武智勇，劉思岐，齊炳堯，宋廣萍，王春麗，陳志寶（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

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沃尼妙林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14表達(dá)的影響

武智勇，劉思岐，齊炳堯，宋廣萍，王春麗，陳志寶
（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶163319）

摘要：探討沃尼妙林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14表達(dá)的影響。通過(guò)Real-Time PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞TLR4和CD14的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激RAW264.7細(xì)胞后，可導(dǎo)致TLR4和CD14表達(dá)的增高；不同濃度的沃尼妙林預(yù)處理能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的TLR4和CD14的表達(dá)，并且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，沃尼妙林具有抗炎作用，可以明顯改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。

關(guān)鍵詞：沃尼妙林；脂多糖類(lèi)；巨噬細(xì)胞；TLR4；CD14

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌外壁上的主要成分，可與細(xì)胞表面及血漿中的受體相結(jié)合[1-2]。CD14是最早被發(fā)現(xiàn)與LPS結(jié)合最重要、親和力最高的受體[3]。這種受體與LPS結(jié)合后，形成CD14-LPS-LBP的三聯(lián)復(fù)合體，進(jìn)而活化TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)[4]。TLR4在機(jī)體抗感染的免疫炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，是LPS信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的“門(mén)戶蛋白”，由于CD14是通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨固在細(xì)胞膜上，缺乏跨膜結(jié)構(gòu)，需要通過(guò)TLR4將LPS的信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)[5]。兩者協(xié)同作用激活炎性細(xì)胞，合成和釋放多種細(xì)胞因子，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，多器官功能衰竭，甚至死亡[6-7]。

沃尼妙林是新一代廣譜的截短側(cè)耳素類(lèi)半合成抗生素，對(duì)革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌、厭氧菌、支原體以及螺旋體均有效[8]。據(jù)報(bào)道，沃尼妙林對(duì)腸道疾病、急性多關(guān)節(jié)炎、地方性肺炎等有較好的治療效果[9]。同時(shí)，沃尼妙林通過(guò)降低單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌和釋放TNF-α，IL-6等炎性相關(guān)因子，可以有效保護(hù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[10]。但是，很少有通過(guò)研究沃尼妙林與LPS、TLR4、CD14的關(guān)系，來(lái)探索其抑制致炎癥細(xì)胞因子的分泌，從而改善LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的報(bào)道[11-13]。實(shí)驗(yàn)從分子水平和蛋白水平研究沃尼妙林對(duì)LPS上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體TLR4和CD14表達(dá)的影響，進(jìn)而探索沃尼妙林有效保護(hù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

沃尼妙林（Sigma，美國(guó)）；脂多糖（Sigma，美國(guó)）；DMEM/高糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；BCA蛋白定量試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國(guó)）；Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；引物（TLR4、CD14、GAPDH）（捷瑞，上海）；抗體TLR4、CD14（Abcam，英國(guó)）；抗體GAPDH （CST，美國(guó)）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（碧云天，上海）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

按以下分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：

（1）LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14的mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和LPS組，其中LPS終濃度為1 μg·mL-1，并且分別在3、6、12、24、48 h終止培養(yǎng)，提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)[14-15]。

（2）沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

實(shí)驗(yàn)分為4組：①空白對(duì)照組；②LPS組：LPS終濃度為1 μg·mL-1；③LPS+沃尼妙林組：給予終濃度為10 μg·mL-1的沃尼妙林孵育1 h，再加入1 μg·mL-1LPS刺激；④沃尼妙林組：給予終濃度為10 μg·mL-1的沃尼妙林孵育1 h。培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞48 h，分別提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)。

（3）不同濃度的沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

實(shí)驗(yàn)分為5組：①空白對(duì)照組；②LPS組：LPS終濃度為1 μg·mL-1；③④⑤LPS+沃尼妙林組：LPS終濃度為1 μg·mL-1，給予終濃度分別為5 μg·mL-1（低劑量組）、10 μg·mL-1（中劑量組）和25 μg·mL-1（高劑量組）的沃尼妙林進(jìn)行預(yù)處理。沃尼妙林孵育1 h后，再加入1 μg·mL-1LPS刺激，培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞48 h，分別提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)。

1.3方法

1.3.1小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由本室保存。參考李巖等[16]報(bào)道的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素）5%CO2、37℃條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.2Real-Time PCR檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA的表達(dá)

各組細(xì)胞加入相應(yīng)刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，特異性引物對(duì)制備好的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。使用ABI Prism 7 300 SDS Software進(jìn)行分析。引物序列由上海捷瑞生物公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列Table 1Sequences of primers

1.3.3Western Blot檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞TLR4和

CD14蛋白的表達(dá)

各組細(xì)胞加入相應(yīng)刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用預(yù)冷的PBS洗凈殘留培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下并加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞30 min，5 000 r·min-1離心洗滌細(xì)胞2次，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果使用SDS上樣緩沖液進(jìn)行調(diào)樣，沸水浴10 min后離心取上清上樣。進(jìn)行SDSPAGE電泳（5%的濃縮膠和10%的分離膠），轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗CD14、TLR4或GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液37℃孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH條帶的灰度比值來(lái)表示TLR4和CD14蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad prism 5進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），T檢驗(yàn)及各組差異分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)

LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)見(jiàn)圖1和圖2。未受LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞有少量的TLR4和CD14 mRNA的表達(dá)。LPS組（12 h）TLR4 mRNA（P<0.01）和CD14 mRNA（P<0.05）的表達(dá)與空白組相比開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而上升。LPS組（24 h）和LPS組（48 h）TLR4和CD14 mRNA的表達(dá)與空白組相比差異極其明顯（P<0.001）。

圖1　LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)Fig.1Effects of variable time on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

圖2　LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)Fig.2Effects of variable time on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW 264.7 cells

同樣，Western Blot結(jié)果顯示在無(wú)外源性刺激的情況下，RAW 264.7細(xì)胞TLR4和CD14蛋白表達(dá)極低，LPS可以上調(diào)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14蛋白的表達(dá)，并且表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而遞增。

2.2沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4 和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Real-Time PCR結(jié)果顯示，在無(wú)外源性刺激的情況下，RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA表達(dá)極低，單獨(dú)加入沃尼妙林對(duì)其表達(dá)無(wú)顯著影響。LPS可以極其顯著地上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA的表達(dá)（P<0.001）；而在LPS刺激前加入沃尼妙林進(jìn)行預(yù)處理，可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的TLR4 mRNA （P<0.05）和CD14 mRNA（P<0.01）的表達(dá)（見(jiàn)圖3）。

圖3　沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA表達(dá)的影響Fig.3Effects of valnemulin on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

Western Blot結(jié)果顯示，LPS能上調(diào)TLR4和CD14蛋白表達(dá)，而通過(guò)沃尼妙林預(yù)處理能降低LPS誘導(dǎo)的TLR4和CD14蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖4）。

圖4　沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14蛋白表達(dá)的影響Fig.4Effects of Val on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW 264.7 cells

2.3不同濃度沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)

胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

LPS刺激RAW264.7細(xì)胞前給予不同濃度的沃尼妙林進(jìn)行預(yù)處理，各劑量組均能極顯著降低TLR4 和CD14 mRNA的表達(dá)（P<0.001），并且呈現(xiàn)劑量依賴性（見(jiàn)圖5）。

圖5　不同濃度的沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA表達(dá)的影響Fig.5Effects of variable concentrations of valnemulin on expression of TLR4 and CD14 mRNA in LPS induced RAW264.7 cells

Western Blot結(jié)果顯示，LPS刺激前不同濃度沃尼妙林進(jìn)行預(yù)處理，能夠降低LPS誘導(dǎo)的TLR4和CD14蛋白表達(dá)，并且抑制作用隨著沃尼妙林濃度的遞增而增強(qiáng)（見(jiàn)圖6）。

圖6　不同濃度的沃尼妙林對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14蛋白表達(dá)的影響Fig.6　Effects of variable concentration of Val on expression of TLR4 and CD14 protein in LPS induced RAW264.7 cells

3　討論

急性肺損傷是由嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷等因素引起的以炎癥反應(yīng)和肺泡毛細(xì)血管損傷為主要病理改變，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的呼吸困難和頑固性低氧血癥，死亡率較高，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康[17]。內(nèi)毒素是首要致病因素，LPS是內(nèi)毒素的主要成分，它與細(xì)胞結(jié)合后，通過(guò)LPS-LBP-CD14三聯(lián)復(fù)合物作用于TLR4，刺激中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB和MAPKs信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、NO等，導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)生[18-19]。研究顯示，烏司他丁和地塞米松對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷具有保護(hù)作用，均可以通過(guò)抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放，最終達(dá)到阻止炎癥反應(yīng)帶來(lái)的損傷[20-21]。研究報(bào)道，在LPS所致的小鼠急性肺損傷模型中，預(yù)服用沃尼妙林可以顯著抑制NF-κB的活力，抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-6等的分泌，提高抗炎因子IL-10的水平，有效保護(hù)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[22]。

激發(fā)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)的第一步是宿主受體識(shí)別LPS，并通過(guò)CD14和TLR4激活LPS內(nèi)在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而激活NF-kB，而轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化是炎癥反應(yīng)的共同途徑。因此，研究從阻斷病理性信號(hào)傳入入手，以LPS上游信號(hào)通路TLR4和CD14為研究對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)LPS可以使TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯增強(qiáng)。在LPS刺激前對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行沃尼妙林預(yù)處理，可以顯著降低TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表達(dá)量。不同濃度的沃尼妙林處理LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞，結(jié)果顯示沃尼妙林顯著抑制了LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR4和CD14 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

綜上所述，沃尼妙林可以通過(guò)調(diào)控炎性相關(guān)因子和炎性介質(zhì)的影響而起到有效保護(hù)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的作用，可能是由于沃尼妙林有效抑制了LPS信號(hào)通路的上游受體TLR4和CD14的表達(dá)，抑制LPS對(duì)單核巨噬細(xì)胞的活化而導(dǎo)致的。這是對(duì)沃尼妙林的抗炎作用及對(duì)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步補(bǔ)充，對(duì)于臨床上預(yù)防和治療急性肺損傷具有重要意義。

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Effects of Valnemulin on LR4 and CD14 Expression in Lipopolysaccharide-treated RAW264.7 Cells

Wu Zhiyong，Liu Siqi，Qi Bingyao，Song Guangping，Wang Chunli，Chen Zhibao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Abstract:To explore the effect of valnemulin（Val）in this process which LPS induces TLR4 and CD14 expression in RAW264.7 cells.The expression of CD14 and TLR4 was detected by Real-Time PCR and Western Blot cell.After the discovery that LPS stimulated RAW264.7 cells，it might lead to increase TLR4 and CD14 expression.The different concentrations of valnemulin could reduce LPS-induced TL4 and CD14 expression in dose-dependent manner of mRNA and protein levels.The results showed that valnemulin had anti-inflammatory properties on LPS-induced acute lung injury，and could significantly improve the LPS-induced acute lung injury.

Key words：valnemulin;LPS;macrophage cells;TLR4;CD14

中圖分類(lèi)號(hào)：R392

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2090（2016）01-0059-05

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.013

收稿日期：2014-12-10

基金項(xiàng)目：校內(nèi)博士啟動(dòng)基金（XDB2012-14）。

作者簡(jiǎn)介：武智勇（1989-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

通訊作者：陳志寶，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenzhibao_2000@sina.com。