楊濯羽，張艷萍，婁忠玉，焦文龍，王　太

(甘肅省水產(chǎn)研究所,甘肅省冷水性魚類種質(zhì)資源與遺傳育種重點實驗室，蘭州　730030)

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基于微衛(wèi)星標記的22個道氏虹鱒選育家系的遺傳多樣性研究

楊濯羽，張艷萍，婁忠玉，焦文龍，王太

(甘肅省水產(chǎn)研究所,甘肅省冷水性魚類種質(zhì)資源與遺傳育種重點實驗室，蘭州730030)

摘要：采用10對微衛(wèi)星標記分析了道氏虹鱒(Oncorhynchus mykiss)22個選育家系的遺傳多樣性及遺傳結構。結果顯示：22個道氏虹鱒家系均具有較高的遺傳多樣性，在9個微衛(wèi)星位點共獲得71個等位基因，平均等位基因數(shù)為7.89；平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.74；平均觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.780和0.771。進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，發(fā)現(xiàn)22個群體在不同位點均發(fā)生了不同程度偏離。計算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)部分家系之間遺傳距離較大。綜合分析，得出22個道氏虹鱒家系中家系8、家系11、家系12、家系21、家系28、家系29遺傳多樣性相對豐富，具有較大的遺傳潛力，可作為下一代繁育親本。研究結果對22個道氏虹鱒家系的人工選育及其合理的推廣應用具有一定的指導意義。

關鍵詞：道氏虹鱒(Oncorhynchus mykiss);微衛(wèi)星;遺傳多樣性;家系選育

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)隸屬鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)大馬哈魚屬(Oncorhynchs)，是一種適應性很強的冷水性經(jīng)濟魚類。為了培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆的優(yōu)良品種，早在20世紀30年代，美國學者道納爾遜就已率先成功選育出優(yōu)質(zhì)道氏虹鱒品系，然而隨著人工選育過程的推進，多年累代養(yǎng)殖所造成的近交繁殖，導致其種質(zhì)在不同程度上發(fā)生退化，使選育群體的遺傳多樣性降低，生產(chǎn)性能衰退，從而選擇效應降低[1]。因此，研究道氏虹鱒遺傳變異顯得尤為重要，根據(jù)其變異情況能夠了解遺傳結構，從而制訂相應的科學措施以保證育種工作順利進行。

微衛(wèi)星標記作為一種新型的分子標記技術，在水生生物領域越來越得到重視，目前已廣泛應用于人工選育的過程。目前國內(nèi)外學者已利用微衛(wèi)星標記對羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[3]、鯉(Cyprinuscarpio)[4]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[5]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)等[6-7]進行了良種選育、遺傳多樣性、指紋圖譜構建等方面的研究；國內(nèi)也有部分學者采用不同的微衛(wèi)星標記對虹鱒的不同養(yǎng)殖群體[8]以及不同品系[9]進行了遺傳結構的探討，但對于道氏虹鱒家系內(nèi)部的遺傳結構研究甚少。

本研究以22個家系的道氏虹鱒為研究對象，采用微衛(wèi)星分子標記，通過10對微衛(wèi)星引物在不同道氏虹鱒家系的擴增情況，得到遺傳參數(shù)，分析判斷不同道氏虹鱒家系的遺傳信息及多樣性，旨在為篩選優(yōu)勢的道氏虹鱒親本提供理論基礎，為制定和優(yōu)化育種方案及探討選育效果提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

22個道氏虹鱒家系均來自甘肅省冷水魚良種繁育場，每個家系隨機選取10尾，剪取尾鰭約0.5 g浸泡于95%乙醇中保存，采用高鹽法提取基因組DNA。

1.2引物設計

參考張艷萍等[10]及Deiner等[11]的微衛(wèi)星分子標記引物，共選取10對引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物信息見表1。

1.3PCR反應體系及程序

PCR反應體系：總體系為13 μL，其中包括6.5 μL含染料的2×TaqPCR Mastermix(TaqDNA Polymerae:0.1 U/Μl;MgCl2:4 mmol/L;dNTPs:0.4 mmol/L)，引物(10 mmol/L)各0.5 μL，0.5 μL DNA模板，其余雙蒸水補足。PCR反應程序為：94 ℃變性3 min；94 ℃變性35 s，對應引物的退火溫度45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；反應結束后在72 ℃再延伸8 min。

1.4PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測

PCR產(chǎn)物在10%變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，產(chǎn)物上樣量為5 μL，DNA Marker(pBR322 DNA/MspI)上樣量為3 μL。電泳條件：電泳緩沖液為1×TBE，電壓200 V，電泳時間3～4 h。電泳完成后，進行硝酸銀染色，最后將膠片平鋪于觀片箱上，拍照記錄。

1.5數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠圖譜上的擴增條帶的位置判斷個體的基因型。采用遺傳學分析軟件Popgen32統(tǒng)計微衛(wèi)星位點上的等位基因數(shù)(Allele number，A)、有效等位基因數(shù)(Effective allele number，Ne)、觀測雜合度(Observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity，He)、遺傳距離(Genetic distance，D)，并用該軟件計算P值進行χ2檢驗估計群體Hardy-Weinberg平衡偏離；用little Programe軟件計算多態(tài)信息含量(Polymorphism Information content，PIC)。

表1　微衛(wèi)星引物信息

2結果

2.1PCR擴增結果

運用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行22個家系的10對微衛(wèi)星分子標記的鑒定，10對微衛(wèi)星分子標記均能較好地擴增出穩(wěn)定、清晰的特異性條帶，片段大小為84～326 bp，其中位點Omy27為單態(tài)性，其余9對均表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性。

2.2群體遺傳結構

使用Popgen32軟件計算9個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標記的等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)，結果如表2所示。22個家系在這9個多態(tài)性較高的基因位點上，共檢測出71個等位基因，各個位點的A為6～12個，平均等位基因數(shù)為7.89個，位點AF352767獲得等位基因數(shù)最多,為12個，AF352746、AF352752及AF352753三個位點的A最少,為6個，Ne在2.417～9.625之間，Ho與He分別在0.587～0.927和0.586～0.896之間，PIC在0.530～0.881，均大于0.5，平均多態(tài)信息含量為0.74。

表2　9個微衛(wèi)星位點的遺傳平衡分析

根據(jù)表3可以得到22個道氏虹鱒家系在不同微衛(wèi)星位點上的遺傳結構，家系29在這9個微衛(wèi)星位點上獲得的等位基因數(shù)目最多為42個，其次為家系28，共獲得38個等位基因，家系1與家系3獲得的等位基因數(shù)最少,為25個。22個家系的平均期望雜合度為0.567～0.978,觀測雜合度最高的為家系11，平均觀測雜合度為0.480～0.712，平均多態(tài)信息含量為0.417～0.666，家系29平均多態(tài)信息含量最高，家系1、家系3、家系4、家系5、家系6、家系10、家系30平均多態(tài)信息含量小于0.5，其余家系多態(tài)信息含量均大于0.5，認為這幾個家系多態(tài)性低于其他幾個家系。

同時由表3可以看出，不同家系在不同位點上獲得的等位基因數(shù)目有所差異。家系28在位點AF352767獲得的等位基因數(shù)目最多,為8個；22個家系中雜合子數(shù)目較多，家系3、家系4、家系9、家系20、家系23在AF352746位點上Ho為1，家系5、家系6、家系8、家系11、家系12、家系20、家系21、家系23、家系25在位點AF352752上Ho為1，家系3、家系11、家系23、家系27、家系28、家系29在AF352753位點上Ho為1，在其余各個位點，也有部分家系觀測雜合度明顯高于期望雜合度，說明雜合子過剩；不同家系在不同位點的平均多態(tài)信息含量也各不相同，家系9、家系28、家系29、家系28、家系29、家系29、家系20、家系6分別在AF352758位點、AF352752位點、AF352753位點、AF352767位點、AF352758位點、OtsG85位點、OtsG3位點、OtsG401位點上多態(tài)信息含量較高。

表3　22個道氏虹鱒家系的遺傳多樣性

續(xù)表3

2.3Hardy-Weinberg平衡檢驗

本實驗各群體在各位點中的P值檢驗結果見表4。這22個家系在這9個位點上都不同程度的偏離H-W平衡位點，在OtsG3位點上，偏離的家系數(shù)量最多，共有11個家系，在AF352746位點上有10個家系偏離H-W平衡，在AF352752位點、AF352753位點、OtsG85位點、OtsG401位點各有5～8個家系偏離H-W平衡，在AF352758位點，除2個家系偏離H-W平衡，其余家系均符合H-W平衡。家系21在這9個位點P值均大于0.05，符合H-W平衡，家系1與家系2僅在1個位點未處于平衡狀態(tài)。

表4　9個微衛(wèi)星位點在道氏虹鱒家系中的Hardy-Weinberg平衡檢驗

續(xù)表4

注：**表示P<0.01;*表示P<0.05

2.4家系之間遺傳分化

使用軟件Popgen32計算了22個家系之間的遺傳距離和遺傳相似指數(shù)，結果見表5，這22個道氏虹鱒家系遺傳相似指數(shù)為0.320～0.790，家系4與家系8的遺傳距離最大為0.898，家系28與家系25遺傳距離最小為0.236。家系20與家系21，家系1與家系30，家系29與家系30，家系29與家系26，家系5與家系28，家系27與家系28，家系27與家系20，家系20與家系21，家系7與家系19，家系10與家系12，家系8與家系9，家系3與家系6，家系4與家系6遺傳相似指數(shù)均大于0.7，這些家系之間遺傳距離較近，分化程度低。家系9與家系3、家系6、家系1遺傳相似指數(shù)分別為0.329，0.337，0.334，遺傳距離較遠，分化程度較高。

表5　22個道氏虹鱒家系遺傳距離與遺傳相似系數(shù)分析結果

續(xù)表5

注：對角線以上為相似性指數(shù)，對角線以下為遺傳距離。

3討論

3.1PCR引物擴增的穩(wěn)定性

微衛(wèi)星選擇的過程中，可以根據(jù)利用GenBank數(shù)據(jù)庫信息或者已發(fā)表的文章，對相同或相近物種的微衛(wèi)星引物進行優(yōu)化設計，從而獲得微衛(wèi)星引物。這是一種較為簡捷有效的途徑，同時利用這種方法獲得的引物得到的擴增產(chǎn)物穩(wěn)定性較高。本研究中所選擇的10對微衛(wèi)星位點，均來自前人的研究，AF352746、AF352752、AF352753、AF352767、AF352758這些微衛(wèi)星位點參考張艷萍等[10]的研究。OtsG85、OtsG3、OtsG83、OtsG401、Omy27這些位點參考Deiner等[11]的研究。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，這些位點均可以獲得清晰明確的條帶，可信性較高，除Omy27位點呈現(xiàn)單態(tài)性，其余各位點均呈現(xiàn)較高的多態(tài)性，在Deiner的研究中發(fā)現(xiàn)，Omy27這一位點呈現(xiàn)出一定的多態(tài)性，探究原因可能是由于其研究對象為俄羅斯河流域的野生虹鱒，而本研究中實驗樣品屬于人工養(yǎng)殖，由于樣品的差別，并未呈現(xiàn)出預期的多態(tài)性。

3.2群體遺傳結構分析

在已進行的微衛(wèi)星DNA作為分子標記的遺傳研究中，認為擴增產(chǎn)物多態(tài)性高低與研究對象本身的遺傳多樣性水平有高度相關[12]。多態(tài)信息含量的高低在一定程度上反映群體的多態(tài)性。根據(jù)Botstein等[13]對多態(tài)信息含量的解釋，認為當某一群體的PIC>0.5具有高度多態(tài)性，當0.25

雜合度反應各群體在幾個位點上的遺傳結構變異程度的高低，群體的平均基因的雜合度即為群體雜合子的頻率，是群體雜合程度的度量單位。群體平均基因雜合度的高低反映了群體遺傳的一致性的程度。平均雜合度越高，則遺傳多樣性越高，該群體遺傳一致性越低；平均雜合度越低，則遺傳多樣性越低，該群體遺傳一致性越高[16]。一般認為，用來評價遺傳變異的微衛(wèi)星標記的平均雜合度范圍應該在0.3～0.8之間，本研究獲得22個家系平均觀測雜合度為0.567～0.978，平均觀測雜合度為0.781，略高于前人研究，一方面說明這些道氏虹鱒家系群體有較豐富的遺傳變異，遺傳多樣性豐富，在該位點上雜合子的個體在生存中相比純合子的個體具有一定的優(yōu)勢，另一方面，雜合子過剩現(xiàn)象也表明所分析群體可能處于不穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)[17]。

3.3Hardy-Weinberg平衡檢驗分析

微衛(wèi)星DNA本身并未受到選擇壓力的影響，在一個理想群體中，各等位基因在群體中的分布頻率應該是穩(wěn)定的[18]。Hardy-Weinberg平衡檢驗對于遺傳結構的分析具有重要意義，進行X2檢驗，根據(jù)P值可以判斷基因型是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。本研究中只有家系21在這9個位點P值均大于0.05，在各個位點均符合H-W平衡，家系1僅在OtsG83位點未處于平衡狀態(tài)，家系2僅在AF352746位點未處于平衡狀態(tài)。其余大部分道氏虹鱒家系都不同程度地偏離H-W平衡位點，這與趙瑩瑩等[9]對6個虹鱒養(yǎng)殖群體的H-W平衡檢驗的結果相似，平衡狀態(tài)的群體較少，處于不穩(wěn)定狀態(tài)的家系較多。這與前面對雜合度的研究相吻合，雜合子過剩，養(yǎng)殖群體處于不穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，表明養(yǎng)殖群體的遺傳多態(tài)性受世代人工選擇的影響較大。

3.4家系之間遺傳分化度量分析

遺傳距離是研究物種遺傳多樣性的基礎，它可以探究不同的種群或種之間的基因差異的程度，并且以某種數(shù)值將其量化，在一定程度上還能夠反映所研究群體的系統(tǒng)進化，被用以描述群體的遺傳結構和品種間的差異[19]。本研究中22個道氏虹鱒家系的遺傳距離研究中，家系20與家系21，家系1與家系30，家系29與家系30，家系29與家系26等家系間遺傳距離較近，分化程度低，從育種的角度進行探討，遺傳距離較小則不適宜作為兩親本，相反群體間的遺傳距離大，群體變異性也越大，選擇的潛力也越大，則群體的遺傳多樣性越豐富。故而在親本的選育過程中，應當選擇遺傳距離較大的家系作為親本，來注入新的基因流。本研究中的22個道氏虹鱒家系在進行下一代選育的過程中，可以選擇這些遺傳距離較遠的親本，從而避免因繁殖親本數(shù)量太少所導致遺傳漂變加劇，進一步防止平均雜合度的降低，物種生長速度和抗病力下降等問題的發(fā)生[20]。

4小結

綜上所述，22個道氏虹鱒家系在9個微衛(wèi)星位點上呈現(xiàn)出不同的遺傳多樣性，綜合多態(tài)信息含量、雜合度、遺傳平衡狀態(tài)以及遺傳距離等方面的因素，認為家系8、家系11、家系12、家系21、家系28、家系29具有較多的等位基因數(shù)，較高的多態(tài)信息含量，在日后的養(yǎng)殖過程中，可以作為家系繁育的親本，同時在育種過程中應當盡量選擇遺傳距離較遠的家系，盡力避免近親繁殖，注重對種質(zhì)資源的保護。

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(責任編輯：張瀟峮)

Genetic diversity of 22 Oncorhynchus mykiss families based on microsatellite analysis

YANG Zhuo-yu,ZHANG Yan-ping,LOU Zhong-yu,JIAO Wen-long,WANG Tai

(GansuKeyLaboratoryofColdWaterFishesGermplasmResourcesandGeneticBreeding,GansuFisheryResearchInstitute,Lanzhou730030,China)

Abstract：Ten microsatellite markers were selected to analyze the genetic diversity and struction of 22 Oncorhynchus mykiss families.The results showed that 22 Oncorhynchus mykiss families had high diversity.There were totally 71 alleles at 9 microsatellite loci,with an average 7.89 per locus.Average PIC was 0.74.Average Ho and He were 0.780 and 0.771.We found that 22 Oncorhynchus mykiss families had different degrees for deviation in different loci by Hardy-Weinberg test.Genetic distance showed several families had large distance.Furthermore,family8,family11,family12,family28 and family 29 had abundant genetic diversity and genetic potencial.They could be used as parent grouper.The result provided guidance for 22 Oncorhynchus mykiss families breeding and utilization.

Key words：Oncorhynchus mykiss;microsatellite;genetic diversity;family selection

收稿日期：2015-09-28；

修訂日期：2016-01-21

第一作者簡介：楊濯羽(1988-)，女，碩士，專業(yè)方向為魚類遺傳育種。E-mail:yzy03523@qq.com通訊作者：張艷萍。E-mail:aqhongqi@qq.com

中圖分類號：S917.4

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)03-0003-07

資助項目：國家自然科學基金(31160529)