇教授對(duì)本研究中分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Composition and genetic diversity of mitochondrial DNA Cyt b gene and D-loop sequences in the population of Leiocassis crassilabris from the Duliu River

LIU Wei1,DAI Ying-gui1,YUAN Zhen-xing1,SUN Ji-jia2,LIU Li2

(1.CollegeofAnimalSciences,GuizhouUniversity/SpecialFisheriesResearchInstitute,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;2.CollegeofAnimalSciences,AgriculturalUniversityofSouthChina,Guangzhou510642,China)

Abstract：The sequences of Cyt b gene and D-loop in the species were analyzed using the methods of PCR and DNA sequencing according to the 40 individuals of L.crassilabris respectively from Dushan,Sandu,Rongjiang and Congjiang along the Duliu River.The sequences of 1 118 bp of the Cyt b gene and 776～778 bp of the D-loop were obtained respectively,and the quantity proportion of bases A+T in total bases was higher than that of bases G+C in both of the two sequences but the substitution rate of bases in the sequence of Cyt b gene (0.27%) was obviously less than that of D-loop (3.34%～3.35%) in the population.The characteristic sequences in the extended termination associated sequence,the central conserved domain and the conserved sequence block of D-loop were identified in L.crassilabris.3 and 20 variable loci were detected as well as 4 and 10 haplotypes were defined respectively for the sequences of Cyt b gene and D-loop in the 40 individuals of L.crassilabris from the Duliu River.The haploidtype diversity,nucleotide diversity and average number of nucleotide differences were 0.146,0.000 13,0.150 and 0.404,0.003 17,2.444 respectively on the basis of the sequences of Cyt b gene and D-loop in the population.The population of L.crassilabris had low genetic diversity in the Duliu River now.Therefore,it′s necessary to study and protect the genetic diversity of population of L.crassilabris from the Duliu River.

Key words：Duliu River;Leiocassis crassilabris;mtDNA;Cyt b gene;D-loop;genetic diversity

收稿日期：2015-08-23；

修訂日期：2016-02-19

第一作者簡(jiǎn)介：劉偉(1992-)，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種與種質(zhì)資源學(xué)。E-mail:892913900@qq.com通訊作者：代應(yīng)貴。E-mail:daiygui@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)03-0010-06

資助項(xiàng)目：貴州省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目[黔人項(xiàng)目資助合同(2013)10];國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科技專(zhuān)項(xiàng)(201303048)