楊秀芬,榮 俊,李國攀
(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025;長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所,湖北荊州434025)
黃巧珍
(浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司,浙江 杭州 310000)
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豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達(dá)
楊秀芬,榮 俊,李國攀
(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025;長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所,湖北荊州434025)
黃巧珍
(浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司,浙江 杭州 310000)
[摘要]根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)M基因序列設(shè)計(jì)2對引物,通過PCR擴(kuò)增得到了PRRSV M基因的全長片段和N-末端截短67個氨基酸序列的MNd67基因片段,分別將這些片段插入到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,PCR、酶切及測序鑒定表明,成功構(gòu)建了2種重組表達(dá)質(zhì)粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖誘導(dǎo)其表達(dá),SDS-PAGE電泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67成功表達(dá)分子質(zhì)量為14ku的重組蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未見明顯的表達(dá)蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明已成功表達(dá)截短的PRRSV M蛋白,可為PRRSV診斷抗原和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞]豬生殖與呼吸綜合征病毒;M蛋白;原核表達(dá)
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病,臨床表現(xiàn)主要以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬呼吸困難為特征[1]。我國于1996年發(fā)現(xiàn)該病[2],其后廣泛地流行于全國各地[3],并成為我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中主要疫病之一。2006年以來,我國出現(xiàn)和流行以Nsp2編碼區(qū)缺失30個氨基酸為分子特征的高致病性PRRSV,感染豬群出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4,5]。
PRRSV是動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬、單股正鏈RNA病毒。其基因組全長約15kb,含有9個開放閱讀框(ORFs),ORF1a和ORF1b編碼蛋白聚合酶,ORF2~7 分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[6]。其中M蛋白分子量為18~19ku,為III型跨膜蛋白,且是非糖基化蛋白,由1個3次連續(xù)的疏水性跨膜區(qū)、13~18個氨基酸的胞外區(qū)和81~87個氨基酸的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成[7]。在PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中,M蛋白的氨基酸序列在歐洲型和美洲型毒株之間最為保守,氨基酸同源性為78%~81%[8]。豬在感染PRRSV約10d后,可檢測到針對 M 蛋白的特異性抗體。感染細(xì)胞中的 M 蛋白與 GP5 在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成異源二聚體,這種結(jié)構(gòu)在病毒的組裝和釋放中起重要作用[9]。此外,M 蛋白內(nèi)部可以形成以二硫鍵結(jié)合的同型二聚體,這可能與病毒的感染力有關(guān)[10]。M 蛋白免疫原性較強(qiáng),可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,且是引起細(xì)胞免疫應(yīng)答最強(qiáng)的蛋白[11]。因此,M蛋白在PRRSV血清學(xué)診斷和疫苗開發(fā)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。本研究通過設(shè)計(jì)特異性PCR引物對M蛋白進(jìn)行全基因和截短表達(dá)的研究,使截短的M蛋白在大腸桿菌中獲得表達(dá),以為PRRSV診斷和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1cDNA、質(zhì)粒和試劑
PRRSV cDNA、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存,pMD-18T 載體購自大連寶生物工程有限公司,E.coliDH5α、BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物技術(shù)有限公司,ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司,Trans2K Plus DNA Marker 、ProteinRuler I購自全式金生物技術(shù)有限公司,小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司,抗PRRSV陽性血清由浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司質(zhì)量管理部提供,HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體購自KPL公司,其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。
1.2方法
1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank收錄的PRRSV(AF046869)株M基因序列設(shè)計(jì)引物。引物序列見表1。其中5’-端下劃線部分是附加的酶切位點(diǎn),上游引物為EcoRⅠ,下游引物為XhoⅠ。所有引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
表1 PRRSV M基因引物列表
1.2.2目的基因的PCR擴(kuò)增
以PRRSV cDNA為模板,使用上述引物PCR擴(kuò)增M全序列和MNd67片段。反應(yīng)條件均為:94℃5min;94℃45s,64℃45s,72℃45s,35個循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,并切膠回收并純化目的片段。
1.2.3重組表達(dá)載體的構(gòu)建
純化后的目的片段連接至pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于加有Amp的LB平板上培養(yǎng)。挑取單個菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定,選取陽性轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒連同表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切,回收目的片段與載體片段,在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于加有Kan的平板上培養(yǎng)。挑取單個菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定,選取陽性轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒并做雙酶切鑒定,酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海生工公司測序,構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pET28a-PRRSV M及pET28a-PRRSV MNd67。
1.2.4目的基因的表達(dá)
將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中,其轉(zhuǎn)化菌分別命名為E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M和E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67。挑取單個菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~12h,進(jìn)行菌落PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌株按1%轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng),當(dāng)D600nm值為0.8~1.0時,加入0.6mol/L α-乳糖至終濃度為30mmol/L,誘導(dǎo)5~6h, 離心收集菌體。
1.2.5表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定與Western blot分析
用0.02mol/L pH7.4 PBS重懸菌體并用超聲波破碎,分別收集破碎后的全菌液、上清液及沉淀。取破碎后的全菌液和上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測重組蛋白的表達(dá)情況。對表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot分析,以1∶100稀釋的抗PRRSV陽性血清為一抗,1∶8000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體為二抗,用DAB溶液顯色并觀察結(jié)果。
2結(jié)果與分析
2.1目的基因片段的擴(kuò)增
M:Trans2K Plus DNA Marker;1~2:PRRSVMNd67;3~4:PRRSV M全基因圖1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,發(fā)現(xiàn)在525bp和324bp處有特異性DNA擴(kuò)增條帶(圖1),與理論擴(kuò)增產(chǎn)物長度相符。
2.2重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果
重組質(zhì)粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67分別經(jīng)EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,分別顯示2條帶且與載體和目的片段的大小相符(圖2)。DNA測序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的序列一致,顯示基因序列無堿基的插入與缺失,表明已正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67。
2.3SDS-PAGE與Western blot分析結(jié)果
含有各重組表達(dá)載體的陽性菌經(jīng)α-乳糖誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn),E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未見明顯的蛋白表達(dá)帶,E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67在分子量大小為14ku處可見明顯表達(dá)帶,與預(yù)期大小相符,表達(dá)蛋白少量可溶(圖3)。表達(dá)產(chǎn)物Western blot檢測,未出現(xiàn)明顯雜交條帶。
M:Trans2KPlusDNAMarker;1:pET28a-PRRSVMNd67雙酶切質(zhì)粒;2:pET28a-PRRSVMNd67原始質(zhì)粒;3:pET28a-PRRSVM雙酶切質(zhì)粒;4:pET28a-PRRSVM原始質(zhì)粒圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果1:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVM全菌液;2:pET28a空白菌表達(dá)上清液;3:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67全菌液;4:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67上清液;M:ProteinRulerI圖3 PRRSVM蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析
3討論
膜蛋白的表達(dá)一直是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的難點(diǎn),許多膜蛋白由于疏水性氨基酸含量較高,表達(dá)出來的蛋白錨定在細(xì)胞膜上,從而對膜造成破壞導(dǎo)致細(xì)胞裂解,影響表達(dá)量。M蛋白為III型跨膜蛋白,是PRRSV囊膜基質(zhì)蛋白,其N端含有3個疏水性比較高的跨膜區(qū)域,給其原核表達(dá)帶來不便。從國內(nèi)外的報(bào)道來看,已有多種表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)重組M蛋白,均未獲得理想結(jié)果。有報(bào)道稱對ORF6基因進(jìn)行改造,去除N端疏水區(qū)域后理論上對表達(dá)產(chǎn)物的抗原性不會產(chǎn)生太大影響,并且有利于M蛋白的表達(dá)量的提高。已有的研究成果以及在線跨膜區(qū)預(yù)測軟件和抗原表位預(yù)測軟件顯示M蛋白N端的3個疏水性跨膜區(qū)位于氨基酸序列前100位,幾乎所有抗原表位都位于氨基酸序列后100位[12]。戚亭等[13]去除了M蛋白N端疏水性較強(qiáng)的區(qū)域,表達(dá)了長約290bp PRRSV M融合蛋白,該蛋白仍然能夠與抗PRRSV豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。鄧靜等[14]去除全部的編碼疏水性跨膜區(qū)的核苷酸序列,對M蛋白從第104個氨基酸序列到C-端第4個氨基酸序列擴(kuò)增,截短后的M基因獲得了表達(dá),且表達(dá)的M蛋白部分可溶、部分為包涵體,Western blot檢測有明顯雜交帶。
本研究同時表達(dá)PRRSVM全蛋白和N-端截短67個氨基酸的PRRSV M蛋白。結(jié)果表明,全長的M蛋白誘導(dǎo)后未見明顯表達(dá),N端截短67個氨基酸的M蛋白誘導(dǎo)后表達(dá)了分子質(zhì)量約為14ku的重組蛋白,且SDS-PAGE檢測顯示該重組M蛋白部分可溶,這與鄧靜等的[14]研究結(jié)果相符。但是截短表達(dá)的M蛋白Western blot檢測未見明顯雜交帶,可能解釋的原因一是Western blot使用的一抗血清為PRRSV 多克隆抗血清,未經(jīng)純化,效價(jià)較低;二是M蛋白主要引起機(jī)體的細(xì)胞免疫,而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體的量有限,Western blot不易檢出,這些都有待后續(xù)進(jìn)一步研究。綜上所述,本研究成功表達(dá)了截短的PRRSV M 蛋白,為PRRSV診斷抗原和疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
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[收稿日期]2016-03-03
[作者簡介]楊秀芬(1988-),女,碩士生,研究方向?yàn)榛蚬こ桃呙?。通信作者:榮俊,496281344@qq.com。
[中圖分類號]Q786
[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A
[文章編號]1673-1409(2016)09-0046-04
[引著格式]楊秀芬,榮俊,李國攀,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達(dá)[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版) ,2016,13(9):46~49.