張龍富，姚家美，蔣冬先，洪群英，李 春，趙婧雅，曾海英，侯英勇，張 新.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 0003；.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 0003

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突變特異性免疫組織化學法檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變

張龍富1，姚家美2，蔣冬先2，洪群英1，李 春1，趙婧雅1，曾海英2，侯英勇2，張 新1
1.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海 200032；2.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

［摘要］背景與目的：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突變狀態(tài)是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的重要療效預(yù)測指標。該研究旨在探討突變特異性免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）法檢測NSCLC標本EGFR基因突變的臨床實用價值。方法：同時采用突變特異性IHC法和擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法檢測290例NSCLC患者的EGFR基因突變狀態(tài)，計算突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）；比較ARMS法和突變特異性IHC法檢測EGFR突變的一致性。結(jié)果：以ARMS法檢測結(jié)果為金標準，當染色評分≥1+為陽性時，突變特異性IHC法診斷EGFR基因突變的靈敏度為72.92%，特異度為95.20%，PPV為93.75%，NPV為78.08%。突變特異性IHC法診斷不同類型EGFR基因突變的準確性相差明顯：診斷19外顯子缺失突變的靈敏度只有55.55%，但其特異度在99%以上；當染色評分為1+時，診斷L858R突變的靈敏度為90.27%，特異度為95.86%，當染色評分為2+或3+時，其特異度則為98.63%～100%。突變特異性IHC法與ARMS法檢測結(jié)果有較好的一致性（P＜0.001，Kappa值：0.612～0.864）。突變特異性IHC法能直觀判斷EGFR基因突變細胞豐度。結(jié)論：突變特異性IHC法是EGFR突變分子檢測的有效補充。

［關(guān)鍵詞］非小細胞肺癌；表皮生長因子受體；突變；免疫組織化學

Correspondence to：ZHANG XinE-mail：zhang.xin@zs-hospital.sh.cn

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率和死亡率仍在上升［1］。臨床上約70%的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者首診時已處于中期或晚期，失去了根治的機會，多采用化療、靶向治療為主的綜合治療［2］。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是現(xiàn)階段治療晚期NSCLC最重要的靶向藥物，代表藥物有吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼等。有研究表明，EGFR基因突變狀態(tài)是決定EGFRTKIs療效最重要的預(yù)測因子［3-4］，EGFR基因突變主要位于18～21外顯子，其中發(fā)生在19外顯子上的E746_A750缺失突變和21外顯子上的L858R點突變所占比例最多，可達85%～90%［5-7］。目前檢測EGFR基因突變的方法很多，如直接測序法、擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法、數(shù)字PCR法和液相芯片法等，其中直接測序法和ARMS法應(yīng)用較廣，但這些方法各有優(yōu)缺點。直接測序法可檢測所有的突變分析的區(qū)域，但對樣本要求高，靈敏度低，只能檢測突變豐度即突變拷貝數(shù)百分比大于20%的基因，限制了其在臨床中的應(yīng)用［8］。ARMS法靈敏度可達1%，但僅能檢測已知的EGFR基因突變，且試劑費用昂貴，設(shè)備和技術(shù)要求高。這限制了ARMS法的應(yīng)用，尤其是在基層醫(yī)院的推廣。2009年，Yu等［9］首次合成抗EGFR 19外顯子E746_A750缺失突變抗體和抗L858R點突變抗體，用其對NSCLC標本進行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）法檢測，所得結(jié)果與直接測序法有較好的一致性。但現(xiàn)階段，EGFR基因突變特異性IHC法尚未得到廣泛應(yīng)用，作為經(jīng)濟、快速的EGFR基因突變檢測手段，其診斷價值有待進一步驗證。本研究旨在探討突變特異性IHC法檢測NSCLC標本EGFR基因突變的準確性及其臨床應(yīng)用價值。

1　材料和方法

1.1臨床資料

收集復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院2014年6月—2014年12月確診的NSCLC患者290例，同時用突變特異性IHC法和ARMS法檢測EGFR基因突變。在290例患者中，手術(shù)切除腫瘤標本72例，纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺和淋巴結(jié)穿刺等取得的小活檢標本218例。病例構(gòu)成特征見表1。

表1　入組患者臨床資料Tab. 1　　The clinical characteristics of patients

1.2DNA抽提

所有標本均為4%甲醛溶液固定、石蠟包埋組織；手術(shù)標本的石蠟組織切取4 μm厚切片3～5張，活檢標本的石蠟組織切取切片10張，每個病例同時行常規(guī)H-E染色，并由病理科醫(yī)師鑒定腫瘤細胞的存在。DNA抽提采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒（購自德國Agen公司），實驗步驟依據(jù)說明書。從標本中提取并重懸后的DNA經(jīng)NanoDrop 2000檢測其總量及純度。

1.3ARMS法檢測

采用廈門艾德公司的EGFR基因突變檢測試劑盒（ADx-EGFR基因突變檢測試劑盒），該試劑盒覆蓋了最常見的29種EGFR基因突變。參與反應(yīng)的DNA總量及反應(yīng)條件均根據(jù)該試劑盒說明書要求，最終檢測結(jié)果以ADx-EGFR基因突變檢測試劑盒提供的判讀原則確定標本EGFR基因突變狀態(tài)。

1.4突變特異性抗體IHC法及其結(jié)果判定

切片以二甲苯脫蠟，經(jīng)各級濃度乙醇水化。加入EDTA（pH=9.0）加熱至95 ℃左右，放入切片加熱30 min抗原修復(fù)。放至室溫，滴加5%的正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫溫育15 min，甩去多余液體。根據(jù)組織大小，滴加50～150 μL稀釋倍數(shù)為1∶50的第一抗體［抗E746_A750缺失突變單克隆兔抗體和抗L858R突變單克隆兔抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司］，4 ℃冰箱過夜。而后加生物素標記的第二抗體，室溫下放置1 h，PBS沖洗后滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素液室溫溫育1 h。每張切片加1滴新鮮配制的DAB液顯色10～20 min，用淡蘇木精復(fù)染細胞核30 s，脫水并待切片晾干后采用中性樹脂封片，鏡下觀察。

以腫瘤細胞的細胞膜和（或）細胞質(zhì)著色為基準，根據(jù)切片中陽性細胞染色強度及百分比將表達結(jié)果分為0、1+、2+和3+四個等級。0：無染色或≤10%腫瘤細胞淺染色；1+：＞10%腫瘤細胞淺染色；2+：＞10%腫瘤細胞中度強染色；3+：＞10%腫瘤細胞強染色［9］。本結(jié)果由3位病理科醫(yī)師各自單獨評分，結(jié)果經(jīng)匯總，對有差異的評分經(jīng)復(fù)核商討后得到最終一致結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。以ARMS法為金標準，計算突變特異性IHC法的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）和陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）。EGFR基因突變率的比較采用X2檢驗，突變特異性IHC法和ARMS法檢測EGFR基因突變一致性的比較采用Kappa檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1突變特異性IHC法檢測結(jié)果

在本組290例NSCLC標本中，EGFR特異性IHC法的陽性率為38.62%（112/290），其中染色評分1+為48例（16.55%，48/290），19外顯子E746_ A750缺失突變17例，L858R突變31例；2+為34例（11.72%，34/290），其中19外顯子E746_A750缺失突變10例，L858R突變24例；3+為30例（10.34%，30/290），其中19外顯子E746_A750缺失突變14例，L858R突變16例。不同染色強度對應(yīng)評分見圖1。陽性病例主要表現(xiàn)為腫瘤細胞的細胞膜和細胞質(zhì)染色，間質(zhì)細胞極少染色，提示這兩種抗體較特異性地與腫瘤細胞相關(guān)抗原結(jié)合。

2.2兩種方法檢測EGFR基因突變的陽性率比較

ARMS法檢測EGFR基因突變陽性率為49.65%，優(yōu)于突變特異性IHC法檢測的陽性率（38.62%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012）。而這一差異主要由19外顯子缺失突變陽性率差異所致。ARMS法與突變特異性IHC法檢測19外顯子缺失突變的陽性率分別為24.82%和14.13%，前者顯著高于后者（P=0.002）。而ARMS法和突變特異性IHC法檢測L858R突變的陽性率差異無統(tǒng)計學意義（24.82% vs 24.48%，P=1，圖2）。

圖1　IHC染色結(jié)果Fig. 1　　The staining results of IHC

（×400）

圖2　兩種檢測方法檢出EGFR基因突變率的比較Fig. 2　　The comparison of EGFR gene mutation rates by ARMS and IHC

2.3突變特異性IHC法與ARMS法一致性分析

突變特異性IHC法和ARMS法的一致性分析提示，兩者一致性較好（Kappa值=0.682，P＜0.001，表2）。其中：對19外顯子缺失突變檢測的Kappa值為0.612（P＜0.001，表3）；對L858R突變檢測的Kappa值為0.864（P＜0.001，表4）。

表2　ARMS法與突變特異性IHC法檢測結(jié)果的一致性分析Tab. 2　　Consistency analysis in detecting results between ARMS and mutation specifc IHC

表3　ARMS法與突變特異性IHC法檢測19外顯子缺失突變的一致性分析Tab. 3　　Consistency analysis in detecting exon 19 deletion between ARMS and mutation specifc IHC

表4　ARMS法與突變特異性IHC法檢測L858R突變的一致性分析Tab. 4　　Consistency analysis in detecting L858R mutation between ARMS and mutation specifc IHC

2.4染色強度對突變特異性IHC法診斷準確性的影響

本文以ARMS法檢測結(jié)果為金標準，當以IHC染色評分≥1為陽性時，IHC法診斷EGFR基因突變的靈敏度為72.92%，特異度為95.20%，PPV為93.75%，NPV為78.08%。

突變特異性IHC法對兩種突變類型檢測的準確性相差明顯：診斷19外顯子缺失突變的靈敏度只有55.55%，但其特異度在99%以上；當染色評分為1+時，診斷L858R突變的靈敏度為90.27%，特異度為95.86%，當染色評分為2+或3+時，其特異度則高達98.63%～100%（表5）。

2.5突變特異性IHC法對EGFR突變細胞豐度的判斷

由于IHC法可以直觀地顯示EGFR突變型的腫瘤細胞，并進行計數(shù)，依據(jù)H-E染色也能判斷和計數(shù)選定區(qū)域的所有腫瘤細胞，從而可以計算出EGFR某種突變型腫瘤細胞占總腫瘤細胞的比例，即細胞豐度。在本研究的290例標本中，包括EGFR 19外顯子E746_A750缺失突變和L858R突變，EGFR基因突變細胞豐度都在15%～100%，均值約為84%，中位值為100%，只有10.71%（12/112）的病例EGFR基因突變細胞豐度低于50%。

表5　ARMS法與突變特異性IHC法診斷價值的比較Tab. 5　　Comparison of diagnostic value between mutation specifc IHC and ARMS

3　討論

EGFR-TKIs在我國上市時間較長，包括IPASS、OPTIMAL和First-Signal等多項大型多中心臨床實驗證實，EGFR基因敏感突變的NSCLC患者使用EGFR-TKIs治療的中位無進展生存期顯著優(yōu)于化療，可達8～13個月，因此國內(nèi)外多項指南推薦EGFR-TKIs作為EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC的一線治療，且推薦選用EGFR-TKIs作為一線治療前，均應(yīng)檢測腫瘤EGFR基因突變狀態(tài)［10-13］。然而，國內(nèi)NSCLC病例EGFR基因突變的送檢率只有20%，使很多患者喪失靶向治療的機會［14］，而不檢測EGFR基因突變就盲目使用靶向藥物，又會造成極大的浪費、貽誤化療時機?，F(xiàn)階段EGFR基因突變檢測多采用直接測序法和ARMS法等分子水平檢測，這類方法檢測費用高，儀器設(shè)備及場地要求高，難以在基層醫(yī)院開展，甚至不少三級醫(yī)院也未開展EGFR基因突變檢測，這是我國EGFR基因突變檢測比例很低的重要原因。目前在各級醫(yī)院病理科普遍開展總EGFR基因的IHC檢測，野生型和突變型EGFR基因表達都為陽性，其表達水平不能預(yù)測EGFR-TKIs的療效；而用突變特異性抗體，就能用IHC法識別EGFR基因突變的細胞。EGFR基因突變特異性IHC法較分子水平檢測方法價格低廉，操作簡便、迅速，可在幾乎所有病理實驗室開展。

近年來，國內(nèi)外有數(shù)篇IHC法檢測E746_ A750缺失突變和L858R突變的報道，但他們所報告的檢測靈敏度波動范圍（24%～100%）大，而且有些研究病例數(shù)偏少，有些研究作為金標準的方法欠妥［15-21］。本研究是國內(nèi)外比較ARMS法和突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變病例數(shù)較多的一項研究，旨在探討突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變在我國常規(guī)開展的價值，并指導臨床醫(yī)師合理解讀IHC法檢測結(jié)果，包括IHC法的靈敏度、特異度、可靠性及不同突變類型、不同染色強度的解讀差異。

Yu等［9］于2009年最早報道了制備EGFR基因突變特異性抗體，并驗證這兩種抗體診斷EGFR基因突變的的靈敏度為92%，特異度為99%。實際上以后的類似研究基本上都是用此兩種抗體。但其研究所依據(jù)的“金標準”是第一代直接測序法，現(xiàn)在已經(jīng)明確，第一代測序法本身靈敏度不夠高，特別是對活檢小標本存在較多的假陰性，把該文的結(jié)論推廣到以活檢小標本為主的晚期肺癌檢測顯然欠妥。另外，該研究所使用的E746_A750缺失抗體也存在缺陷，它并不能涵蓋所有的EGFR 19外顯子缺失突變。根據(jù)癌癥體細胞突變目錄（catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC）的統(tǒng)計，EGFR 19外顯子缺失突變包含如E746-A750、E746-T751、L747-T751、L747-A750和L747-S752缺失突變等19種，E746_A750缺失突變約占其中的68%［22］。從原理上就決定了用該抗體檢測所有19外顯子缺失突變的靈敏度不會太高。比較可信的是Brevet等［22］的報道，如果只對E746_A750缺失的病例，IHC法的靈敏度是100%；而對所有19外顯子缺失突變的病例，靈敏度就下降到74.2%，特異度都為98.8%。Jiang等［20］報告按不同染色積分判斷突變特異性IHC法檢測結(jié)果，分值為1+、2+和3+時的陽性率分別為23.08% （24/104）、67.96% （70/103）和100% （48/48），特異度偏低。而王杰等［21］在2015年報道，在40例EGFR突變標本中，IHC法檢出突變的靈敏度僅為40%，這兩項國內(nèi)的研究需考慮其實驗條件和參數(shù)是否還需優(yōu)化。

本研究以ARMS法為金標準，結(jié)果提示以染色評分≥1為陽性時，IHC法檢測L858R突變的靈敏度為90.27%，特異度為95.86%；檢測19外顯子缺失突變的靈敏度為55.55%，特異度為99.28%。本研究比較IHC法和ARMS法，反映EGFR兩種常見敏感突變檢測一致性的Kappa值為0.682（P＜0.01），這個數(shù)值主要是被19外顯子缺失突變所拉低（Kappa值=0.612，P＜0.001），對L858R突變而言，Kappa值高達0.864（P＜0.001）。由上述結(jié)果可見，突變特異IHC法有較高的特異度，但對19外顯子缺失突變的靈敏度則有不足，這與Brevet等［22］的報道比較吻合，而我們的病例數(shù)較多。本研究所使用E746_A750缺失抗體并不能涵蓋所有的19外顯子缺失突變，所以結(jié)果顯示對19外顯子缺失的靈敏度不足。針對這一問題，有研究表明，同時檢測總EGFR表達水平可減少特異性突變假陰性結(jié)果的產(chǎn)生，提高19外顯子缺失突變的靈敏度至82.56%以上［17，20］。隨著研究的深入，相信會開發(fā)出更完善的抗體，從而提高IHC法的靈敏度。

IHC的染色強度也對突變檢測結(jié)果的解讀有重要影響。判斷陽性的標準隨IHC評分的升高，診斷的靈敏度就相應(yīng)下降，特異度相應(yīng)升高。對19外顯子缺失突變而言，評分1+時診斷突變的特異度高達98.5%，這說明IHC的陽性結(jié)果基本上就是真陽性，臨床可以使用EGFRTKIs；但如果是陰性，假陰性的機會較高，有條件時應(yīng)該做核酸檢測。對L858R而言，評分1+時診斷突變的靈敏度和特異度分別為90.27% 和95.86%，準確性較高，只有約10%的病例為假陰性；評分為2+和3+的標本，特異度分別高達98.63%和100%。由此可見，突變特異性IHC法檢測EGFR基因突變具有較好的準確性，尤其當染色評分為強陽性時結(jié)果更加可靠。

另外，EGFR基因突變豐度是影響EGFRTKIs療效的因素之一，Zhou等［23］和Zhao等［24］的研究顯示，EGFR突變豐度的高低與EGFRTKIs療效正相關(guān)。由于采用核酸檢測方法，上述研究檢測的突變豐度實際為腫瘤組織中突變型EGFR拷貝數(shù)占總EGFR拷貝數(shù)的比例，即EGFR基因突變分子豐度。然而，EGFR突變的細胞豐度，即突變型腫瘤細胞占所有腫瘤細胞的比例，暫不能通過簡便的分子檢測得到。突變特異性IHC法可直觀地顯示EGFR突變型的腫瘤細胞并進行計數(shù)，較簡便地計算出EGFR突變細胞豐度，利于臨床醫(yī)生制定個體化的治療方案，研究EGFR基因突變的變化規(guī)律。

綜上所述，突變特異性IHC法具有快速、簡便、經(jīng)濟和易于推廣等優(yōu)勢，與ARMS法有較高的一致性，是ARMS法等核酸水平檢測的有效補充，針對我國核酸檢測廣泛開展存在困難的現(xiàn)狀，值得在基層醫(yī)院推廣；對突變特異性IHC檢測結(jié)果，臨床上要合理解讀；突變特異IHC法對EGFR基因突變細胞豐度的觀察有獨特價值，值得進一步研究。

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Detection of EGFR gene mutations with mutation-specifc immunohistochemistry in non-small cell lung cancer

ZHANG Longfu1，YAO Jiamei2，JIANG Dongxian2，HONG Qunying1，LI Chun1，ZHAO Jingya1，ZENG Haiying2，HOU Yingyong2，ZHANG Xin1（1.Department of Pulmonary Medicine，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China；2.Department of Pathology，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

［Key words］Non-small cell lung cancer；Epidermal growth factor receptor；Mutations；Immunohistochemistry

［Abstract］Background and purpose：Epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation is the most important predictive factor for determining the effectiveness of EGFR tyrosine kinase inhibitors （TKIs） for non-small cell lung cancer （NSCLC）. This study aimed to determine the clinical application value of mutation-specific immunohistochemistry for EGFR mutation detection in NSCLC. Methods：Mutation-specific immunohistochemistry and amplification refractory mutation system （ARMS） were used simultaneously to detect EGFR gene mutation status in 290 lung cancer specimens. The sensitivity，specificity，positive predictive value （PPV） and negative predictive value （NPV） of mutation-specific immunohistochemistry for detecting EGFR gene mutations were evaluated. The consistency was analyzed between mutation-specific immunohistochemistry results and ARMS results. Results：With ARMS testing as the gold standard，when a cutoff value of score 1+ was used as positive by immunohistochemistry，the sensitivity of mutation-specific immunohistochemistry for EGFR gene mutation was 72.92%，specificity 95.20%，positive predictivevalue 93.75% and negative predictive value 78.08%. The accuracy of immunohistochemistry was obviously different when various EGFR gene mutations were detected. The sensitivity of immunohistochemistry for exon 19 deletion was only 55.55%，but specificity was above 99%. When immunohistochemistry score was 1+，the sensitivity for L858R mutation was 90.27%，whereas specificity was 95.86%. When immunohistochemistry score was 2+ or 3+，the specificity for L858R mutation was 98.63%-100%. The results of mutation-specific immunohistochemistry were finely correlated with mutation status determined by ARMS assay （P＜0.001，Kappa value：0.612-0.864）. Mutation-specific immunohistochemistry can directly determine EGFR gene mutation abundance at the cellular level. Conclusion：Mutation-specific immunohistochemistry could be an effective supplemental method to EGFR molecular tests.

DOI：10.3969/j.issn.1007-3969.2016.04.007

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639（2016）04-0326-07

通信作者：張 新 E-mail：zhang.xin@zs-hospital.sh.cn

收稿日期：（2015-12-15修回日期：2016-02-20）