琚幼婷 盧俊 胡衍輝 陳受琳 蔡俊贏 李昌

TRPV1基因的shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和鑒定

琚幼婷 盧俊 胡衍輝 陳受琳 蔡俊贏 李昌

目的 構(gòu)建針對人瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道，子類V，成員1(TRPV1)基因的pSUPERretro-puro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，感染U87-MG細(xì)胞，觀測其沉默TRPV1基因的效果。方法 利用Ambion在線設(shè)計軟件設(shè)計針對人TRPV1基因的shRNA干擾序列，克隆到pSUPERretro-puro載體上。對重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定和酶切分析。用磷酸鈣法制備pSUPERretro-puro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒，將其感染到U87-MG細(xì)胞，經(jīng)嘌呤酶素篩選陽性克隆后采用熒光定量PCR及Western blotting法檢測TRPV1表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)DNA測序和酶切鑒定表明，pSUPERretro-puro TRPV1表達(dá)載體構(gòu)建成功。pSUPERretropuro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染U87-MG細(xì)胞后，細(xì)胞中TRPV1表達(dá)量明顯降低。結(jié)論 成功構(gòu)建了針對人TRPV1基因的pSUPERretro-puro TRPV1表達(dá)載體。pSUPERretro-puro TRPV1能有效下調(diào)TRPV1基因在U87-MG細(xì)胞中的表達(dá)，為將來應(yīng)用其研究TRPV1在利多卡因致細(xì)胞損傷中的作用奠定了基礎(chǔ)。

瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道；利多卡因；逆轉(zhuǎn)錄病毒

瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道蛋白（transient receptor potential ion channel protein,TRP）是細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白。TRP基因家族編碼的蛋白質(zhì)廣泛分布于哺乳動物中。TRP亞類TRPV1是由TRPV1基因編碼的蛋白質(zhì)[1]。1997年，Caterina等成功克隆了TRPV1受體，它由432個氨基酸組成，可以被辣椒素和其他炎性介質(zhì)激活，因而也稱為辣椒素受體。激活TRPV1通道蛋白可使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高從而激活下游的鈣依賴性蛋白激酶，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)的生理功能或介導(dǎo)病理性損傷[2-5]。有研究報道活化的TRPV1可使痛覺感受增強(qiáng)，而TRPV1基因缺失小鼠在炎性介質(zhì)處理后對熱刺激敏感性未見增高，提示TRPV1在痛覺敏感性增強(qiáng)的病理過程中起重要作用[6-7]。局麻藥引起的神經(jīng)毒性損傷常導(dǎo)致病理性疼痛。Leffler等證實利多卡因作用于TRPV1的辣椒素結(jié)合位點并激活TRPV1，使脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高并導(dǎo)致興奮性氨基酸釋放[8-9]，而細(xì)胞內(nèi)鈣超載和興奮性氨基酸過度釋放參與了神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程。因此，TRPV1的持續(xù)激活可能與利多卡因引起的神經(jīng)毒性損傷有關(guān)。RNA干擾技術(shù)（RNAi）可特異地下調(diào)靶基因表達(dá)，是一種簡便的研究基因功能的方法。目前未見有針對人TRPV1基因shRNA干擾載體方面的報道。本研究構(gòu)建了人TRPV1基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pSUPERretro-puro TRPV1，并在U87-MG細(xì)胞中建立TRPV1低表達(dá)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究TRPV1在局麻藥神經(jīng)毒性損傷機(jī)制中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，T4連接酶（日本Takara公司）；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol、Polybrene（美國Sigma公司）；U87-MG細(xì)胞株（上海生物科技有限公司）；兔抗人TRPV1抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（北京博奧森生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 s i R N A靶序列設(shè)計 根據(jù)TR P V 1基因序列（NCBI登錄號為NM_080704）及shRNA設(shè)計原則，使Ambion公司設(shè)計軟件(http：//www.ambion.com/ techlib/misc/siRNA_finder.Html)，設(shè)計針對TRPV1基因編碼區(qū)序列中的3段序列（1574～1594，1004～1024，2815～2835）。序列如下：(1)Sense：5'GATCCCCGCATCTT CTACTTCAACTTCCTTCAAGAGAGGAAGTTGAAGT AGAAGATGCTTTTT 3’Anti-sense：5’AGCTTAAAAA GCATCTTCTACTTCAACTTCCTCTCTTGAAGGAAGT TGAAGTAGAAGATGCGGG 3’(2)Sense：5’GATCCCCG CCTGGAGCTGTTCAAGTTCATTCAAGAGATGAACT TGAACAGCTCCAGGCTTTTT 3’Anti-sense：5’AGCT TAAAAAGCCTGGAGCTGTTCAAGTTCATCTCTTGA ATGAACTTGAACAGCTCCAGGC GGG3’(3)Sense：5’G ATCCCCGCAGACAGCACTGTCAACACTTTCAAGAG AAGTGTTGACAGTGCTGTCTGCTTTTT3’Anti-sense：5’CTTAAAAAGCAGACAGCACTGTCAACACTTCTCTTGAAAGTGTTGACAGTGCTGTCTGCGGG3’劃線部分為TRPV1特異性序列。所有序列經(jīng)使用BLAST和相應(yīng)的人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，排除同源性后提交Invitrogen公司合成。

1.2.2 構(gòu)建pSUPERretro-puro TRPV1表達(dá)載體化學(xué)合成siRNA的正義鏈和反義鏈后，分別取5μL正、反義寡核苷酸(終濃度均為10μmol/L)，5μL10×退火緩沖液，加入35μL去離子水，在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理：95℃ 5 min，85℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，4℃保存。退火處理后得到濃度為10μM的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋500倍，終濃度為20 nM，用于連接反應(yīng)。將退火后的雙鏈siRNA模板和pSUPERretro-puro載體于16℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌種是STBL3，在氨芐青霉素抗性平板上篩選重組質(zhì)粒載體，擴(kuò)增抗性菌落并提取質(zhì)粒，將酶切鑒定初步鑒定的陽性克隆送于華大基因公司測序，測序顯示目的片斷正確插入pSUPERretro-puro表達(dá)載體中。

1.2.3 制備逆轉(zhuǎn)錄病毒和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 pSUPERretropuro TRPV1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體和PIK包裝質(zhì)粒以磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，24 h后收集含病毒上清液的培養(yǎng)基。將對數(shù)期U87-MG細(xì)胞傳代，24 h后開始感染，棄掉待感染細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入5 mL病毒液，并加入poly-brane，每4 h重復(fù)感染1次，共感染4次。感染結(jié)束后加入嘌呤霉素篩選陽性克隆。

1.2.4 熒光定量PCR檢測TRPV1表達(dá) 設(shè)計PCR引物（由Invitrogen公司合成），序列如下：

F：5'AGCTACTACAAGGGCCAGACAG3’

R：5'CTGCAGCAGGAACTTCACGAT3’

提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并將產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增和檢測。反應(yīng)體系為20μL，其中2×Mix SYBR Green I熒光反應(yīng)液10μL，上下游引物各0.25μL，樣品模板1μL，用滅菌水補(bǔ)足20μL體系。反應(yīng)條件95℃ 2 min預(yù)變性，循環(huán)內(nèi)95℃ 30 s變性，60℃退火35 s，PCR反應(yīng)設(shè)置40個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末端點收集熒光信號，繪制擴(kuò)增曲線；40個循環(huán)后設(shè)置反應(yīng)（95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃15 s），并且對60℃～95℃升溫過程進(jìn)行熒光信號收集，繪制融解曲線。

1.2.5 Western blotting檢測TRPV1表達(dá) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用IP裂解液加1%的PMSF蛋白酶抑制劑來裂解蛋白，用BCA法測量蛋白濃度；用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，恒壓100 V轉(zhuǎn)膜1 h，經(jīng)抗體孵育后顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗。光密度值采用完全隨機(jī)單因素方差分析，組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 DNA序列測定結(jié)果表明，各序列已成功插入了質(zhì)粒載體。見圖1。重組質(zhì)粒分別命名為pSUPERretropuro TRPV1(1)，pSUPERretro-puro TRPV1(2)，pSUPERretropuro TRPV1(3)。重組載體shRNA編碼序列與設(shè)計的片段完全一致，表明載體構(gòu)建正確。

圖1 重組載體測序鑒定

2.2 熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞TRPV1 mRNA的表達(dá)熒光定量PCR結(jié)果顯示空載逆轉(zhuǎn)錄病毒對照組細(xì)胞TRPV1表達(dá)相對較高，而pSUPERretro-puro TRPV1(1)、(2)和(3)均能抑制TRPV1 mRNA表達(dá)，其中pSUPERretro-puro TRPV1(1)干擾效果最明顯(P＜0.05)。見圖2。

圖2 檢測TRPV1 mRNA的表達(dá)水平注：1.對照組；2.pSUPERretro-puro TRPV1(1)組；3.pSUPERretro-puro TRPV1(2)組；4.pSUPERretro-puro TRPV1(3)組；與其它組相比，*P＜0.05

2.3 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞TRPV1蛋白的表達(dá) Western blotting檢測顯示pSUPERretro-puro TRPV1(1)組TRPV1蛋白表達(dá)水平明顯低于pSUPERretropuro TRPV1(2)、(3)組和空載逆轉(zhuǎn)錄病毒對照組(P＜0.05)，證明pSUPERretro-puro TRPV1(1)載體可有效抑制TRPV1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。見圖3、圖4。

圖3 Western blotting檢測各組TRPV1蛋白表達(dá)水平注：1.對照組；2.pSUPERretro-puro TRPV1(1)組；3.pSUPERretro-puro TRPV1(2)組;4.pSUPERretro-puro TRPV1(3)組

圖4 各條帶的吸光度值注：1.對照組；2.pSUPERretro-puro TRPV1(1)組；3.pSUPERretro-puro TRPV1(2)組；4.pSUPERretro-puro TRPV1(3)組；與其它組相比，*P＜0.05

3 討論

TRP是一類分布廣泛的陽離子通道蛋白，有超過30個TRP通道家族成員在哺乳動物中先后被克隆。TRPV1是TRPV亞家族第一個被克隆的通道蛋白，其主要表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)的神經(jīng)元中，主要功能是感受傷害性刺激[10-12]。辣椒素分子結(jié)構(gòu)中具有香草醛的類似結(jié)構(gòu)即4-羥基-3-甲氧苯甲基，因此

TRPV1又被稱為香草酸受體亞型1。TRPV1除對辣椒素敏感外，還可被多種因素如花生四烯酸代謝產(chǎn)物、前列腺素、脂質(zhì)過氧化物、細(xì)胞外滲透壓的改變、熱刺激和靜電荷等激活[13-14]。TRPV1激活時可導(dǎo)致鈣、鈉、鎂等陽離子內(nèi)流，但對鈣離子有相對選擇特異性。TRPV1最初在疼痛領(lǐng)域受到關(guān)注，逐漸得到深入研究。Bolcskei[15]等將佛波醇注入小鼠腳掌，觀察到TRPV1基因敲除小鼠不出現(xiàn)痛覺反應(yīng)。Hudenl[16]等研究發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)結(jié)扎引起神經(jīng)源性疼痛導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)TRPV1表達(dá)增加。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1基因敲除小鼠對炎性刺激因子和熱刺激痛敏有明顯的抑制作用，但對化學(xué)致痛物質(zhì)仍表現(xiàn)敏感。而有學(xué)者認(rèn)為TRPV1參與了

TNF-α炎癥反應(yīng)過程[17]。對糖尿病神經(jīng)病性疼痛的研究結(jié)果也表明TRPV1參與了神經(jīng)源性炎癥[18]。這些研究表明，TRPV1通道蛋白在鈣離子內(nèi)流和病理性疼痛的發(fā)生中起重要作用。

局麻藥神經(jīng)毒性反應(yīng)可引起病理性疼痛和運(yùn)動功能障礙等神經(jīng)癥狀，其具體機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能是局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，鈣離子可能通過電壓依賴型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高并可通過鈣誘導(dǎo)的鈣釋放（calcium induced calcium release，CICR）機(jī)制導(dǎo)致鈣超載（即細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞后，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放大量的鈣離子，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度驟升，造成鈣超載）[21]。鈣超載可通過激活鈣依賴性蛋白酶，促進(jìn)氧自由基增多，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。有研究證實利多卡因作用于TRPV1的辣椒素結(jié)合位點并激活TRPV1，使脊髓背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高。綜上所述可以推測，利多卡因可能通過激活TRPV1通道蛋白引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，通過CICR機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

Puljak[23]等在大鼠脊髓處注射2.0%利多卡因，觀察大鼠對疼痛的反應(yīng)并分離背根神經(jīng)節(jié)，結(jié)果大鼠出現(xiàn)痛覺過敏，并發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。有研究[24]提示利多卡因可抑制中性粒細(xì)胞凋亡，并可上調(diào)促炎因子S100A8/9、CRAMP/LL-37的表達(dá)，下調(diào)抗炎因子IL-4、IL-13和Galectin-1的表達(dá)，通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。TRPV1主要參與神經(jīng)組織炎癥過程，而利多卡因的促炎癥反應(yīng)是否與TRPV1通道蛋白有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

通過RNAi技術(shù)使基因沉默主要有2種方式，一種是直接利用合成的siRNA作用于細(xì)胞產(chǎn)生抑制效應(yīng)，另一種是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的shRNA使細(xì)胞內(nèi)Dicer系統(tǒng)激活從而產(chǎn)生效應(yīng)，因此shRNA分子可以長時間干擾目的基因表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞并整合至基因組中，有利于長期穩(wěn)定表達(dá)目的基因片斷。本研究采用pSUPERretro-puro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將針對TRPV1的shRNA片斷插入載體的H1 RNA啟動子后面，構(gòu)建了3個pSUPERretro-puro TRPV1載體，通過轉(zhuǎn)染U87-MG細(xì)胞并經(jīng)熒光定量PCR和Western blotting檢測證實pSUPERretro-puro TRPV1(1)載體可有效抑制TRPV1表達(dá)。

本課題組前期研究采用1、5、10、20和40 mmol/L利多卡因刺激U87-MG細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著利多卡因的濃度增高，細(xì)胞活力的抑制率相應(yīng)增高。本研究發(fā)現(xiàn)10 mmol/L利多卡因?qū)87-MG細(xì)胞活力的抑制率為50%，而細(xì)胞在50%抑制率的狀態(tài)時有利于觀測利多卡因毒性損傷造成的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡等變化。因此，我們利用pSUPERretro-puro TRPV1(1)載體，將其轉(zhuǎn)染U87-MG細(xì)胞后采用10 mmol/L利多卡因處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRVP1基因沉默組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度低于TRVP1正常表達(dá)對照組，TRVP1基因沉默組細(xì)胞線粒體膜電位高于對照組；流式細(xì)胞分析顯示利多卡因處理后TRVP1基因沉默組細(xì)胞凋亡率低于對照組[25]。這些結(jié)果表明，利多卡因可通過TRPV1蛋白通道使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，并可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放更多鈣離子，從而導(dǎo)致線粒體受損、線粒體膜電位下降，這與Qiao等[26]的研究一致，而沉默TRPV1基因可降低利多卡因造成的鈣離子內(nèi)流，并減少細(xì)胞凋亡。Lu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，布比卡因通過干擾氧化磷酸化使線粒體出現(xiàn)能量代謝障礙，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，從而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。所以，局部麻醉藥對細(xì)胞的毒性損傷主要體現(xiàn)在對線粒體的損傷上。本課題組發(fā)現(xiàn)利多卡因可能通過TRPV1通道蛋白途徑介導(dǎo)線粒體損傷。

本實驗成功構(gòu)建了針對人TRPV1基因的shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPERretro-puro TRPV1，將其轉(zhuǎn)染U87-MG細(xì)胞后建立了穩(wěn)定干擾TRPV1表達(dá)的細(xì)胞株，為后續(xù)的實驗研究TRPV1通道蛋白及相關(guān)信號通路在局部麻醉藥所致神經(jīng)毒性中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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Objective To construct a recombinant retroviral vector expressing shRNA targeting human TRPV1 gene and observe its downregulation effect in the U87-MG cell line. Methods The oligonucleotides designed by Ambion on-line CAD software targeting to TRPV1 were cloned into the pSUPERretro RNAi plasmid. The recombinant vector was confirmed by DNA sequencing and enzyme digestion analysis. The pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA retrovirus was prepared by calcium phosphate method and transfected into U87-MG cells. After the screening by purinase, the expression levels of TRPV1 mRNA and protein were detected by fl uorescent quantitation PCR and Western blotting. Results The expression vector pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA was successfully constructed, which was conf i rmed by the DNA sequencing and the enzyme digestion analysis. The pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA retrovirus can down-regulate expression of TRPV1 effectively after transfection in U87-MG cells. Conclusion The pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA expression vector was successfully constructed. The expression of TRPV1 gene was down-regulated effectively in U87-MG cells transfacted with pSUPERretro-puro TRPV1 shRNA, which laid a basis for its application in the research of cell injury induced by lidocaine.

TRP; Lidocaine; Retrovirus

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.32.001

國家自然科學(xué)基金（81260176）

江西 330006 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科 （琚幼婷 盧俊胡衍輝 陳受琳 蔡俊贏 李昌）

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